董曉宇*，王 蕭，劉 超，劉慶平，馮寶民

（大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116622）

大氣壓冷等離子體提高乙醇轉(zhuǎn)化率的實驗參數(shù)優(yōu)化研究

董曉宇*，王 蕭，劉 超，劉慶平，馮寶民

（大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116622）

以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）為研究對象，研究大氣壓冷等離子體激活釀酒酵母提高乙醇轉(zhuǎn)化率的工藝條件。在單因素實驗基礎(chǔ)上，選取等離子體處理時間、等離子體電源電壓和處理菌液體積為影響因子，以乙醇轉(zhuǎn)化率為響應(yīng)值，應(yīng)用Box-Behnken中心組合實驗建立數(shù)學(xué)模型，進(jìn)行響應(yīng)面分析。結(jié)果表明，大氣壓冷等離子體提高乙醇轉(zhuǎn)化率的最佳實驗參數(shù)為：處理時間1 min，電源電壓24 V，處理菌液體積9 mL。在此條件下，乙醇轉(zhuǎn)化率達(dá)到0.58 g/g，比未處理過的釀酒酵母發(fā)酵葡萄糖生成乙醇的轉(zhuǎn)化率高23.6%。

大氣壓冷等離子體；釀酒酵母；乙醇轉(zhuǎn)化率；響應(yīng)面

隨著世界化石燃料儲備量的日益減少，利用微生物轉(zhuǎn)化生物質(zhì)生產(chǎn)燃料乙醇是解決未來能源短缺的一條重要出路[1]。與傳統(tǒng)化學(xué)法相比，微生物發(fā)酵法制取乙醇具有綠色環(huán)保，充分利用農(nóng)作物廢棄物等優(yōu)點，從而對節(jié)約能源和保護(hù)環(huán)境意義重大。但是在發(fā)酵過程中，由于底物和產(chǎn)物的抑制，引起菌種活力下降，從而導(dǎo)致乙醇轉(zhuǎn)化率降低[2]。因此，如何保持菌種在發(fā)酵中的活力是發(fā)酵工程急需解決的問題之一。

大氣壓冷等離子體是一種新興的綠色生物技術(shù)[2]，其含有多種活性成分，如高能電子、離子、分子、中性原子、激發(fā)態(tài)原子、光子和自由基[3]，同時具有物理活性和化學(xué)活性。由于其具有高活性、安全無污染、操作簡便、費用低等優(yōu)點，近年被廣泛應(yīng)用于微生物領(lǐng)域的消毒滅菌和誘變研究[4,5]。

我們前期研究表明，大氣壓冷等離子體可以促進(jìn)克雷伯氏桿菌生長，從而提高1,3-丙二醇產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度[6]。因此，本文擬將其作為一種提高菌種活力的方法應(yīng)用到乙醇的生物轉(zhuǎn)化中。但是，等離子體放電參數(shù)不同，其成分也各不相同[7]，對生物體產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)也不一樣，如對細(xì)胞的滅活效應(yīng)[8]、誘變效應(yīng)[9]和激活效應(yīng)[10]。因此，本文通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化大氣壓冷等離子體放電的物理參數(shù)，確定提高釀酒酵母乙醇轉(zhuǎn)化率的最佳放電參數(shù)，為實現(xiàn)大氣壓冷等離子體在發(fā)酵過程中的自動控制提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae CGMCC 2.604），購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20 g，蛋白胨20g，酵母粉10 g，固體培養(yǎng)基加入瓊脂20 g，pH＝7.0，滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖160 g，蛋白胨20 g，酵母粉10 g，pH＝7.0，滅菌15 min。

1.2 儀器設(shè)備

GC-14B氣相色譜儀（日本島津公司），SBA-40C測糖儀（山東省科學(xué)院生物研究所），721分光光度計（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 酵母菌培養(yǎng)方法

將斜面保藏的釀酒酵母接種到Y(jié)PD固體培養(yǎng)基進(jìn)行活化培養(yǎng)，30 ℃培養(yǎng)24 h，使用接菌環(huán)取一環(huán)菌接入YPD培養(yǎng)基，30 °C、170 rpm振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，稀釋菌液使其OD600=3.0，用于等離子體誘導(dǎo)。

1.3.2 等離子體誘導(dǎo)過程

本文采用的介質(zhì)阻擋放電（Dielectric Barrier Discharge，DBD）實驗裝置類似先前文獻(xiàn)報道[6]，略加修改，如圖1所示。

圖1 大氣壓介質(zhì)阻擋放電等離子體實驗裝置示意圖

等離子體放電裝置由電源部分和反應(yīng)器部分組成。電源部分由信號發(fā)生器（Peak Tech 4080 Function Generator with Frequency Counter）、放大器和變壓器組成。電源為頻率和電壓連續(xù)可調(diào)的正弦交流電源，最高峰值電壓為20 kV，最高頻率為20 kHz。反應(yīng)器部分由不銹鋼的反應(yīng)腔（20 cm × 20 cm × 20 cm）和尺寸不同的覆有石英介質(zhì)的圓形不銹鋼平板電極組成。上電極直徑45 mm，與高壓電源相連；下電極又稱地電極，直徑60 mm，與不銹鋼腔體接觸并接地。下電極上放置一個直徑為7 cm的培養(yǎng)皿，菌液量3 mL，上電極與菌液表面之間放電間隙3 mm。當(dāng)電壓、頻率及放電間隙適當(dāng)時，電極間氣體可在大氣壓下被擊穿，形成介質(zhì)阻擋放電等離子體。

1.3.3 搖瓶發(fā)酵

將經(jīng)等離子體誘導(dǎo)過的菌液按1%（v/v）的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 °C、170 rpm振蕩培養(yǎng)18 h。

1.4 實驗設(shè)計

1.4.1 單因素實驗

采用單因素實驗考察處理時間（min）、處理電壓（V）以及處理菌液體積（mL）對乙醇轉(zhuǎn)化率的影響。通過單因素實驗確定中心組合實驗的中心點，該中心點一般選擇的是使轉(zhuǎn)化率（g/g）最高的變量值。

（1）處理時間對乙醇轉(zhuǎn)化率的影響

等離子體放電電壓為25 V，處理菌液體積為3 mL，處理時間分別為0、1、2、3、4、5 min。誘導(dǎo)的菌液按照1%的比例接入含16%葡萄糖的YPD培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)。

（2）處理電壓對乙醇轉(zhuǎn)化率的影響

處理時間為上述（1）實驗得到的最佳值，處理菌液體積為3 mL，處理電壓分別為0、22、24、25、26、28、30 V。誘導(dǎo)后的菌液按照1%的比例接入16%葡萄糖的YPD培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)。

（3）處理菌液體積對乙醇轉(zhuǎn)化率的影響

等離子體處理時間和處理電壓均為上述（1）（2）實驗所得到的最佳值，處理菌液體積分別為1、3、5、7、9、11、13 mL。誘導(dǎo)后的菌液按照1%的比例接入16%葡萄糖的YPD培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)。

1.4.2 中心組合實驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，采用三因素中心組合設(shè)計，以等離子體處理時間、等離子體放電電壓和處理菌液體積為主要考察因子，分別以X1、X2、X3表示，并以+1、0、-1分別代表上水平、基準(zhǔn)水平、下水平。

中心組合設(shè)計的統(tǒng)計模型可以應(yīng)用多元二次多項式方程表示：

式中，Y以乙醇轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)。

1.5 分析方法

生物量測定：比色法測定菌液OD值，即721分光光度計在600 nm處吸光度值。

葡萄糖含量測定：SBA-50B生物傳感器進(jìn)行測定。

乙醇含量測定：采用氣相GC-14B型氣相色譜儀內(nèi)標(biāo)法測定。玻璃管填充柱，色譜柱2 m × Ф5 mm，填料為Chromsorb 101，檢測器為FID，柱溫170 °C，汽化室的溫度為200 °C，檢測器的溫度為220 °C，載氣為N2，流速40 mL/min，進(jìn)樣量1 μL。采用無水乙醇和正丁醇做標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中乙醇濃度。

所有數(shù)據(jù)是三次實驗的平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素考察

2.1.1 不同處理時間對釀酒酵母乙醇轉(zhuǎn)化率的影響

大氣壓冷等離子體處理時間對激活釀酒酵母乙醇轉(zhuǎn)化率的影響如圖2所示。從圖中可以看出，不同處理時間的釀酒酵母菌液經(jīng)18 h發(fā)酵后，其乙醇轉(zhuǎn)化率出現(xiàn)不同程度的提高。當(dāng)處理時間是3 min時，釀酒酵母乙醇轉(zhuǎn)化率最高，為0.50 g/g。因此，在后面的單因素實驗中，等離子體激活釀酒酵母的最佳處理時間選擇為3 min。

2.1.2 不同電源電壓對釀酒酵母乙醇轉(zhuǎn)化率的影響

大氣壓冷等離子體不同電源電壓對釀酒酵母乙醇轉(zhuǎn)化率的影響如圖3所示。大氣壓冷等離子體電源電壓分別為0、22、24、25、26、28、30 V，經(jīng)等離子體誘導(dǎo)后的釀酒酵母菌液發(fā)酵培養(yǎng)18 h后，其乙醇轉(zhuǎn)化率各不相同。當(dāng)電源電壓為26 V時，釀酒酵母乙醇轉(zhuǎn)化率最高，為0.53 g/g。因此等離子體激活釀酒酵母的最佳放電電壓為26 V。

2.1.3 不同體積菌液對釀酒酵母乙醇轉(zhuǎn)化率的影響

大氣壓冷等離子體處理不同體積的釀酒酵母菌液發(fā)酵培養(yǎng)18 h后，菌液體積對乙醇轉(zhuǎn)化率的影響如圖4所示。從圖中可以看出，當(dāng)處理菌液體積為5 mL時，釀酒酵母乙醇轉(zhuǎn)化率最高，為0.52 g/g。因此等離子體激活釀酒酵母的最佳菌液體積為5 mL。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化

2.2.1 中心組合實驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，以處理時間3 min，處理電壓26 V，處理菌液量5 mL作為中心點，將其設(shè)置為0，進(jìn)行三因素三水平的實驗設(shè)計，共20組實驗，變量水平設(shè)定見表，實驗設(shè)計及結(jié)果見表1。

圖2 不同處理時間對釀酒酵母乙醇轉(zhuǎn)化率的影響

圖3 不同處理電壓對釀酒酵母乙醇轉(zhuǎn)化率的影響

圖4 不同菌液體積對釀酒酵母乙醇轉(zhuǎn)化率的影響

表1 中心組合實驗變量水平設(shè)定

運用Design expert 7.0.1.0軟件設(shè)計實驗組合，如表2所示，按照表中組合進(jìn)行實驗，結(jié)果以乙醇轉(zhuǎn)化率形式呈現(xiàn)于表2。

表2 中心組合設(shè)計及結(jié)果

表3 響應(yīng)面分析法實驗回歸分析的結(jié)果

對表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項式擬合，獲得處理時間、處理電壓、處理菌液體積對乙醇轉(zhuǎn)化率的二階回歸方程：

式中Y為乙醇轉(zhuǎn)化率（g/g）的預(yù)測值，X1、X2、X3為處理時間、處理電壓、處理菌液體積3個變量的編碼值。對該方程進(jìn)行方差分析得知，該模型極顯著（P＜0.0001），模型的校正系數(shù)為0.8297，說明該模型能解釋82.97%響應(yīng)值的變化，復(fù)相關(guān)系數(shù)為0.6751說明該模型的擬合度較好，實驗誤差較小，可用此模型對等離子體激活酵母發(fā)酵的實驗參數(shù)進(jìn)行分析和預(yù)測。

圖5表示處理時間和處理電壓對乙醇轉(zhuǎn)化率的影響。圖5（a）表示當(dāng)處理菌液體積確定，處理時間在1 min左右，處理電壓在23～25 V之間時，等離子體激活釀酒酵母發(fā)酵葡萄糖生成乙醇的轉(zhuǎn)化率最大；從圖5（b）中可以看出當(dāng)處理電壓一定時，處理時間增長，乙醇轉(zhuǎn)化率降低，當(dāng)處理時間一定時，處理電壓低于23 V時，處理電壓減弱，乙醇轉(zhuǎn)化率降低，處理電壓高于25 V時，處理電壓增強(qiáng)，乙醇轉(zhuǎn)化率降低。

圖6表示處理時間和處理菌液體積對乙醇轉(zhuǎn)化率的影響。圖6（a）表示當(dāng)處理電壓確定，處理時間1 min左右，處理菌液體積9 mL左右時，等離子體激活釀酒酵母發(fā)酵葡萄糖生成乙醇的轉(zhuǎn)化率最大；由圖6（b）等高線圖可以看出，乙醇轉(zhuǎn)化率隨著處理時間的增長以及處理菌液體積的減少而降低。

圖7表示處理電壓和處理菌液體積對乙醇轉(zhuǎn)化率的影響。圖7（a）當(dāng)處理時間確定，處理電壓在22～24 V，處理菌液體積在9 mL左右時，等離子體激活釀酒酵母發(fā)酵葡萄糖生成乙醇的轉(zhuǎn)化率最大；圖7（b）表示，當(dāng)處理電壓一定時，乙醇轉(zhuǎn)化率隨處理菌液體積的減少而降低，當(dāng)處理菌液體積一定時，乙醇轉(zhuǎn)化率隨處理電壓的升高而降低。

由響應(yīng)面的三維立體圖和響應(yīng)面的等高線圖可以看出三因素對乙醇轉(zhuǎn)化率的影響都比較顯著，每兩個因素之間都存在較明顯的交互作用。

根據(jù)Design expert 7.0.1.0軟件對數(shù)據(jù)的整理得出，當(dāng)處理時間為1 min，處理電壓為23.4 V，處理菌液體積為9 mL時，等離子體激活釀酒酵母發(fā)酵葡萄糖生成乙醇的轉(zhuǎn)化率最高，為0.57 g/g?？紤]到實際操作，確定最適方案為：處理時間為1 min，處理電壓為24 V，處理菌液體積為9 mL。

圖5 等離子體處理時間與處理電壓交互作用對乙醇轉(zhuǎn)化率的影響

圖6 等離子體處理時間與處理菌液體積交互作用對乙醇轉(zhuǎn)化率的影響

圖7 等離子體處理電壓與處理菌液體積交互作用對乙醇轉(zhuǎn)化率的影響

2.2.2 搖瓶驗證實驗

為了確定建立的模型與實驗結(jié)果的相符程度，通過進(jìn)一步的搖瓶實驗對模型適用度進(jìn)行驗證。驗證實驗中，各因素取值分別為：處理電壓為24 V，處理菌液體積為9 mL，處理時間為1 min。等離子體激活釀酒酵母的其它參數(shù)相同，進(jìn)行搖瓶實驗，三次實驗乙醇轉(zhuǎn)化率的平均值為0.58 g/g。處理時間為1 min時，實驗結(jié)果與模型計算值相差2.05%，如圖8，說明模型是比較可靠的。該實驗證明用響應(yīng)面法來優(yōu)化等離子體提高乙醇轉(zhuǎn)化率的實驗參數(shù)是可行的。

圖8 搖瓶驗證實驗

隨著能源資源的缺乏，微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)生物質(zhì)能源日益受到推崇。但是，在發(fā)酵過程中菌種活力下降仍是該領(lǐng)域急需解決的問題之一。為了提高微生物發(fā)酵目標(biāo)產(chǎn)物濃度，研究人員采用不同方法來提高菌種活力，如誘變篩選高產(chǎn)乙醇的菌株[11]，構(gòu)建基因工程菌[12]，以及人工代謝調(diào)控微生物發(fā)酵[13]等。目前，采用大氣壓冷等離子體激活酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的研究還未見報道。我們前期研究表明，大氣壓介質(zhì)阻擋放電等離子體可以激活克雷伯氏菌生長，從而縮短發(fā)酵周期，提高克雷伯氏菌生產(chǎn)1,3-丙二醇強(qiáng)度[6]。而且，隨著大氣壓介質(zhì)阻擋放電等離子體處理時間的延長，克雷伯氏菌細(xì)胞外殼上的大分子，如多糖和蛋白，被降解為小分子[14]。細(xì)胞外殼組分變化會影響細(xì)胞膜通透性，膜通透性改變直接影響細(xì)胞生理活動，最終引起代謝產(chǎn)物的變化[15]。研究證明，大氣壓冷等離子體炬可以誘導(dǎo)細(xì)胞膜通透性的瞬間提高[16]。綜上所述，我們推斷大氣壓冷等離子體可能是改善釀酒酵母細(xì)胞膜通透性，從而提高乙醇轉(zhuǎn)化率。

等離子體放電效果受多種因素影響，如放電電壓、放電間隙和處理菌液體積等。因此，本研究通過響應(yīng)面法優(yōu)化等離子體提高乙醇轉(zhuǎn)化率的最佳實驗參數(shù)。但是，通過響應(yīng)面法得到的最佳參數(shù)與單因素實驗中所得到的中心值偏差較大，其中單因素實驗中得出的最佳處理時間為3min，最佳處理電壓為26 V，最佳處理菌液體積為5 mL，而響應(yīng)面法得出的最佳處理時間1 min，處理電壓24 V，處理菌液體積為9 mL。造成這種結(jié)果的原因可能有如下幾點：

（1）利用響應(yīng)面法優(yōu)化的大氣壓冷等離子體激活釀酒酵母的三個參數(shù)之間是相互作用的。當(dāng)處理的菌液體積增加時，兩個電極之間的介質(zhì)厚度增加，會影響放電強(qiáng)度。

（2）本實驗所用的等離子體裝置是直接暴露于室溫空氣中的，放電效果受到諸多環(huán)境因素的影響，如空氣的濕度、環(huán)境溫度、菌液濃度等，從而影響實驗效果。

（3）實驗操作過程中出現(xiàn)的誤差，如當(dāng)電壓較低時，對放電間隙的精確度要求就很嚴(yán)格，間隙調(diào)不準(zhǔn)就會造成放電強(qiáng)度過大或不放電。這也反映了本實驗所用的大氣壓冷等離子體裝置有待進(jìn)一步完善。

綜上所述，雖然等離子體激活釀酒酵母發(fā)酵提高乙醇轉(zhuǎn)化率的應(yīng)用還存在諸多問題。但是，在特定條件下，大氣壓冷等離子體對釀酒酵母的激活效應(yīng)是毋庸置疑的。因此，不斷完善等離子體激活微生物發(fā)酵的裝置和優(yōu)化等離子體激活微生物的實驗參數(shù)，將大氣壓冷等離子體發(fā)展成為一種提高微生物發(fā)酵的新型方法是今后研究的主要方向。大氣壓冷等離子體具有高效、低溫、綠色環(huán)保等優(yōu)點，必將在微生物發(fā)酵工程領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

3 結(jié)論

通過響應(yīng)面法優(yōu)化大氣壓冷等離子體提高乙醇轉(zhuǎn)化率的最佳實驗參數(shù)，實驗結(jié)果表明，當(dāng)大氣壓冷等離子體處理時間1 min，處理電壓24V，處理菌液體積9 mL，放電間隙3 mm，電流1.6 A時，釀酒酵母發(fā)酵葡萄糖的乙醇轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)到0.58 g/g，比未經(jīng)等離子體處理過的釀酒酵母乙醇轉(zhuǎn)化率高23.6%。

感謝大連理工大學(xué)修志龍教授及其課題組全體人員在實驗中給予的幫助。感謝華中科技大學(xué)盧新培教授提供的等離子體相關(guān)文獻(xiàn)。

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Optimization of Experimental Parameters for Improved Ethanol Yield by Cold Plasma at Atmospheric Pressure

DONG Xiao-yu*, WANG Xiao, LIU Chao, LIU Qing-ping, FENG Bao-min
(College of Life Science and Technology, Dalian University, Dalian 116622, China)

Process conditions were investigated to improve ethanol yield in Saccharomyces cerevisiae by cold plasma at atmospheric pressure. According to single factor investigation, a mathematical model was established using Box-Behnken central composite experimental design, with treated time of plasma discharge, supply voltage, and treated volume of cell suspension as the impact factors and with ethanol yield as their response. This was followed by response surface analysis. It was found that the optimal process conditions for enhanced ethanol yield in Saccharomyces cerevisiae by plasma discharge were as follows: treated time 1 min, supply voltage 24 V, treated volume of cell suspension 9 mL, and that the resultant ethanol yield was 0.58 g/g with an increase of 23.6% compared to the control.

cold plasma at atmospheric pressure; Saccharomyces cerevisiae; response surface; yield of ethanol

TQ923

A

1008-2395(2012)03-0037-07

2012-03-13

遼寧省科學(xué)事業(yè)公益研究基金項目（201149）；遼寧省教育廳科學(xué)研究一般項目（2011173）；大連大學(xué)博士啟動基金項目（0302329）。

董曉宇（1973-），女，博士，講師，研究方向：生物化工和食品化工，等離子體生物學(xué)與生物技術(shù)，Email: dongxiaoyu@dlu.edu.cn。