孫 莉，解 霞，劉 超，王 輝

（大連大學(xué) 醫(yī)學(xué)院, 遼寧 大連 116622）

益智仁對(duì)束縛應(yīng)激致大鼠海馬神經(jīng)元NMDA受體亞基NR2B表達(dá)的調(diào)節(jié)作用

孫 莉，解 霞，劉 超，王 輝

（大連大學(xué) 醫(yī)學(xué)院, 遼寧 大連 116622）

為了研究益智仁對(duì)束縛應(yīng)激致大鼠海馬神經(jīng)元NMDA受體亞基NR2B表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，將30只SD大鼠隨機(jī)等分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組和益智仁治療組。模型對(duì)照組、益智仁治療組大鼠每日束縛1次，連續(xù)3周。益智仁治療組束縛前給予益智仁水提取物灌胃。采用免疫組織化學(xué)方法，觀察益智仁水提取物對(duì)束縛應(yīng)激大鼠海馬神經(jīng)元NMDA受體亞基NR2B表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果顯示NR2B陽性產(chǎn)物呈深棕色或棕褐色，主要沉積在CA1區(qū)和CA3區(qū)錐體細(xì)胞的細(xì)胞膜周邊。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組的NR2B陽性產(chǎn)物明顯增多（P＜0.01）；益智仁治療組與模型對(duì)照組比較，NR2B陽性產(chǎn)物明顯減少（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示益智仁能夠降低束縛應(yīng)激大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)NMDA受體亞基NR2B的表達(dá)。

益智仁；束縛應(yīng)激；大鼠；海馬；NR2B

隨著時(shí)代的進(jìn)步，競爭的激烈，長期慢性心理應(yīng)激導(dǎo)致生理和心理上的異常，產(chǎn)生抑郁、焦慮和創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，引起各種身心疾病[1-3]，已被廣泛關(guān)注。

海馬是應(yīng)激領(lǐng)域研究的一個(gè)重點(diǎn)，是應(yīng)激損傷的重要靶區(qū)。應(yīng)激性海馬神經(jīng)元損傷的重要原因之一是糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的谷氨酸和Ca2+依賴的N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate, NMDA)受體的興奮性作用。有研究顯示：慢性復(fù)合應(yīng)激對(duì)大鼠海馬NMDA受體NR2A，NR2B亞基的表達(dá)增強(qiáng)[4]，慢性應(yīng)激使大鼠海馬NMDA受體NR2AmRNA，NR2BmRNA含量增加，且電針干預(yù)后NR2AmRNA、NR2BmRNA含量有明顯降低等[5]。目前研究提示NMDA受體的變化是應(yīng)激損傷海馬神經(jīng)元機(jī)制的一個(gè)環(huán)節(jié)，采取相應(yīng)手段干預(yù)該環(huán)節(jié)可以緩解應(yīng)激所致的損傷。

目前應(yīng)激機(jī)制的研究較多，但抗應(yīng)激藥物的研究不多，曾有中藥抗應(yīng)激方面的研究報(bào)道[6,7]，但多停留在中藥復(fù)方藥效水平的研究上，天然資源中的單味中藥的抗應(yīng)激研究報(bào)道較少。益智仁是天然的單味中藥，曾有抗衰老[8]、抗過敏性反應(yīng)[9]等研究，但是抗應(yīng)激作用方面的報(bào)道較少。曾有研究發(fā)現(xiàn)中藥益智仁具有體外顯著抑制谷氨酸興奮毒性及誘發(fā)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用[10]，前期研究結(jié)果顯示益智仁對(duì)慢性束縛應(yīng)激大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)、結(jié)構(gòu)損傷具有的調(diào)節(jié)作用[11]以及具有降低束縛應(yīng)激致使大鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)Ca2+濃度升高的調(diào)節(jié)作用[12]。因此，本研究采用慢性束縛應(yīng)激大鼠模型，試圖從慢性束縛應(yīng)激致大鼠海馬神經(jīng)元NMDA受體改變這一環(huán)節(jié)入手，研究益智仁對(duì)慢性束縛應(yīng)激大鼠海馬神經(jīng)元NMDA受體NR2B亞基表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，以探討中藥抗應(yīng)激作用的機(jī)制，為中藥在抗應(yīng)激領(lǐng)域的臨床應(yīng)用奠定一定的理論基礎(chǔ)，并為抗應(yīng)激中藥的研發(fā)開拓出一條新路。

1 對(duì)象與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康SD大鼠30只，雌雄各半，體重180～220 g，隨機(jī)等分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、益智仁治療組。模型對(duì)照組與益智仁治療組大鼠每日束縛1次，每日開始時(shí)間及束縛時(shí)間不同，第1天為4 h，其后每次增加30～60 min，連續(xù)3周。束縛期間禁食水。模型對(duì)照組給予束縛制動(dòng)刺激不給予益智仁灌胃，但束縛前給予等量蒸餾水灌胃；益智仁治療組束縛前給予益智仁水提取物80 mg/kg體重灌胃；正常對(duì)照組不給任何刺激，但以等量蒸餾水灌胃。

1.2 主要試劑與儀器

主要試劑：益智仁水提取物（大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)中藥學(xué)系制備）；SABC免疫組化試劑盒（5%BSA封閉液，二抗羊抗兔，SABC溶液，武漢博士德公司）；DAB顯色試劑盒（武漢博士德公司）；一抗(兔抗鼠)（武漢博士德公司）；4%多聚甲醛（天津市科密歐試劑有限公司）。

主要實(shí)驗(yàn)儀器：BX51TF型熒光顯微鏡（olympus）；全自動(dòng)石蠟切片機(jī)(德國萊卡公司)。

2 方法

三組大鼠分別用10%水合氯醛0.35～0.40 g/kg體重腹腔注射麻醉，先后用冷生理鹽水和4%多聚甲醛主動(dòng)脈灌流固定，繼之剝?nèi)∧X塊在4%多聚甲醛固定過夜，然后乙醇脫水，二甲苯滲透透明，石蠟包埋切片，片厚6μm。按SABC試劑盒說明書的步驟，進(jìn)行免疫組織化學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)步驟簡述如下：切片置37℃烤箱2周后，常規(guī)脫蠟至水，熱修復(fù)抗原，滴加5%BSA封閉液室溫25 min，滴加兔抗鼠NR2B（1：300），4℃過夜,再滴加生物素化山羊抗兔抗體IgG室溫35 min，滴加試劑SABC溶液30 min，DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染，1%鹽酸酒精分化，酒精梯度脫水，二甲苯透明，封片，顯微鏡下觀察。陰性對(duì)照組用一抗稀釋液代替一抗，其余步驟同其他各組。

NR2B陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)：每只大鼠選取相同部位的三張切片，每張切片分別在海馬結(jié)構(gòu)的CA1區(qū)和CA3區(qū)選取三個(gè)互不重疊的視野，200倍光鏡下分別觀察各組海馬結(jié)構(gòu)的CA1區(qū)和CA3區(qū)NR2B表達(dá)陽性細(xì)胞的變化，并運(yùn)用圖像分析軟件測量各個(gè)視野NR2B陽性細(xì)胞的光密度值，計(jì)算每張切片的平均光密度值。

應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用單因素方差分析進(jìn)行組間比較，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。P＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

各組大鼠海馬CA1區(qū)NMDA受體亞基NR2B的表達(dá)結(jié)果(見表1、圖1)

表1 各組大鼠海馬CA1區(qū)NMDA受體亞基NR2B陽性細(xì)胞光密度值比較

各組大鼠海馬CA3區(qū)NMDA受體亞基NR2B的表達(dá)結(jié)果(見表2、圖2)

表2 各組大鼠海馬CA3區(qū)NMDA受體亞基NR2B陽性細(xì)胞光密度值比較

圖1 各組大鼠海馬CA1區(qū)NMDA受體亞基NR2B陽性細(xì)胞表達(dá)×200

圖2 各組大鼠海馬CA3區(qū)NMDA受體亞基NR2B陽性細(xì)胞表達(dá)×200

鏡下觀察，NR2B陽性產(chǎn)物顏色呈深棕色或棕褐色，主要沉積在CA1區(qū)和CA3區(qū)錐體細(xì)胞層的細(xì)胞膜。正常對(duì)照組大鼠的CA1區(qū)（圖1a）和CA3區(qū)（圖2a）錐體細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞膜周邊可見少量深染棕色顆粒狀物質(zhì)，胞質(zhì)淡染；慢性束縛應(yīng)激后，與正常對(duì)照組相比，可見CA1區(qū)（圖1b）和CA3區(qū)（圖2b）錐體細(xì)胞層的細(xì)胞排列紊亂，層數(shù)不清，細(xì)胞膜周邊可見大量深棕色顆粒狀物質(zhì)，NR2B陽性產(chǎn)物明顯增多（P＜0.01）；給予益智仁灌胃治療后，可見CA1區(qū)（圖1c）和CA3區(qū)（圖2c）錐體細(xì)胞較模型對(duì)照組細(xì)胞排列較整齊，細(xì)胞膜周邊僅見少量深棕色顆粒狀物質(zhì)，NR2B陽性產(chǎn)物明顯減少（P＜0.05）。所有陰性對(duì)照組切片均無特異性著色。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：模型對(duì)照組與正常對(duì)照組比較，大鼠海馬CA1區(qū)與CA3區(qū)NMDA受體亞基NR2B表達(dá)明顯增多；益智仁治療組與模型對(duì)照組比較，大鼠海馬CA1區(qū)與CA3區(qū)NMDA受體亞基NR2B表達(dá)明顯減少，但與正常對(duì)照組相比大鼠海馬CA1區(qū)與CA3區(qū)NMDA受體亞基NR2B表達(dá)稍微增多。提示益智仁能夠降低束縛應(yīng)激大鼠海馬CA1區(qū)與CA3區(qū)NMDA受體亞基NR2B的表達(dá)。

4 討論

慢性束縛應(yīng)激使動(dòng)物產(chǎn)生焦慮、抑郁，進(jìn)而引起神經(jīng)系統(tǒng)病變，已被許多研究所證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)采用慢性束縛應(yīng)激動(dòng)物模型，觀察到大鼠海馬神經(jīng)元CA1區(qū)與CA3區(qū)NMDA受體亞基NR2B表達(dá)明顯增多，并通過單味中藥益智仁水提取物灌胃，發(fā)現(xiàn)益智仁對(duì)慢性束縛應(yīng)激致大鼠海馬神經(jīng)元CA1區(qū)與CA3區(qū)NMDA受體亞基NR2B表達(dá)增多具有一定調(diào)節(jié)作用。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，海馬是與認(rèn)知行為功能密切相關(guān)的重要腦區(qū),由于富含糖皮質(zhì)激素（GC）受體，所以應(yīng)激時(shí)，海馬區(qū)極易選擇性地受到高濃度GC的攻擊[13]。應(yīng)激性海馬神經(jīng)元損傷的重要原因之一可能是：應(yīng)激使GC升高，GC與海馬區(qū)GC受體結(jié)合，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞外興奮性氨基酸主要是谷氨酸含量增高[14,15]，激活細(xì)胞膜NMDA受體，促進(jìn)細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流，破壞神經(jīng)元內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)平衡，造成神經(jīng)元內(nèi)Ca2+超載，胞內(nèi)高Ca2+可激活內(nèi)源性酶，產(chǎn)生大量的自由基毒害細(xì)胞，引起細(xì)胞壞死，也導(dǎo)致DNA鏈斷裂，引發(fā)細(xì)胞凋亡[16-18]。所以，NMDA受體是應(yīng)激引起神經(jīng)元損傷的主要介導(dǎo)物質(zhì)。

NMDA受體分為NR1、NR2和NR3亞基，其中NR2又由NR2A，NR2B，NR2C，NR2D亞基組成，NR1是受體通道復(fù)合體基本的功能亞單位，NR2是調(diào)節(jié)亞單位，其中NR2A和NR2B是分布于海馬的主要調(diào)節(jié)亞單位，它們以多種方式構(gòu)成完整的NMDA受體復(fù)合體，對(duì)其活性進(jìn)行調(diào)節(jié)。位于突觸的NMDA受體可起到保護(hù)細(xì)胞的作用，而突觸以外的NMDA受體則激發(fā)細(xì)胞的毒性作用，促進(jìn)細(xì)胞壞死和凋亡，其中NR2A亞基主要表達(dá)于突觸，NR2B亞基主要表達(dá)于突觸以外的部位如胞漿、軸突膜和樹突膜等。所以，NR2A和NR2B分別被認(rèn)為是神經(jīng)元保護(hù)因子和神經(jīng)元壞死因子。因此本研究采用免疫組織化學(xué)反應(yīng)方法，研究益智仁對(duì)慢性束縛應(yīng)激大鼠海馬神經(jīng)元NMDA受體NR2B亞基表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果顯示：模型對(duì)照組與正常對(duì)照組比較，大鼠海馬神經(jīng)元CA1區(qū)與CA3區(qū)NMDA受體亞基NR2B表達(dá)明顯增多，益智仁治療組與模型對(duì)照組比較，能夠降低束縛應(yīng)激大鼠海馬CA1區(qū)與CA3區(qū)NMDA受體亞基NR2B的表達(dá)。已有研究表明：慢性復(fù)合應(yīng)激對(duì)大鼠海馬NMDA受體NR2B亞基的表達(dá)增強(qiáng)[4]，慢性應(yīng)激使大鼠海馬NMDA受體通道開放概率明顯增高，而加味四逆散能明顯降低應(yīng)激性抑郁癥大鼠海馬NMDA受體通道開放概率[19]，也與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。

益智仁為姜科植物益智的干燥成熟果實(shí)，性溫味辛，入脾胃經(jīng)，有溫脾止瀉，攝唾涎，固精縮尿的功效，用于脾寒瀉泄，腹中冷痛，口多唾涎，腎虛遺尿，小便頻數(shù)，遺精白濁。有研究顯示：益智仁有提高小鼠抗疲勞、耐缺氧和耐高溫的能力[20]，以及益智仁對(duì)束縛應(yīng)激大鼠海馬神經(jīng)元損傷有明顯保護(hù)作用[13]，降低束縛應(yīng)激致使大鼠海馬神經(jīng)元Ca2+濃度升高的調(diào)節(jié)作用[14]，說明益智仁具有抗應(yīng)激作用。本研究結(jié)果顯示，慢性束縛應(yīng)激可使大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)NMDA受體亞基NR2B表達(dá)增強(qiáng)，益智仁能降低束縛應(yīng)激大鼠海馬CA1區(qū)和A3區(qū)NMDA受體亞基NR2B的表達(dá)，進(jìn)一步說明益智仁具有抗應(yīng)激作用，并提示NMDA受體可能是其藥理學(xué)作用靶點(diǎn)之一, 并且，有研究發(fā)現(xiàn)，益智仁具有體外顯著抑制谷氨酸興奮毒性及誘發(fā)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用[10]，這也與本研究機(jī)制相吻合，即：應(yīng)激造成海馬神經(jīng)元谷氨酸興奮毒性產(chǎn)生，而使海馬神經(jīng)元NMDA受體亞基NR2B表達(dá)增強(qiáng)，進(jìn)而大鼠體內(nèi)灌注益智仁水提取物使NMDA受體亞基NR2B表達(dá)增強(qiáng)得到明顯降低。所以，調(diào)控海馬神經(jīng)元NMDA 受體的功能狀態(tài)可能是益智仁發(fā)揮抗應(yīng)激效應(yīng)的直接作用機(jī)制之一，但是，益智仁抗應(yīng)激作用的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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Yi Zhi Ren’s Effect on the Expression of NR2B Protein in Restrained Stress Rat Hippocampal Neurons

SUN Li, XIE Xia, LIU Chao, WANG Hui

(Medical College of Dalian University, Dalian 116622, China)

To investigate Yi Zhi Ren’s effect on the expression of NR2B protein in restrained stress rat hippocampal neurons, 30 SDrats were divided averagely and randomly into three groups: normal control group, model control group and Yi Zhi Ren group. In three weeks, the rats in model control group and Yi Zhi Ren group were restrained once every day. The rats in the third group were perused Yi Zhi Ren into stomach before restrained. Immunohistochemical staining for the expression of NR2B protein was performed in rat hippocampal neurons. The positive reaction product of NR2B was stained brown. They mainly deposited in pyramidal cell layer of hippocampal CA1 and CA3 regions. Compared with the normal control groups, the mean optical density (MOD) of NR2B positive reaction product in model control group was significantly increased (P＜0.01). The MODof NR2B positive reaction product in Yi Zhi Ren group was significantly decreased compared with model control group (P＜0.05). These results suggest Yi Zhi Ren may decrease the expression of NR2B protein in rat CA1 and CA3 hippocampal neurons induced by restrained stress.

Yi Zhi Ren; restrained stress; rat; hippocampal; NR2B

R285.5

A

1008-2395(2012)03-0061-04

2012-03-21

2010年大連市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2009E12SF139）。

孫莉（1964-），女，副教授，研究方向：生理學(xué)、行為醫(yī)學(xué)。