趙宇俠,林匡飛,張 衛(wèi),劉莉莉 (.淮海工學(xué)院化工學(xué)院環(huán)境工程系,江蘇 連云港 005；.華東理工大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院,國家環(huán)境保護(hù)化工過程環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 0037)

量子點(diǎn)-Cu2+對L02細(xì)胞的聯(lián)合毒性及NAC的防護(hù)作用

趙宇俠1,林匡飛2*,張 衛(wèi)2,劉莉莉2(1.淮海工學(xué)院化工學(xué)院環(huán)境工程系,江蘇 連云港 222005；2.華東理工大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院,國家環(huán)境保護(hù)化工過程環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200237)

以人胚肝細(xì)胞(L02)為研究對象,通過研究量子點(diǎn)及Cu2+(低毒濃度)聯(lián)合對細(xì)胞存活率的影響以及細(xì)胞形態(tài)的變化確認(rèn)細(xì)胞的毒性,結(jié)合抗氧化劑NAC的防護(hù)效果探討復(fù)合毒性的氧化損傷機(jī)理.結(jié)果表明,無論單獨(dú)Cu2+還是量子點(diǎn)-Cu2+處理組,L02細(xì)胞的增殖能力均受到抑制,量子點(diǎn)-Cu2+處理組表現(xiàn)出更加顯著的抑制效果,相對與單獨(dú)Cu2+處理組細(xì)胞存活率最大下降300%.經(jīng)過NAC預(yù)處理的細(xì)胞在形態(tài)和存活率上都顯著恢復(fù).說明了安全濃度范圍的量子點(diǎn)的與Cu2+共存提高了細(xì)胞毒性風(fēng)險(xiǎn),NAC能夠防護(hù)量子點(diǎn)與Cu2+單獨(dú)或聯(lián)合引起的氧化損傷.

CdTe-MPA量子點(diǎn)；Cu2+；L02細(xì)胞；MTT；聯(lián)合毒性

量子點(diǎn)(QDs)是近年發(fā)展起來的一種新型熒光納米顆粒,也稱半導(dǎo)體納米微晶體,是一種由Ⅱ～Ⅵ族或Ⅲ～Ⅴ族元素組成的納米顆粒.由于其粒徑很小(約 2～10nm),電子和空穴被量子限域,連續(xù)能帶變成具有分子特性的分立能級結(jié)構(gòu),與傳統(tǒng)的有機(jī)熒光染料相比,量子點(diǎn)的具有激發(fā)光譜寬,發(fā)射光譜窄而對稱,顏色可調(diào),光化學(xué)穩(wěn)定性高,不易光解等獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì).目前,量子點(diǎn)最具前景的應(yīng)用是在生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中作為熒光標(biāo)記物[1-5],它不僅可以在體外用于細(xì)胞骨架的標(biāo)記,還可以用于生物體內(nèi)的熒光成像[6-7].量子點(diǎn)越來越廣泛應(yīng)用使得其生物安全性的研究引起人們的廣泛關(guān)注.關(guān)于量子點(diǎn)的毒性機(jī)制研究主要集中在量子點(diǎn)高活性表面以及核心 Cd2+的釋放所產(chǎn)生的活性氧自由基介導(dǎo)的氧化應(yīng)激等方面[5-11].

重金屬銅存在于各種巖石和礦物中,是生物體自身所必需的元素.銅元素可以以3種氧化態(tài)互相轉(zhuǎn)化Cu0、Cu+、Cu2+,銅存在于30多種酶中作為氧化還原催化劑或氧載體,能夠通過 Fenton反應(yīng)在過氧化氫存在的條件下催化羥基自由基的生成[12-13].羥基自由基是毒性很強(qiáng)的自由基,能夠通過與脂類,氨基酸,和巰基,RNA,DNA等反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞損壞甚至死亡[12].

量子點(diǎn)和銅不僅都會通過 ROS產(chǎn)生毒性,并且在生物體內(nèi)往往都在肝中蓄積[14-15],通常對于銅污染采用的有效的3種主要方法包括絡(luò)合、沉淀和吸附[16].天然水中,OH-與銅絡(luò)合形成銅的水解產(chǎn)物 Cu(OH)+、Cu(OH)20、Cu2(OH)22+[16];這就使得量子點(diǎn)的加入對原有銅的毒性存在 2種可能,一是基于共同機(jī)制的 ROS損傷,另外可能由于量子點(diǎn)對銅可能的吸附和表面羥基的絡(luò)和降低其毒性.這種復(fù)合毒性無論對環(huán)境還是對體內(nèi)蓄積的共存都存在影響,乙酰半胱氨酸NAC作為著名的抗氧化劑可以通過屏蔽掉相關(guān)的氧化損傷減少細(xì)胞毒性[17],進(jìn)而從反面證明細(xì)胞的毒性機(jī)理.

基于以上考慮,本研究就量子點(diǎn)和Cu2+的聯(lián)合毒性進(jìn)行實(shí)驗(yàn),考察量子點(diǎn)的加入對銅離子的毒性的影響,驗(yàn)證上述假設(shè).同時(shí)通過抗氧化劑NAC驗(yàn)證是否ROS增加是毒性的主導(dǎo)因素,以期為其可能的體內(nèi)和環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)提供參考.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用的人胚肝細(xì)胞(L02)購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫,量子點(diǎn) CdTe-MPA(巰基丙酸)由華東理工大學(xué)化工學(xué)院合成,包覆MPA.直徑為3.7nm發(fā)紅光,在水相中合成的發(fā)射波長為628nm,摩爾濃度為5.8×10-6mol/L,質(zhì)量濃度為0.64mg/mL在pH值6～12范圍內(nèi)穩(wěn)定,合成方法參見參考文獻(xiàn)[2].量子點(diǎn)合成后用收集離心用丙醇純化以去除雜質(zhì).RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司.除了特別指出,其他所用的試劑包括無水氯化銅,乙酰半胱氨酸 NAC(N-ace tylcystein),四甲基偶氮唑鹽(MTT),2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)都購自Sigma試劑公司(St. Louis, MO, USA).

1.2 量子點(diǎn)和Cu2+處理及NAC保護(hù)實(shí)驗(yàn)

[8]的方法,實(shí)驗(yàn)用的 L02細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)基(GIBCO BRL, Grand Island, NY, USA)加入 10%的胎牛血清 (FBS) (GIBCO BRL, Grand Island, NY, USA)在37℃濕度是95%和5%的CO2條件下培養(yǎng).細(xì)胞在96孔板上以(細(xì)胞數(shù)) 104個(gè)/mL的初始濃度培養(yǎng),用于分析細(xì)胞內(nèi)Cu2+濃度的實(shí)驗(yàn)使用的是12孔板和細(xì)胞初始濃度是104個(gè)/mL.細(xì)胞處理前1 h,含有血清的培養(yǎng)基吸出,細(xì)胞PBS緩沖液洗2遍后替換上新鮮的無血清培養(yǎng)基[17].

細(xì)胞用不同濃度的單獨(dú)的或聯(lián)合的量子點(diǎn)(2～20μg/mL)與Cu2+(2～320μg/mL)處理,培養(yǎng)24h后用于各項(xiàng)分析.NAC的保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)選擇10μmol/L的NAC提前2h時(shí)加入培養(yǎng)基,然后替換為新鮮的含污染物的培養(yǎng)基處理24h后,再通過測定細(xì)胞存活率和觀察細(xì)胞形態(tài)等來考察NAC的防護(hù)效果從而推測其損傷機(jī)理.QDs從10mg/mL的無血清的培養(yǎng)基配制的母液稀釋得到,CuCl2從無菌的超純水配置的30mg/mL的母液稀釋得到.

1.3 MTT法測定細(xì)胞存活率

活細(xì)胞線粒體可還原MTT為紫色的甲瓚結(jié)晶,在一定范圍內(nèi)紫色深淺與活細(xì)胞濃度呈線性關(guān)系,通過測定甲瓚 570nm波長處的吸光值可反映活細(xì)胞活力的變化.取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于 96孔培養(yǎng)板(1×104個(gè)/mL),培養(yǎng) 24h使細(xì)胞貼壁,棄培養(yǎng)液,每孔加入含量子點(diǎn)或Cu2+的培養(yǎng)基稀釋的濃度分別為 0,2.5,5,10,20, 40,80,160μg/mL的Cu2+,和0,2.5,5,10,20,40,80, 160μg/mL的量子點(diǎn)溶液,每個(gè)劑量組設(shè)定3個(gè)復(fù)孔.染毒 24h后棄去每孔中的培養(yǎng)液,加入含10% MTT(5mg/mL)的RPMI-1640培養(yǎng)基(不含胎牛血清),繼續(xù)培養(yǎng)4h后,棄去MTT溶液,每孔加入DMSO 150μL后,于37℃振蕩至紫色的甲瓚結(jié)晶完全溶解后用酶標(biāo)儀測定各孔在570nm波長處的吸光度值.確定量子點(diǎn)和 Cu2+對L02細(xì)胞的半致死濃度[8,17].

對于聯(lián)合毒性實(shí)驗(yàn)方法如上,量子點(diǎn)選擇了2μg/mL(24h細(xì)胞致死率 10%)和 2.5,5,10, 20μg/mL濃度的Cu2+,進(jìn)行了Cu2+單獨(dú)處理和量子點(diǎn)-Cu2+聯(lián)合處理的細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn).同樣在無血清的培養(yǎng)基中處理 24h后替換 MTT在570nm波長處測定了吸光度值.確定量子點(diǎn)的存在對Cu2+細(xì)胞存活率的影響.

1.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

將待測試細(xì)胞接種于 6孔板(內(nèi)置蓋玻片),培養(yǎng) 24h,待細(xì)胞貼壁后,分別加入各種濃度受試物,處理 24h,將蓋玻片取出,用細(xì)胞固定液(甲醇∶冰醋酸＝3∶1)固定 5min,蒸餾水稍洗后加HE (蘇木精-伊紅)染色 10min,洗片后風(fēng)干,倒置顯微鏡(IMT-2, Olympus, Tokyo)下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化[8].

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,應(yīng)用 Origin 7.5軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和T-test檢驗(yàn),*表示以P＜0.05置信度下的差異有顯著性,代表 QDs-Cu2+聯(lián)合處理樣品對單獨(dú) Cu2+處理的差異顯著.

2 結(jié)果與分析

2.1 量子點(diǎn)與Cu2+對L02細(xì)胞毒性的LC50值

由圖 1可知,不同濃度的量子點(diǎn)和 Cu2+處理 24h后,隨著染毒劑量的增大,細(xì)胞增殖能力明顯下降,呈劑量-效應(yīng)關(guān)系.量子點(diǎn)對L02細(xì)胞的半致死濃度 LC50為 20μg/mL,LC10值約為2μg/mL. Cu2+對 L02細(xì)胞的半致死濃度約為31.3μg/mL.

2.2 量子點(diǎn)的加入對Cu2+細(xì)胞毒性的影響

為了調(diào)查低毒的量子點(diǎn)對原有的污染物Cu2+的影響, Cu2+選擇在LC50范圍內(nèi)選擇4個(gè)濃度 2.5,5,10,20μg/mL,量子點(diǎn)選擇 LC10(2μg/mL)進(jìn)行聯(lián)合毒性試驗(yàn).比較量子點(diǎn)與 Cu2+聯(lián)合組與單獨(dú)Cu2+處理組的細(xì)胞增殖情況(表1).結(jié)果表明, LC10濃度量子點(diǎn)的加入能顯著提高Cu2+的毒性.除了2.5μg/mL濃度外,選定的其他濃度Cu2+的半致死濃度都被提高到LC50濃度以上,最高增加了3倍.

2.3 NAC的防護(hù)作用

由于量子點(diǎn)和 Cu2+的毒性機(jī)理都與氧化損傷有關(guān),為了驗(yàn)證2種污染物質(zhì)是否通過相同的路徑誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞毒性,考察了 NAC對單獨(dú)和聯(lián)合損傷的防護(hù)效果.NAC作為有效的抗氧化劑已經(jīng)被證明能夠有效的防護(hù)重金屬或者納米材料誘導(dǎo)的氧化損傷[17-18].如果 2種污染物質(zhì)通過共通的氧化應(yīng)激路徑來實(shí)現(xiàn)對L02細(xì)胞的損傷,預(yù)期NAC能夠進(jìn)行有效的防護(hù).

圖1 量子點(diǎn)和Cu2+ 對L02細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effect of QDs and Cu2+ on L02 cells viability

表1 量子點(diǎn)對Cu2+誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的影響Table 1 Effect of QDs on Cu2+ induced cell viability decrease

圖2 NAC對Cu2+和QDs-Cu2+誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的影響Fig.2 Effect of NAC on Cu2+and QDs-Cu2+ induced cell viability loss

如果兩者通過其他的損傷路徑造成對細(xì)胞的傷害,那么 NAC至少不能夠?qū)崿F(xiàn)全面防護(hù).選擇10μmol/L的NAC提前2h加入培養(yǎng)基,然后替換為新鮮的含污染物的培養(yǎng)基處理24h后,再測定細(xì)胞存活率.根據(jù)MTT結(jié)果考察NAC的防護(hù)效果從而推測其損傷機(jī)理[8].

結(jié)果表明,NAC幾乎能夠有效的恢復(fù)Cu2+單獨(dú)處理組或者量子點(diǎn)與 Cu2+聯(lián)合處理組的細(xì)胞存活率損失.在調(diào)查濃度范圍內(nèi),NAC顯著地提高了污染物帶來的L02細(xì)胞的增殖能力的下降,結(jié)合前面的研究證明的量子點(diǎn)的加入顯著提高了Cu2+誘導(dǎo)的L02細(xì)胞ROS的產(chǎn)生水平(最高提高400%)[19],說明量子點(diǎn)與原有的污染物Cu2+的主要損傷路徑是通過氧化脅迫來實(shí)現(xiàn)的.

2.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

通過 HE染色觀察各處理組的細(xì)胞形態(tài)變化(圖3),基本和MTT結(jié)果一致.相對與Cu2+處理組來說,量子點(diǎn)的加入使細(xì)胞呈現(xiàn)了更加明顯的傷害.在鏡下觀察可見活細(xì)胞數(shù)明顯減少,細(xì)胞間質(zhì)消失,細(xì)胞體積縮小,細(xì)胞核濃縮、靠邊、深染等各種不同程度的異常變化.NAC處理后的細(xì)胞則無論在數(shù)量還是在形態(tài)都得到了顯著的回復(fù),細(xì)胞形態(tài)正?；?

圖3 不同處理濃度下單獨(dú)或者聯(lián)合處理組的細(xì)胞形態(tài)染色Fig.3 Effect of NAC on Cu2+ and QDs-Cu2+ induced cell morphology changes

3 討論

無毒的量子點(diǎn)(LC10)的存在使得原本低毒的 Cu2+(LC50以下)毒性顯著提高.這一結(jié)果同Wilson等關(guān)于過渡金屬和超細(xì)粉末的聯(lián)合氧化損傷是一致的[20].也就是說當(dāng)量子點(diǎn)和Cu2+共存于環(huán)境中時(shí)并沒有由于可能的結(jié)合帶來毒性的減弱,而是由于共通的氧化損傷帶來了毒性的增強(qiáng).當(dāng)多種量子點(diǎn)和重金屬毒物共存于污染水體中時(shí),將出現(xiàn)復(fù)雜的聯(lián)合毒性效應(yīng),所以僅用各種納米材料或者重金屬單一毒性的污染指標(biāo)判斷水污染后的毒性是不可取的.還應(yīng)從聯(lián)合毒性的角度采用生物毒性試驗(yàn)方法對水質(zhì)污染作出較客觀的綜合評價(jià).

此外,由于納米技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化,以及納米材料在醫(yī)療診斷、材料改性、環(huán)境污染物降解以及生物技術(shù)等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用[5,21],不可避免地會帶來由于生產(chǎn)增加而帶來的環(huán)境排放量的增加[14].而且由于其在細(xì)胞無損傷的實(shí)時(shí)成像、藥物運(yùn)送等方面的應(yīng)用可能帶來量子點(diǎn)的體內(nèi)蓄積,Yang等[22]也證明了量子點(diǎn)在體內(nèi)會重新再分配并且主要在肝中蓄積[22].同樣Cu2+作為原生的環(huán)境污染物由于工業(yè)和自然地理的原因在造成環(huán)境污染,并且作為人體必需的元素也主要是富集在肝臟[23].所以無論量子點(diǎn)和Cu2+在環(huán)境中或者由于醫(yī)療作用等原因在體內(nèi)共存并且由此帶來復(fù)合傷害的危險(xiǎn)都存在.這就使得對于復(fù)合污染尤其是對于單獨(dú)污染評價(jià)認(rèn)為是安全基礎(chǔ)上的復(fù)合毒性的評價(jià)和相應(yīng)的機(jī)理以及防護(hù)措施的研究等尤其必要.

關(guān)于量子點(diǎn)的毒性機(jī)制研究主要集中在重金屬元素Cd2+的釋放、氧化過程中活性氧的產(chǎn)生以及活性氧自由基介導(dǎo)的氧化應(yīng)激等方面的探討[5],關(guān)于銅的致毒機(jī)理有很多,也包括活性氧自由基介導(dǎo)的氧化應(yīng)激[24]以及通過激活A(yù)P-1轉(zhuǎn)錄和 JNK/SAPK及p38轉(zhuǎn)導(dǎo)等路徑實(shí)現(xiàn).NAC作為有效的ROS防護(hù)劑能夠有效的防止氧化損傷證明了2種污染物能夠通過共通的氧化損傷路徑來實(shí)現(xiàn)對肝細(xì)胞的致毒效應(yīng).

氧化應(yīng)激使機(jī)體處于易損狀態(tài),它不僅與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān),此外尚有資料表明活性氧可啟動一個(gè)鏈?zhǔn)椒磻?yīng),易與細(xì)胞膜上的各種不飽和脂肪酸及膽固醇反應(yīng),這種直接作用于細(xì)胞的氧化損傷能導(dǎo)致從而導(dǎo)致細(xì)胞脂質(zhì)過氧化水平升高,引起 DNA氧化損傷,細(xì)胞凋亡[26].所以考察NAC作為抗氧化劑是否提供有效的防護(hù)作用具有現(xiàn)實(shí)意義.也就是說可以為可能與量子點(diǎn)有關(guān)的環(huán)境污染或者體內(nèi)毒性提供合理的解決路徑.

4 結(jié)論

4.1 量子點(diǎn)和Cu2+的加入都會對L02細(xì)胞產(chǎn)生毒性.兩者的LC50分別為20μg/mL和31.3μg/mL并且該毒性都與氧化損傷有關(guān).NAC能夠有效的防護(hù)量子點(diǎn)和 Cu2+單獨(dú)作用或者聯(lián)合作用誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性.

4.2 無毒的量子點(diǎn)(LC10)的加入顯著提高Cu2+(LC50以上)的毒性,使得 Cu2+半致死濃度由31.3μg/mL降為3.83μg/mL.表明了無毒的量子點(diǎn)與無(低)毒的環(huán)境污染物的共存可能造成潛在的毒性效應(yīng)和環(huán)境風(fēng)險(xiǎn).

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Combined toxicity of QD-Cu2+on L02 cells and protective effect of NAC.

ZHAO Yu-xia1, LIN Kuang-fei2*, ZHANG Wei2, LIU Li-li2(1. School of Chemical Engineering, Huaihai Institute of Technology,Liangyungang 222005, China; 2.Research Center of Risk Assessment and Management on Hazardous Chemicals, School of Resource and Environmental Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China). China Environmental Science, 2012,32(1)：162～167

The oxidative injury of individual QDs or Cu2+to hepatic cells were both reported, the combined toxicity is concerned due to the co-existence of these two chemicals in human liver. We thus employed human hepatic L02 cells to test the combined toxicity of QDs and Cu2+(lower toxicity) through the cell viability decrease and cell morphology changes, meanwhile, the protective effect of antioxidant reagent NAC was used to evaluate the oxidant injury associated toxicity mechanism. The results showed that both QDs and Cu2+could decrease the cells viability, and addition of IC10of QDs could significantly improve Cu2+induced cell toxicity with cell viability decrease up to 300 %. NAC showed remarkable protective effects with almost identical cell viability and cell morphology compared to the control, indicating the coexistence of lower toxicity of QDs could improve Cu2+induced L02 cells toxicity, and NAC could effectively decrease QDs-Cu2induced oxidant injury toxicity.

CdTe-MPA quatum dots；Cu2+；L02 cells；MTT；combined toxicity

2011-03-11

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(40901148,41001316);淮海工學(xué)院自然科學(xué)基金項(xiàng)目(kx10516);連云港市科技局農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目(NY1007)

* 責(zé)任作者, 教授, kflin@ecust.edu.cn

X171.5

A

1000-6923(2012)01-0162-06

趙宇俠(1974-),女,吉林農(nóng)安人,講師,博士,研究方向?yàn)榄h(huán)境毒理學(xué)和環(huán)境微生物.發(fā)表論文10余篇.