彭益強(qiáng)，鄧峰，劉宇，劉鵬

（華僑大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)福建省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門(mén) 361021）

富士蘋(píng)果中多酚氧化酶活性的中心必需基團(tuán)與抑制動(dòng)力學(xué)

彭益強(qiáng)，鄧峰，劉宇，劉鵬

（華僑大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)福建省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門(mén) 361021）

以源于蘋(píng)果的多酚氧化酶（PPO）為對(duì)象，選取溴乙酸、乙酰丙酮、N－溴代琥珀酰亞胺、1，4－二硫代蘇糖醇和對(duì)氯汞苯甲酸等具有相對(duì)專(zhuān)一性的氨基酸基團(tuán)修飾劑，研究PPO的酶活性中心必需基團(tuán)，并確定乙醇對(duì)PPO的抑制動(dòng)力學(xué)特性.結(jié)果表明：富士蘋(píng)果中的PPO蛋白結(jié)構(gòu)中酶活性中心必需基團(tuán)有組氨酸的咪唑基、精氨酸的胍基與色氨酸殘基.抑制動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明：乙醇通過(guò)與PPO酶活中心基團(tuán)的結(jié)合抑制PPO酶活性，其對(duì)PPO的半抑制濃度（IC50）為0.14mmol·L－1，抑制類(lèi)型為可逆的競(jìng)爭(zhēng)性抑制.

多酚氧化酶；酶活性中心；必需基團(tuán)；可逆抑制

多酚氧化酶（Polyphenol Oxidase，PPO）是一類(lèi)從細(xì)菌、植物到高等動(dòng)物都廣泛存在的一類(lèi)含銅蛋白.它能催化單酚、二元酚和多元酚到聯(lián)苯酚的羥基化及羥基酚到醌的脫氫反應(yīng)，而醌在植物體內(nèi)能發(fā)生自身聚合或與細(xì)胞內(nèi)的氨基酸和蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生黑色或褐色的聚合物.這種褐色聚合物是果蔬等在加工過(guò)程中產(chǎn)生酶促褐變的主要原因［1-3］，PPO與底物接觸發(fā)生作用，從而使果蔬中的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、營(yíng)養(yǎng)特征發(fā)生改變而降低營(yíng)養(yǎng)價(jià)值［4］.因此，果蔬加工過(guò)程中的保鮮始終是食品加工行業(yè)重要的研究?jī)?nèi)容.在果蔬加工過(guò)程中，底物與氧影響無(wú)法避免，因此抑制PPO的活性就成為加工過(guò)程中控制酶促褐變的極其重要方法［5］.PPO的氧化反應(yīng)特性與其酶活性中心結(jié)構(gòu)及抑制特性有密切關(guān)系.PPO酶學(xué)特性與抑制動(dòng)力學(xué)的研究已有相關(guān)報(bào)道［1，6-8］，但有關(guān)酶活性中心結(jié)構(gòu)與抑制特性的研究尚未見(jiàn)報(bào)道.本文探討蘋(píng)果中多酚氧化酶（PPO）的酶活性中心必需基團(tuán)與抑制作用.

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 材料與試劑

完整無(wú)損傷富士蘋(píng)果一個(gè).溴乙酸（BrAc），乙酰丙酮（Hacac），N－溴代琥珀酰亞胺（NBS），1，4－二硫代蘇糖醇（DTT），對(duì)氯汞苯甲酸（pCMB），乙醇，檸檬酸，三氯乙酸，丙酮，硫酸銨，鄰苯二酚；磷酸鹽緩沖液（由0.05mol·L－1Na2HPO4，0.05mol·L－1KH2PO4配制），磷酸氫二鈉－檸檬酸緩沖液（由0.2 mol·L－1Na2HPO4，0.1mol·L－1檸檬酸配制），NaAc－HAc緩沖液（由0.2mol·L－1HCOONa，0.2 mol·L－1HCOOH配制）.

1.2 蘋(píng)果PPO酶液制備與純化

將洗凈的富士蘋(píng)果于4℃下保溫，去皮后稱(chēng)取80g的果肉，加入200mL預(yù)冷丙酮，用高速組織搗碎機(jī)勻漿2min并用布氏漏斗抽濾；濾餅用80mL冷凍丙酮再次提取抽濾，稱(chēng)得3.45g的白色粉末.將白色粉末冷凍真空干燥24h，可得PPO丙酮粉.稱(chēng)取0.5g的PPO丙酮粉置于500mL燒杯中，加入4℃，0.5mol·L－1，pH＝6.8的預(yù)冷磷酸鹽緩沖溶液250mL攪拌20min，于5 000r·min－1下離心10min，上清液過(guò)濾即為蘋(píng)果PPO粗酶液.量取200mL的PPO粗酶液，加入45.2g硫酸銨粉末至40%飽和，于4℃下放置12h，15 000r·min－1離心15min；收集沉淀，用4℃，pH＝6.8的0.05mol·L－1磷酸鹽緩沖液充分溶解并透析多次，于8 000r·min－1離心15min，可得PPO純化液，使其在4℃下保存待用.

1.3 PPO酶活性中心必需基團(tuán)的測(cè)定

在2mL修飾體系中，取一定量的酶與不同濃度化學(xué)修飾劑于36℃下水浴反應(yīng)5min；取0.5mL修飾后的酶液加入2mL已預(yù)熱的磷酸氫二鈉－檸檬酸緩沖液（pH＝6.4）及0.5mL，0.2mol·L－1鄰苯二酚的測(cè)酶活體系中；反應(yīng)2min后，加入1mL，0.5mol·L－1的三氯乙酸終止反應(yīng)，測(cè)定酶活.

1.4 PPO酶活力測(cè)定

在3mL的反應(yīng)液（含0.2mol·L－1磷酸鹽緩沖液，0.1mol·L－1的鄰苯二酚及初酶液0.2mL）中，于30℃，420nm處連續(xù)跟蹤酶反應(yīng)過(guò)程中的吸光值變化，通過(guò)酶活計(jì)算公式計(jì)算即可得到多酚氧化酶的酶活.酶活力單位（kat）定義：在最適條件下，1s能使1mol底物轉(zhuǎn)化的酶量.

1.5 PPO抑制動(dòng)力學(xué)

取不同濃度的乙醇加入0.05mol·L－1磷酸緩沖液（pH＝6.4）中，在36℃下與一定酶液量反應(yīng)，再轉(zhuǎn)入正常的測(cè)活體系反應(yīng)2min，加入三氯乙酸終止反應(yīng)，測(cè)定酶活，作相對(duì)酶活與乙醇關(guān)系圖，判斷乙醇是否有抑制作用.固定底物鄰苯二酚濃度，在不同濃度乙醇抑制劑下，改變酶的加入量，測(cè)定不同酶量與酶活力的關(guān)系，判斷其為可逆抑制還是不可逆抑制.在正常的測(cè)活體系中，固定酶的濃度，改變底物的濃度，測(cè)定不同濃度乙醇對(duì)酶活力的影響，做Lineweaver－Burk雙倒數(shù)圖，判斷其抑制類(lèi)型［9］.

2 結(jié)果與討論

2.1 蘋(píng)果PPO提取與純化

采用丙酮粉法提取蘋(píng)果PPO，獲得粗酶液，由40%硫酸銨飽和分離后測(cè)得單位體積蛋白量與PPO酶活，獲得純化倍數(shù)為1.7倍的較純的PPO酶液.

2.2 蘋(píng)果PPO酶活性必需基團(tuán)的化學(xué)修飾

選取溴乙酸（BrAc），乙酰丙酮（Hacac），N－溴代琥珀酰亞胺（NBS），1，4－二硫代蘇糖醇（DTT），對(duì)氯汞苯甲酸（pCMB）等對(duì)PPO進(jìn)行分子修飾［1，7］；然后，根據(jù)酶活力的變化確定酶活性必需基團(tuán)［10］.BrAc在偏酸性條件下主要作用于組氨酸（His）的咪唑基；Hacac能特異地與精氨酸（Arg）上的胍基反應(yīng)；N－溴代琥珀西（NBS）在酸性條件下能較專(zhuān)一地修飾色氨酸（Trp）殘基；DTT是蛋白質(zhì)分子中二硫鍵專(zhuān)一性修飾劑之一；pCMB常用于蛋白質(zhì)分子中巰基修飾，在酸性條件下可以專(zhuān)一地修飾巰基.

在36℃下，BrAc和pCMB在pH＝5.8的NaAc－HAc緩沖液，以及Hacac，NBS和DTT分別在pH＝9.0的Tris－HCl緩沖液，pH＝5.4的NaAc－HAc緩沖液和pH＝8.0的Tris－HCL緩沖液中與酶作用.在正常體系中測(cè)定酶的剩余活力，其酶活變化（Δz）與抑制劑濃度（C）關(guān)系曲線如圖1所示.

從圖1（a），（b）中可見(jiàn)：酶被BrAc，Hacac修飾之后，其活性下降至剩余酶活力的20%～30%.說(shuō)明，His的咪唑基和Arg上的胍基對(duì)PPO酶活力有影響，咪唑基與胍基是酶活性必需基團(tuán)，但不位于酶活性中心催化部位.根據(jù)氨基酸特性分類(lèi)可知，組氨酸與精氨酸均屬于帶正電荷的極性氨基酸，而PPO作用底物鄰苯二酚的羥基解離后帶負(fù)電荷.因此，推測(cè)組氨酸與精氨酸應(yīng)位于酶活性中心的底物結(jié)合部位，修飾劑通過(guò)影響其與底物的結(jié)合來(lái)影響酶活力大小.

從圖1（c）可見(jiàn)：酶被NBS修飾后，其酶活力迅速下降，當(dāng)NBS濃度達(dá)到0.14mmol·L－1時(shí)酶幾乎全部失活，說(shuō)明Trp殘基對(duì)酶活性的影響程度更大.因此，Trp殘基是反應(yīng)所必需的基團(tuán)，且位于酶活性中心催化部位，對(duì)酶催化過(guò)程有直接作用.

從圖1（d）可見(jiàn)：隨著DDT的濃度增加，酶活性呈線下降的趨勢(shì)，說(shuō)明由巰基形成的二硫鍵是PPO催化反應(yīng)所必需的一種構(gòu)象.從圖1（e）可見(jiàn)：不論修飾劑的濃度如何，PPO酶活基本不受影響，這說(shuō)明游離的巰基不是PPO酶活性中心所必需的基團(tuán).

綜合以上結(jié)果可知：在PPO酶蛋白中，由巰基形成的二硫鍵在酶活性中心結(jié)構(gòu)起到穩(wěn)定作用，但巰基本身不是以游離態(tài)存在，也未參與PPO酶氧化反應(yīng)過(guò)程，故不是PPO的酶活性中心.

圖1 不同修飾劑對(duì)PPO酶的化學(xué)抑制作用Fig.1 Inhibition of different chemical modifying agents to PPO

2.3 乙醇對(duì)蘋(píng)果PPO抑制機(jī)理研究

取不同濃度的乙醇加入0.05mol·L－1，pH＝6.4的磷酸緩沖液中，在30℃下與酶液反應(yīng)，轉(zhuǎn)入正常的測(cè)活體系反應(yīng)2min后，終止反應(yīng)測(cè)定酶活.酶活變化與抑制劑濃度關(guān)系曲線如圖2所示.從圖2可知：隨著乙醇濃度的增大，酶活力逐漸下降，乙醇對(duì)酶活產(chǎn)生抑制作用，半抑制濃度（酶活下降一半時(shí)的抑制劑濃度）IC50為0.14mmol·L－1.

在測(cè)酶活體系中，固定底物鄰苯二酚的濃度為10mmol·L－1，在各個(gè)不同濃度乙醇條件下，改變酶的加入量，測(cè)定不同濃度乙醇對(duì)蘋(píng)果PPO酶反應(yīng)速度的影響，如圖3所示.從圖3可知：隨著抑制劑濃度的增大，直線的斜率降低.由動(dòng)力學(xué)規(guī)律推知，乙醇對(duì)PPO抑制類(lèi)型為可逆抑制作用.導(dǎo)致酶活力的下降的原因是抑制劑濃度的增加，而不是通過(guò)減少有效酶量.

在正常的測(cè)活體系中，固定酶的濃度，改變底物的濃度，測(cè)定不同濃度乙醇對(duì)酶反應(yīng)速度影響，并做雙倒數(shù)曲線，得共交于縱軸一點(diǎn)的一系列直線，如圖4所示.根據(jù)酶抑制動(dòng)力學(xué)規(guī)律，可推知乙醇對(duì)蘋(píng)果PPO的抑制類(lèi)型為可逆競(jìng)爭(zhēng)性抑制.由此說(shuō)明，乙醇對(duì)PPO的抑制是通過(guò)與底物競(jìng)爭(zhēng)酶活性中心基團(tuán)的方式進(jìn)行.這是因?yàn)橐掖挤肿又械牧u基與PPO作用底物鄰苯二酚分子中的羥基有類(lèi)似的化學(xué)特性，從而在與酶的結(jié)合過(guò)程中，易與底物競(jìng)爭(zhēng)酶活性中心產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制.

圖2 酶活變化與乙醇關(guān)系Fig.2 Relationship between PPO activity and ethanol

圖3 反應(yīng)速度與酶量關(guān)系 Fig.3 Relationship between reaction velocity and enzyme amoun

圖4 可逆抑制類(lèi)型判斷 Fig.4 Judgment of reversible inhibition mode

3 結(jié)論

1）根據(jù)不同化學(xué)修飾劑對(duì)蘋(píng)果中的PPO進(jìn)行修飾反應(yīng)后酶活力變化的結(jié)果，依據(jù)酶活變化與功能域之間關(guān)系規(guī)律，判斷His的咪唑基、Arg的胍基與Trp殘基均是酶活力的必需基團(tuán)，二硫鍵的結(jié)構(gòu)對(duì)維持酶活性中心結(jié)構(gòu)穩(wěn)定有貢獻(xiàn)，但游離的巰基不是PPO的必需基團(tuán).

2）根據(jù)基團(tuán)修飾后對(duì)酶活不同程度影響，進(jìn)一步推測(cè)His與Arg位于酶活性中心的底物結(jié)合部位，而Trp殘基位于酶催化部位，直接參與酶的催化過(guò)程，對(duì)酶活的影響最大.

3）一定濃度的乙醇對(duì)PPO酶活有抑制作用且為可逆的競(jìng)爭(zhēng)性抑制.

研究結(jié)果對(duì)蘋(píng)果等果蔬的深加工過(guò)程中保鮮技術(shù)開(kāi)發(fā)與抑制劑的設(shè)計(jì)及應(yīng)用，提供了酶蛋白結(jié)構(gòu)信息與動(dòng)力學(xué)作用規(guī)律參考.

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Researches on Essential Groups of Enzyme Active Site and Inhibition Kinetics of Polyphenol Oxidase from Fuji Apple

PENG Yi－qiang，DENG Feng，LIU Yu，LIU Peng

（Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Fujian Province University，Huaqiao University，Xiamen 361021，China）

In this paper，chemical modifying agents，such as BrAC，Hacac，NBS，DTT and pCMB，which were relative specific to amino acid groups，were selected to study the essential groups of polyphenol oxidas（PPO）active site and the inhibition kinetics of ethanol to PPO.The result showed that the essential groups of PPO active site，which came from Fuji apple，composed of imidazole of His，guanidinium of Arg and Trp residue.Inhibition kinetics experiment revealed that the ethanol could inhibited PPO activity by combining with the groups from enzyme active site.The IC50was 0.14 mmol·L－1and the inhibition mode was reversible competitive inhibition.

polyphenol oxidase；enzyme active site；essential group；reversible inhibition

陳志賢 英文審校：劉源崗）

S 661.6；Q 946.5

A

1000－5013（2012）01－0051－04

2011－06－22

彭益強(qiáng)（1973－），男，副教授，主要從事酶的工程應(yīng)用與酶學(xué)的研究.E－mail：pyqiang＠hqu.edu.cn.

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)業(yè)資金項(xiàng)目（10HZR12）