馮 潔，倫永志*

（1.大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116622;

2. 大連大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 遼寧省高校生物物理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 遼寧 大連 116622）

人Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制因子抗腫瘤作用研究進(jìn)展

馮 潔1，倫永志2*

（1.大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116622;

2. 大連大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 遼寧省高校生物物理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 遼寧 大連 116622）

圍繞人Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制因子的結(jié)構(gòu)、主要成員及其抗腫瘤作用做一綜述。Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制因子在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮重要的生理作用，具有廣泛的研究和應(yīng)用價(jià)值。它們?cè)诟鞣N腫瘤中有著或高或低的表達(dá)，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，可能成為腫瘤治療的新標(biāo)靶。

Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制因子；結(jié)構(gòu)；抗腫瘤作用

癌癥病變過程中最重要的步驟是腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移，其關(guān)鍵取決于腫瘤細(xì)胞的某種分泌物能夠水解細(xì)胞外基質(zhì)（Extra Cellular Matrix，ECM）和基底膜（Basement Membranem，BM）。腫瘤細(xì)胞先分泌尿激酶型纖溶酶原激活物（urokinase-type Plasminogen Activator，uPA），此激活物為一種絲氨酸蛋白酶，可激活纖溶酶原產(chǎn)生纖溶酶（Plasmin，PLM）；PLM繼而降解ECM，同時(shí)還能激活前基質(zhì)金屬蛋白酶成為基質(zhì)金屬蛋白酶，后者參與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的水解作用；最終ECM與BM被水解，腫瘤細(xì)胞得以擴(kuò)散。因此，絲氨酸蛋白酶抑制劑可以從源頭抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。

絲氨酸蛋白酶抑制因子（Serine Proteinase Inhibitors, Serpin）廣泛存在于各生物體內(nèi)。Serpin在生物體內(nèi)有著很重要的作用，如保護(hù)神經(jīng)作用；對(duì)抗有害生物破壞；吸血昆蟲體內(nèi)的抗凝血作用[1]等。已在細(xì)菌、病毒、真核生物中發(fā)現(xiàn)并鑒定了500多種類型Serpin。Serpin是單肽鏈的球蛋白，各種Serpin有30%左右的同源序列，疏水區(qū)同源性約70%。常見的類型包括Kazal型、Kunitz型、α-巨球蛋白、Bowman-Brik、pacifastin家族等。Kazal型Serpin較為保守，是由Kazal發(fā)現(xiàn)并命名的一種胰蛋白酶抑制因子，主要存在于哺乳動(dòng)物中，目前已發(fā)現(xiàn)100多種，多為小分子多肽，大多能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和活性[1]。越來越多的研究顯示Kazal型Serpin家族某些成員參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移，影響腫瘤細(xì)胞因子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中細(xì)胞因子的表達(dá)，從而成為腫瘤治療的新標(biāo)靶。盡管Kazal型Serpin較為保守，但由于其承受殘酷的進(jìn)化壓力，其活性部位高度易變，導(dǎo)致功能的多樣性且有些抑制劑已喪失原有功能，給研究帶來極大挑戰(zhàn)[2]。

1 結(jié)構(gòu)特征

Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制因子由一個(gè)或多個(gè)保守的Kazal結(jié)構(gòu)域組成，其間由肽段相連。典型的Kazal結(jié)構(gòu)域如圖1。

圖1 Kazal結(jié)構(gòu)域保守序列

如圖1所示，Kazal結(jié)構(gòu)域中的某些氨基酸非常保守，但大部分仍高度可變的。結(jié)構(gòu)域中含有6個(gè)半胱氨酸，第1、5；2、4；3、6之間形成三對(duì)二硫鍵。三對(duì)二硫鍵對(duì)維持抑制因子的抑制活性至關(guān)重要，高溫和二硫蘇糖醇（Dithiothreitol, DTT）作用可使二硫鍵失去抑制活性[1]。無脊椎動(dòng)物中Kazal結(jié)構(gòu)域缺乏特定的二硫鍵而被稱為非典型Kazal結(jié)構(gòu)域。Kazal結(jié)構(gòu)域的二級(jí)結(jié)構(gòu)由一個(gè)螺旋和三個(gè)反向平行的折疊組成，其結(jié)構(gòu)可以看做由A、B、C三個(gè)環(huán)構(gòu)成，其中B環(huán)含有決定抑制特異性的P1位點(diǎn)（如圖1所示）。P1位點(diǎn)位于第二個(gè)半胱氨酸后第二位。P1位點(diǎn)的不同氨基酸決定了Kazal型Serpin抑制不同的蛋白酶[3]。

2 主要成員

Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制因子（Serine Protease Inhibitor kazal type, SPINK）家族與胰腺炎或胰腺癌、肝癌、食管癌等疾病關(guān)系密切。目前已發(fā)現(xiàn)SPINK1、SPINK2、SPINK4、SPINK5、SPINK6、SPINK7等多個(gè)亞族。表1為SPINK家族基因及蛋白特征的介紹，表2是人SPINK家族蛋白在哺乳動(dòng)物中的分布情況及功能的介紹[4]。

表1 SPINK家族基因及蛋白特征

表2 人SPINK家族蛋白在哺乳動(dòng)物中的分布及功能

2.1 SPINK1

SPINK1又稱PST1，分子量為7.5 kb，是Horii A于1987年分析大量遺傳性胰腺炎患者時(shí)發(fā)現(xiàn)的，將其命名為SPINK1。

Bimaljit Sandhu等研究報(bào)道胰腺炎/胰腺癌患者中N34S突變頻率較高[5]，但并非所有此位點(diǎn)突變的人都患有慢性胰腺炎或胰腺癌，推斷N34S在慢性胰腺炎/胰腺癌病發(fā)中可能起重要作用，卻不是最關(guān)鍵的一個(gè)位點(diǎn)，即其可能與其它位點(diǎn)突變共同作用引發(fā)疾病。張敏等[6]證實(shí)了囊性纖維跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)因子(Cystic Fibrosis Transmembrane Conductancere Gulator，CFTR）及SPINK1與慢性胰腺炎及胰腺癌相關(guān)。正常胰腺中CFTR、SPINK1蛋白陽性表達(dá)，陽性率都為100%。部分慢性胰腺炎細(xì)胞或組織中可見CFTR、SPINK1表達(dá)，陽性表達(dá)率分別為50%、55%。胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞中偶見CFTR、SPINK1表達(dá)，陽性表達(dá)率分別為10%、6.7%。結(jié)果顯示CFTR、SPINK1蛋白在慢性胰腺炎和胰腺癌中表達(dá)丟失，這種異?？赡芘c二者發(fā)生發(fā)展有著一定關(guān)系。由于CGTR功能不全，離子分泌障礙，導(dǎo)致分泌液PH值下降。酸性條件下引起組織炎癥損害的同時(shí)，可導(dǎo)致胰酶分泌及激活的異常，使胰腺的纖維化及功能不全。SPINK1蛋白則可能作為一種修飾因子，降低胰腺癌發(fā)病的閾值或與其它基因共同促進(jìn)胰腺癌發(fā)生，也可能由于細(xì)胞癌變使SPINK1表達(dá)發(fā)生變化。

研究發(fā)現(xiàn)部分前列腺癌患者[7]和乳腺癌患者[8]腫瘤組織中SPINK1高度表達(dá)，正常組織中則不存在。利用免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行研究證明，SPINK1可影響乳腺癌腫瘤細(xì)胞的侵襲性：影響它們的增殖，擴(kuò)散和對(duì)藥物的抗性[8]?，F(xiàn)已對(duì)其作用機(jī)制等進(jìn)行研究，希望SPINK1可成為治療前列腺癌、乳腺癌的標(biāo)靶，或用于早期診斷。

2.2 SPINK6

SPINK6又稱EG433180，是2009年復(fù)旦大學(xué)的黃青山教授研究細(xì)小病毒抗腫瘤作用時(shí)發(fā)現(xiàn)的，SPINK6能有效針對(duì)原發(fā)性肝癌中的癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)機(jī)制，起到抑制腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移的作用。其作用原理尚處于實(shí)驗(yàn)觀察、初步探索階段，推測SPINK6可能通過影響抑癌基因p53來抑制腫瘤細(xì)胞惡性增生；或是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附力和運(yùn)動(dòng)能力抑制腫瘤細(xì)胞浸潤、轉(zhuǎn)移。

較新的研究發(fā)現(xiàn)，肝內(nèi)淋巴細(xì)胞中二肽基肽酶I的表達(dá)會(huì)產(chǎn)生顆粒酶B和穿孔素，顆粒酶是外源性的絲氨酸蛋白酶，進(jìn)入靶細(xì)胞可介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。穿孔素可使顆粒酶進(jìn)入靶細(xì)胞，引起靶細(xì)胞凋亡。SPINK6、SPINK9可抑制顆粒酶B和穿孔素。SPINK6、SPINK9在免疫細(xì)胞（如抗原呈遞細(xì)胞、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞等）中表達(dá)，可抵制顆粒酶B的活性；在腫瘤細(xì)胞或病毒性感染的肝病中表達(dá)可使腫瘤細(xì)胞和病毒等被細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞殺死。目前的研究將主要集中在肝淋巴細(xì)胞中顆粒酶B的活性和SPINK6、SPINK9表達(dá)之間存在的關(guān)聯(lián)[9]。

激肽釋放酶（Kallikrein, KLK）相關(guān)的肽酶是一類絲氨酸蛋白酶，Shigemasa K等發(fā)現(xiàn)KLK11在卵巢癌中的過度表達(dá)可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖、擴(kuò)增、轉(zhuǎn)移[10]。最近，Tomasz Kantyka等研究發(fā)現(xiàn)SPINK6可抑制KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK12、KLK13、KLK14，其中對(duì)KLK6活性影響較大，其次是KLK4，但對(duì)KLK1、KLK3、KLK8和KLK11無明顯抑制作用[11]。

2.3 SPINK7

SPINK7也稱ECRG2（Esophageal Carcinoma Related Gene 2, ECRG2），是1998年陸士新等利用mRNA差異顯示技術(shù)，從食管癌腫瘤組織中篩選、克隆所得的基因?；騝DNA全長572 bp，開放閱讀框長258 bp，分子量為9.2 kD[12]。

SPINK7在成人正常食管組織中表達(dá)較高，在食管癌組織及其周邊組織中表達(dá)較低或不表達(dá)。李美寧等研究證明，轉(zhuǎn)染SPINK7表達(dá)蛋白可抑制EC9706細(xì)胞惡性增殖能力，并能部分逆轉(zhuǎn)其惡性表型（停泊－非依賴性），通過Western Blotting檢測發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染ECRG2基因后，p53、p21蛋白表達(dá)升高[13]。實(shí)驗(yàn)證明，DNA損傷后，信號(hào)傳導(dǎo)至p53蛋白，激活p53，延長其半衰期，促進(jìn)p53下游靶基因p21轉(zhuǎn)錄。p21蛋白可與多種Cyclin、Cdk復(fù)合物（如CyclinD1-Cdk4、CyclinE-Cdk2等）結(jié)合，而后可抑制CyclinE-Cdk2、CyclinA-Cdk2的H1激酶活性，使細(xì)胞周期阻滯于G1期，使DNA損傷得以恢復(fù)，減少突變發(fā)生。另外，p21可以結(jié)合到增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen, PCNA)的C端，形成p21-PCNA復(fù)合體，抑制細(xì)胞的過度增殖[14]。

在腫瘤細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染SPINK7 cDNA、金屬硫蛋白（Metallothionein, MT），二者相互作用，調(diào)控相關(guān)的信號(hào)通路，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，并誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡。另外，對(duì)SPINK7基因進(jìn)行篩查發(fā)現(xiàn)，在其3’非編碼區(qū)存在一短小重復(fù)序列，其多態(tài)性與食管癌的易感性有關(guān)[13]。以上的研究證實(shí)了SPINK7與食管癌的發(fā)生密切相關(guān)。

2.4 Maspin

Maspin（Mammary Serine Proteinase Inhibitor）又稱SERPINB5，是1994年Zou等通過消減雜交技術(shù)，從人正常乳腺上皮細(xì)胞中分離出的一種新基因，此基因cDNA全長2584 bp，定位于人染色體18q21.3～q23區(qū)，約1 kb的啟動(dòng)子區(qū)域存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，包括Ets，AP1，HRE及p53一致性結(jié)合位點(diǎn)，p53與p53一致性結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合后可活化Maspin啟動(dòng)子，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄，突變型p53則失去此作用[15,16]。

Maspin對(duì)腫瘤具有抑制作用，包括抑制腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。Liu J等發(fā)現(xiàn)Maspin可增加細(xì)胞對(duì)凋亡刺激的敏感性。此外，Maspin還具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的作用，其在正常和癌變?nèi)橄偕掀ぜ?xì)胞的差異表達(dá)是在轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行調(diào)節(jié)的。乳腺癌腫瘤發(fā)展期Maspin表達(dá)缺失或部分缺失，Maspin啟動(dòng)區(qū)內(nèi)Ets和AP1-DNA結(jié)合的位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄缺失導(dǎo)致Maspin表達(dá)消失或下降；Maspin啟動(dòng)區(qū)異常胞嘧啶甲基化作用和染色質(zhì)凝聚導(dǎo)致Maspin基因表達(dá)沉默[17]。故在多種腫瘤組織中（如乳腺、卵巢、頭部和頸部、胃、結(jié)腸等）Maspin表達(dá)下調(diào)，然而在胰腺癌組織中，卻檢測到Maspin的高表達(dá)，正常組織則相反。Cao D等利用免疫組織化學(xué)和高吞吐率的組織微陣列法進(jìn)行研究，在223例切除胰腺癌腫瘤的外科手術(shù)中，觀察發(fā)現(xiàn)maspin蛋白質(zhì)幾乎都有表達(dá)，只有14例Maspin表達(dá)不明顯。剩余209例中有39例的腫瘤是良性未擴(kuò)散的，170例的腫瘤已經(jīng)擴(kuò)散，擴(kuò)散的病例中maspin的表達(dá)高于未擴(kuò)散的病例[18]。Lockett等認(rèn)為，在胰腺癌與其它癌癥中maspin表達(dá)不一致的這種矛盾與病變部位上皮細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境的不同有關(guān)。Maspin對(duì)上皮微環(huán)境極為敏感，表明其對(duì)上皮細(xì)胞微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)起作用[19]。此外，Lewis等的研究結(jié)果表明，當(dāng)Maspin進(jìn)入癌細(xì)胞的細(xì)胞核時(shí)，腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散能力明顯受限，而當(dāng)Maspin不是在細(xì)胞核中時(shí)，這種能力得到逆轉(zhuǎn)，癌細(xì)胞更容易擴(kuò)散。

3 結(jié)語

Kazal型Serpin是人體內(nèi)很重要抑制因子，近年來多項(xiàng)研究已證明多種Kazal型Serpin可作為腫瘤抑制基因負(fù)向調(diào)控腫瘤細(xì)胞的浸潤、轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)凋亡等過程。盡管目前發(fā)現(xiàn)的某些Kazal型Serpin作用機(jī)制尚不明確，但其仍可作為抑癌基因。腫瘤發(fā)展期各抑制因子表達(dá)的含量變化使其有望成為腫瘤診斷及評(píng)估預(yù)后的標(biāo)志物?？梢酝ㄟ^某些藥物使抑制因子再表達(dá)或是降低含量，來影響腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移。另外，多種Kazal型Serpin存在于正常人體內(nèi)，具有相對(duì)較高的生物安全性，且其多數(shù)分子量小，易于重組表達(dá)或人工合成，有利于對(duì)其進(jìn)行深入研究。

[1] 李新蒼. 克氏原螯蝦Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制因子基因克隆、表達(dá)及功能分析[D]. 山東大學(xué), 2010.

[2] 鄭青亮, 盛清, 張耀洲. Kazal型蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)與功能研究進(jìn)展[J]. 生物工程學(xué)報(bào), 2006, 22(5): 695-700.

[3] LASKOWSKIM Jr, KATO I. Protein inhibitors of proteinases [J]. Annual Review of Biochemistry, 1980, 49(1): 593-626.

[4] 李海深, 曹云, 錢朝南. SPINK家族與人疾病[J]. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床, 2010, 30(5): 550-553.

[5] BIMALJIT S, PATRIK V, ANDREA F G, et al. Presence of SPINK-1 variant alters the course of chronic pancreatitis [J]. Journal of Gastroenterology and Hepatology, 2011, 26(6): 965-969.

[6] 張敏, 王銀萍, 倪勁松, 等. CFTR及SPINK1蛋白在慢性胰腺炎及胰腺癌中的表達(dá)及其意義[J]. 中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué), 2011, 15(10): 1625-1628.

[7] ATEEQ B, TOMLINS S A, LAXMAN B, et al. Therapeutic targeting of SPINK1-positive prostate cancer [J]. Science Translational Medicine, 2011, 3(72): 72ra17.

[8] SOON WW, MILLER LD, BLACK MA, et al. Combined genomic and phenotype screening reveals secretory factor SPINK1 as an invasion and survival factor associated with patient prognosis in breast cancer [J]. EMBO Molecular Medicine, 2011, 3(8): 451-464.

[9] STOUT-DELGADO HW, GETACHEWY, MILLER BC, et al. Intrahepatic lymphocyte expression of dipeptidyl peptidase I-processed granzyme B and perforin induces hepatocyte expression of serine proteinase inhibitor 6 (Serpinb9/SPI-6) [J]. The Journal of Immunology, 2007, 179(10):6561-6567.

[10] SHIGEMASA K, GU L, TANIMOTO H, et al. Human kallikrein gene 11(klk11) mRNA overexpression is associated with poor prognosis in patients with epithelial ovarian cancer [J]. Clinical Cancer Research, 2004, 10(8): 2766-2700.

[11] KANTYKA T, FISCHER J, WU Z, et al. Inhibition of kallikrein-related peptidases by the serine protease inhibitor of Kazal-type6 [J]. Peptides, 2011, 6(32): 1187-1192.

[12] 蘇濤, 劉海玲, 陸士新. 食管癌相關(guān)基因的克隆與鑒定[J]. 中國腫瘤學(xué)雜志, 1998, 20(5): 254-257.

[13] HORIGUCHIA, SUMITOMO M, ASAKUMA J, et al. 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme a reductase inhibitor, fluvastatin, as a novel agent for prophylaxis of renal cancer metastasis [J]. Clinical Cancer Research, 2004, 10(24): 8648-8655.

[14] 李美寧. 食管癌相關(guān)基因2（ECRG2）對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖侵襲的抑制作用及機(jī)制[D]. 山西醫(yī)科大學(xué), 2010.

[15] 劉勝霞. Maspin在胃癌中的作用[J]. 實(shí)用腫瘤學(xué)雜志, 2007, 21(2): 194-196.

[16]KITAJIMA I, SHINOHARA T, BILAKOVICS J, et al. Ablation of transplanted HTLV-1-Tax-transformed tumors in mice by antisense inhibition of NF- kappa B [J]. Science, 1992, 258(5089): 1792-1795.

[17] DOMANN FE, RICE JE, HENDRIX MJ, et al. Epigenetic silencing of maspin gene expression in human breast cancers [J]. International Journal of Cancer, 2000, 85(6):805-810.

[18]CAO D, ZHANG Q, WU LS, et al. Prognostic significance of maspin in pancreatic ductal adenocarcinoma: tissue microarray analysis of 223 surgically resected cases [J]. Modern Pathology, 2007, 20(5):570-578.

[19] LOCKETT J, YIN S, LIX, et al. Tumor suppressive maspin and epithelial homeostasis [J]. Journal of Cellular Biochemistry, 2006, 97(4):651-660.

Progresses in Anti-tumor Effects of Human Kazal-type Serine Protease Inhibitor

FENG Jie1, LUN Yong-zhi2*

(1. College of Life Science and Technology, Dalian University, Dalian 116622, China;
2. Medical College, Liaoning Provincial University Key Laboratory of Biophysics, Dalian University, Dalian 116622, China)

This paper reviews the structures, key members and anti-tumor effects of human Kazal-type serine protease inhibitors. Kazal-type serine protease inhibitors play an important role in physiology, and also have extensive value of research and applications. They have a higher or lower expression levels in different types of tumor, and relate with initiation and development. They may become a new target for oncotherapy.

Kazal-type serine protease inhibitor; structure; anti-tumor effect

Q51

A

1008-2395(2012)03-0048-05

2012-04-13

大連市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2010E13SF138）。

馮潔（1987-），女，碩士研究生。

倫永志（1973-），男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：感染性疾病的分子生物學(xué)。