史立平，李 玉

（1.沈陽師范大學實驗中心，遼寧 沈陽 110034；

2.吉林農業(yè)大學菌物研究所，吉林 長春 130118）

灰團網(wǎng)菌的生活史

史立平1，李 玉2

（1.沈陽師范大學實驗中心，遼寧 沈陽 110034；

2.吉林農業(yè)大學菌物研究所，吉林 長春 130118）

采用基物培養(yǎng)、燕麥－瓊脂培養(yǎng)技術及掃描電鏡技術對灰團網(wǎng)菌的個體發(fā)育過程進行了研究，在燕麥瓊脂培養(yǎng)基上完成了從孢子到孢子的生活史.結果表明：灰團網(wǎng)菌生活史包括單核的黏變形體或游動胞、多核的營養(yǎng)體原質團以及孢子形成階段.孢子球形，表面具疣突；孢子萌發(fā)為孔式，一個孢子可釋放一個黏變形體.黏變形體常行變形運動，在有水的條件下，可轉變?yōu)橛蝿影⒕哂杏蝿拥奶匦?合子形成原質團.成熟原質團白色，類型為顯型，具有扇形網(wǎng)絡狀菌脈.瓊脂培養(yǎng)基上獲得的灰團網(wǎng)菌孢子與野生型相似，并具有可育性.

黏菌；燕麥瓊脂培養(yǎng)；孢子形成；原質團

黏菌的生活史對于研究其營養(yǎng)方式的多樣性以及系統(tǒng)發(fā)育等具有重要價值.目前國際上有近100個品種的黏菌已在培養(yǎng)基上完成了其生活史［1－4］，而國內有關黏菌生活史的報道很少［5－11］.灰團網(wǎng)菌屬團網(wǎng)菌目、團網(wǎng)菌科、團網(wǎng)菌屬.子實體為孢囊，散生、群生或2～20個柄相連成束，亞圓柱形或卵圓形，少為寬卵形；徑可達0.8mm，高0.3～4.0mm.孢囊淺灰、黃褐至赭色；囊被薄、凋落，但常有殘片附著在伸展的孢網(wǎng)上；柄細，同色或稍暗，有時近黑色，柄長0.2～2.0mm，常聯(lián)合成束；孢絲同色，連著牢固，網(wǎng)眼密（見圖1A）.資料記載分布全球，原質團白色.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種 供試菌種為2002年8月在吉林蛟河、長白山二道白河、吉林敦化采集到的灰團網(wǎng)菌的原質團及子實體.依據(jù)子實體及孢子等特征進行鑒定.

1.1.2 主要儀器 超凈工作臺、醫(yī)用蒸汽消毒鍋、離心機、真空干燥箱、人工氣候箱；顯微成像系統(tǒng)，日本Hitachis-570掃描電鏡等.

1.2 方法

采用基物培養(yǎng)技術［12－14］、燕麥瓊脂培養(yǎng)技術［6，15－16］及掃描電鏡技術（SEM）.

電鏡觀察：先在樣臺上粘貼雙面膠，然后將成兩個熟子實體牢固置于雙面膠上.其中的一個子實體在解剖鏡下剝開上半部囊被使孢子暴露，經(jīng)離子濺射儀噴金后上鏡觀察，同時拍照.應用顯微測微尺測量黏變形體和游動胞大小，測100個，計算其平均值.

2.1 孢子及其萌發(fā)

孢子成堆時呈淺灰或淺黃色，光鏡下無色，球形.電鏡下觀察，囊被薄，孢子凹陷，直徑6～8μm，有細小疣點和少量較大疣點（見圖1B）；孢絲細線形，成網(wǎng)狀，具刺.孢子干燥時稍凹陷，遇水或營養(yǎng)提取液立即變?yōu)榍驁A形（見圖1C）.懸滴培養(yǎng)的孢子即將萌發(fā)時其原生質稍增大，并緩慢地運動.孢子懸浮6d后開裂，萌發(fā)類型為孔式.灰團網(wǎng)菌孢子萌發(fā)率很低，約30%.

圖1 灰團網(wǎng)菌掃描電鏡觀察及野生子實體

2.2 黏變形體與游動胞

孢子壁開裂后可釋放1～2個原生質.原生質在2%水瓊脂表面形成黏變形體，近于無色透明，梨形；黏變形體中央?yún)^(qū)域有一較大的細胞核，核仁大，色深、明顯.周圍部分的原生質膜從不定區(qū)域向外突出，均質狀原生質流入其中，形成偽足，其余部分的原生質隨著細胞形態(tài)的改變不停流動.黏變形體連續(xù)分裂使細胞數(shù)目增至數(shù)十或上百個.在有水的條件下，黏變形體轉變?yōu)橛蝿影?游動胞為逗點狀、梨狀至具鞭毛的變形蟲狀，前端尖后端鈍圓，長14.3～18.2μm （平均16.5μm，n＝100），寬5.2～7.8μm （平均6.5μm，n＝100個），以旋轉的方式并結合變形體的收縮運動快速游動.

2.3 合子及原質團的發(fā)育

黏變形體兩兩結合形成合子.合子比黏變形體大，為一圓形或近圓形結構，且細胞質濃厚，以此可區(qū)分單細胞的黏變形體與合子.在合子內部可觀察到原生質的流動.合子經(jīng)過核分裂后具有2核，再通過連續(xù)的核分裂很快發(fā)育為多核的變形體結構——幼原質團.灰團網(wǎng)菌原質團發(fā)育初期結構與已報道的針箍菌等絨泡菌目真菌的原質團［6］不同，未見蛞蝓形原質團，而是呈現(xiàn)不規(guī)則的網(wǎng)狀結構，非常薄，菌脈細.幼原質團之間互相融合成為較大的極性原質團，且原質團在遷移的過程中始終保持這種極性.

當原質團達1mm大小時，肉眼仔細觀察可見.從接種到出現(xiàn)肉眼可見的原質團約需10d.小原質團繼續(xù)生長，并融合為幾個較大的原質團，最終培養(yǎng)皿中的原質團完全融合為一個大原質團.原質團可依靠燕麥粉和水生長發(fā)育，大約10d左右，白色的原質團可長滿整個培養(yǎng)皿（見圖2A—C）.

圖2 灰團網(wǎng)菌原質團

2.4 原質團

營養(yǎng)體原質團成熟時具有較大的扇形結構，白色片狀，很薄，存在于培養(yǎng)皿的表面，類似于顯性原質團，具有遷移、融合和吞噬等特征.但原質團達不到顯性原質團的厚度，原質團內部的顆粒物質不明顯；芳香氣味不明顯，觸摸時會變成不定型的斑塊狀，且易于黏著.菌脈比顯性原質團菌脈細，直徑不超過0.5mm.低倍顯微鏡下觀察生長旺盛的原質團菌脈，可見菌脈內有許多的顆粒相互碰撞著并快速地向一個方向流動，單向流動時間為2～3min；接下來原生質的流動減慢，暫停片刻，然后開始向反方向流動.這種往返流動以一定的時間間隔重復進行，間隔時間為1～3s.

原質團的生長受酸度的影響.在pH＝4～7的范圍內，原質團生長良好，顏色正常；在pH＜3時也能夠生長，但生長緩慢.當pH＝8時原質團可維持生存；當pH＞9時，原質團變?yōu)闇\棕色而死亡.通過燕麥水瓊脂遷移技術，在水瓊脂培養(yǎng)基上保存的營養(yǎng)體原質團達270d，原質團仍生長良好.

2.5 子實體形成

原質團經(jīng)過營養(yǎng)生長，積累達到一定的量，才能形成子實體.若原質團量很少，例如在瓊脂表面上的面積小于1cm2，則不能形成子實體.足夠量的原質團經(jīng)過光照和饑餓，于4～7d后開始在培養(yǎng)皿的瓊脂表面、側壁等處形成子實體.成熟的原質團不經(jīng)過光照則不形成子實體.

成熟的原質團作為一個整體，全部參與子實體的形成.首先，培養(yǎng)皿中的原質團沿著原質團前緣和一些粗大的菌脈開始聚集，形成一些間距比較固定、沿菌脈分布的小團塊.團塊開始形成時比較扁平，形態(tài)不規(guī)則，團塊與團塊之間有菌脈相連，光鏡下觀察可見到菌脈內有原生質流動.接下來團塊逐漸向上隆起，形成規(guī)則的白色球圓形突起（見圖3A），直徑0.5～0.8mm，突起間彼此距離為1～10mm.此時圓形突起之間的菌脈退化，菌脈內已無原生質流動，直至菌脈完全消失，圓形突起間彼此獨立.此過程需要3～3.5h.多數(shù)圓球形突起繼續(xù)向上生長，突起的上部由橢圓形變成圓柱狀或卵圓狀，下部逐漸變細長，發(fā)育成為菌柄.最終形成圓柱狀具柄的白色幼子實體（見圖3B），全高3～4mm.少數(shù)圓球形突起形成的菌柄很短，或2～10個菌柄融合在一起.此過程大約需要4h.孢囊的白色外表可一直保持4～6h，后逐漸變成黃色、棕黃、棕紅、深棕至成熟的灰色（見圖3C—F）.菌柄最終變?yōu)闇\黃色，內部有石灰質沉積.從原質團到子實體形成至少需要14h（見表1）.

圖3 灰團網(wǎng)菌子實體的形成過程

表1 灰團網(wǎng)菌子實體的形成過程

3 討論

黏菌從孢子到孢子的培養(yǎng)由Lister在1901年首次報道，目前已有98個品種用培養(yǎng)的方法完成了其生活史［17］.然而，“盡管有許多關于黏菌的研究，但只有一些種的全部生活史的詳細情況是清楚的.普遍的生活史通常是建立在對多頭絨泡菌PhysarumpolicephalumSchwein研究的基礎之上的”［18］.20世紀80年代國內學者開始采用基物培養(yǎng)的方法獲得了一些黏菌［19］，劉樸及王琦等用基物培養(yǎng)和燕麥－瓊脂培養(yǎng)的方法對團毛菌目Trichales黏菌的主要屬種及絨泡菌目Physarales的細弱絨泡菌Physarum tenerumRex的個體發(fā)育進行了初步研究［20－21］，但關于灰團網(wǎng)菌的個體發(fā)育研究尚屬首次.［22］

Gilbert曾對不同科黏菌的孢子萌發(fā)進行了比較研究，發(fā)現(xiàn)黏菌的萌發(fā)能力在不同的種屬之間是有區(qū)別的；同期的Smith對5～25a的黏菌孢子進行了萌發(fā)實驗研究，指出所用實驗材料的年齡與萌發(fā)率之間并無相關性.后來Elliott利用膽鹽的方法來促進孢子萌發(fā)，取得了很好的效果.本研究將膽鹽的方法和純水培養(yǎng)進行了比較，孢子萌發(fā)率并無明顯差別，可能是由于灰團網(wǎng)菌孢子的萌發(fā)能力均比較弱所致.

早期的一些研究者已經(jīng)注意到黏菌營養(yǎng)體階段（原質團）發(fā)生在遮陰或光線暗的地方，而子實體通常發(fā)生在暴露的地方，這似乎表明了光對黏菌子實體形成的影響.其他影響?zhàn)ぞ訉嶓w形成的可能的重要因素包括濕度、pH和營養(yǎng).光能誘導子實體的形成，原質團產(chǎn)孢能力依賴于被照射的原質團的大小，即原質團必須有足夠的尺寸才能產(chǎn)孢.小原質團不論在黑暗中饑餓多久都不形成子實體［16］.本實驗通過光照饑餓技術對灰團網(wǎng)菌限制光照及營養(yǎng)，在純培養(yǎng)基上成功誘導形成了子實體.與已經(jīng)純培養(yǎng)成功的針箍菌Physarellaoblonga等相同，灰團網(wǎng)菌原質團對光照敏感，這與William的觀察一致.［23］

本實驗通過光照饑餓技術誘導形成子實體，共在30個培養(yǎng)皿中成功地誘導得到了灰團網(wǎng)菌子實體.生長在2%水瓊脂表面的灰團網(wǎng)菌原質團，在一個培養(yǎng)皿中最多可形成100多個子實體.在子實體成熟3～5d后接種孢子即可萌發(fā)并能夠長成原質團，表明在瓊脂上培養(yǎng)成熟的灰團網(wǎng)菌孢子具有可育性.完成從孢子到孢子的過程至少需要20d.

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Life cycle ofArcyriacinerea

SHI Li-ping1，LI Yu2
（1.Experimental Centre，Shengyang Normal University，Shenyang 110034，China；
2.Mycological Institute，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China）

The life history of myxomycetes is of importance to study diversity of nutritive modes and phylogenesis of these organisms.Until now the reports concered were few.Moist chamber culture method，oat-agar culture method and scanning electron microscopy were used to study the process of the individual development ofArcyriacinerea.The life cycle of spore-to-spore were completed in agar culture in petridish.The result shows that the life cycle ofArcyriacinereacomprises a unicellular amoeboid or swarm cell stage，a multinucleate plasmodium stage and a sporulation stage.The spore ofArcyriacinereais globular and the spore surface is spiny.The spore germinates by means of a poriform open and releases a single myxamoeba.The myxamoeba can move by amoeboid motion.When free water is available，myxamoebae can transform into swarm cells and swim in the water.Zygote forms into plasmodium.The mature plasmodium is white.The plasmodial type is the phaneroplasmodium which appears as a fan-shaped network of veins.Spores developed on agar are fertile and resemble those on natural substrate.

Myxomycetes；oat-agar culture；sporulation；plasmodium

Q 949.32

180·6140

A

1000-1832（2012）01-0118-05

2011-08-23

國家自然科學基金資助項目（30770005）.

史立平（1964—），女，博士，教授，主要從事菌物發(fā)育學研究；通訊作者：李玉（1944—），男，教授，博士研究生導師，中國工程院院士，主要從事真菌學研究.

方 林）