范鴻冰，陳孫福，洪惠，羅永康

1(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京，100083)

2(廣西盟展鱷魚科技開發(fā)有限公司，廣西南寧，530028)

鱷魚(crocodile)是一種從中生代至今生長的脊椎類兩棲爬行動物，與已滅絕的恐龍是近親，是最古老的爬行動物，在地球上已生存了2億3千多萬年，具有“活化石”之稱［1］。鱷魚全身都是寶，如鱷魚肉含有豐富的優(yōu)良蛋白質(zhì)和人體必需的氨基酸、不飽和脂肪酸、維生素和多種微量元素。鱷魚肝有補腦、生新血、去濕氣之功。食用鱷魚肝可解毒明目，養(yǎng)血益腎，對肝功能欠佳和視力不好者，都具有明顯的食療作用，同時還可以抑制結(jié)石的生成［2］。鱷魚骨可防治風(fēng)濕骨痛，骨粉含有大量的活性鈣及磷等物質(zhì)，可用于防治老年骨質(zhì)疏松癥、小兒軟骨癥等［1］。鱷魚尾膠，不但能滋補肝腎，益氣固本，增強細胞活力，而且能護膚養(yǎng)顏，增加皮膚彈性，減少和延緩皺紋的早現(xiàn)，對過敏癥也有滿意效果［3］。但目前各地對鱷魚的商業(yè)利用多集中在皮革、食用方面，在醫(yī)療保健和藥用價值的開發(fā)利用還比較薄弱，缺乏深入的基礎(chǔ)研究，尚未形成規(guī)范的產(chǎn)品。目前國內(nèi)外對鱷魚的研究較少，關(guān)于鱷魚骨蛋白酶解產(chǎn)物的功能特性及抗氧化性的研究更是鮮有報道。

本試驗以養(yǎng)殖鱷魚魚骨為原料，采用木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶及雙酶混合使用對其進行酶解，并測定了酶解產(chǎn)物的功能特性及抗氧化性，為鱷魚魚骨的深入研究和進一步廣泛應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

鱷魚魚骨，由廣西盟展鱷魚科技開發(fā)有限公司提供。

堿性蛋白酶，丹麥NOVO公司;木瓜蛋白酶，廣西南寧龐博生物工程有限公司;三硝基苯磺酸(TNBS)、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、啡咯嗪，美國Sigma公司;其他試劑均為化學(xué)分析純。

UNICO-2007分光光度計，美國Unic公司;DS-1高速組織搗碎機，上海標(biāo)準(zhǔn)模型廠;TGL-16A臺式高速冷凍離心機，上海安亭科技儀器廠;FE20梅特勒-托利多實驗室pH計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;FD-1PF冷凍干燥機，北京德天佑科技發(fā)展有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鱷魚骨基本組成成分的測定

蛋白質(zhì)含量的測定:凱氏定氮法(GB5009.5-2010);粗脂肪含量的測定:索氏抽提法(GB/T5009.6-2003);水分含量的測定:直接干燥法(GB5009.3-2010);灰分含量的測定:550℃灼燒法(GB5009.4-2010)。

1.2.2 鱷魚魚骨蛋白酶解產(chǎn)物的制備工藝

鱷魚魚骨→洗凈→剁塊→絞碎→高溫蒸煮(121℃、20 min)→干燥(105℃、8 h)→二級粉碎→與去離子水混合(質(zhì)量體積比1∶10(g/mL))→調(diào)溫度、pH后加蛋白酶酶解(酶與底物質(zhì)量比3.87 g/kg，木瓜蛋白酶酶解4 h［pH7.0，60℃)、堿性蛋白酶酶解4h(pH8.0，60℃)、雙酶(0～1 h內(nèi)木瓜蛋白酶酶解、滅酶、加入堿性蛋白酶酶解3h)］→滅酶(100℃，10 min)→離心(10 000 r/min，10 min)→取上清液→冷凍干燥→鱷魚魚骨蛋白酶解產(chǎn)物

1.2.3 水解度的測定

參考 Alder-Nissen［4］和 Spellman 等［5］的三硝基苯磺酸法(trinitribenzenesulfonic，TNBS)。

1.2.4 抗氧化性的測定

1.2.4.1 亞鐵離子螯合能力的測定［6］。

取蛋白質(zhì)濃度為5 mg/mL酶解產(chǎn)物待測液1.0 mL與3.7 mL 99.5%的無水乙醇及0.10 mL 2×10-3mol/L FeCl2混勻，加入0.20 mL 5×10-3mol/L啡咯嗪啟動反應(yīng)，室溫下靜置20 min，并于562 nm處測定吸光度。對照組以1 mL去離子水代替酶解產(chǎn)物溶液。亞鐵離子螯合能力的計算:

式(1)中:A樣品和A對照分別表示樣品反應(yīng)液和對照溶液在562 nm下的吸光度。

1.2.4.2 清除DPPH自由基能力的測定［7］。

取蛋白質(zhì)濃度為5 mg/mL的酶解產(chǎn)物待測液1.50 mL與1.50 mL濃度為99.5%的無水乙醇混勻，加入0.375 mL 0.02%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的DPPH乙醇溶液振蕩混勻。室溫下暗室反應(yīng)60 min后在517 nm處檢測反應(yīng)液的吸光度。清除DPPH自由基能力計算公式:

式(2)中:A樣品和A對照分別表示樣品反應(yīng)液和對照液在517 nm下測得的吸光度。

1.2.4.3 還原力的測定［8］。

取蛋白質(zhì)濃度為5 mg/mL酶解產(chǎn)物待測液1.0 mL，加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖液(pH 6.6)和2.5 mL 1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的 K3［Fe(CN)6］溶液混勻，50℃水浴20 min后急速冷卻，加入2.5 mL10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))TCA(三氯乙酸)，充分混勻后3 000 r/min離心10 min。取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水及0.50 mL 1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的FeCl3充分混勻，室溫反應(yīng)10 min后于700 nm測其吸光值。

1.2.5 功能特性的測定

溶解性:根據(jù)李雪等［9］的方法測定。

熱穩(wěn)定性:根據(jù)李雪等［9］的方法測定。

乳化性:參考Pearce等［10］的方法測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 鱷魚骨基本成分組成

表1 鱷魚骨基本成分組成(ˉX±S)

2.2 水解度

鱷魚魚骨蛋白酶解后，不同酶解時間的水解度變化如圖1所示。木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物均在酶解過程最初的0.5 h內(nèi)酶解水解度上升較快，而后隨酶解時間的延長水解度變化逐漸減小，這與李雪［9，11］等的研究結(jié)果類似。堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物在酶解0.5 h以后，水解度顯著高于木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物的水解度(P＜0.05)。雙酶酶解產(chǎn)物水解度在1 h內(nèi)變化與木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物一致，在1～2 h內(nèi)堿性蛋白酶作用下，水解度上升較快，而后隨酶解時間的延長水解度變化逐漸減小。這可能是由于隨著酶解體系中游離氨基酸含量不斷增大，蛋白酶的酶解作用逐漸受到抑制，水解度變化逐漸減小。

2.3 抗氧化性

圖1 鱷魚骨蛋白水解過程中水解度隨時間的變化

2.3.1 亞鐵離子螯合能力

鱷魚魚骨蛋白經(jīng)酶解后，不同酶解時間的酶解物的亞鐵螯合能力如圖2所示。由圖2可知，在0～2 h內(nèi)堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的亞鐵離子螯合能力均顯著大于木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物和雙酶酶解產(chǎn)物(P＜0.05)。隨著酶解時間的延長，雙酶酶解產(chǎn)物的亞鐵離子螯合能力逐漸增大并最終趨于平穩(wěn)，在2～4 h內(nèi)雙酶酶解產(chǎn)物和堿性蛋白酶的亞鐵離子螯合力則沒有顯著性差異(P＞0.05)，且二者均顯著大于木瓜蛋白酶(P＜0.05)。本試驗也表明木瓜蛋白酶及堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物均具有增強螯合亞鐵離子的能力，采用雙酶酶解得到的酶解產(chǎn)物與堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物相似，明顯優(yōu)于木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物。

圖2 酶解時間對鱷魚骨酶解物亞鐵離子螯合能力的影響

2.3.2 清除DPPH自由基能力

鱷魚魚骨蛋白經(jīng)酶解后，不同酶解時間的酶解物清除DPPH自由基的能力如圖3所示。由圖3可知隨著酶解時間的延長，3種酶解產(chǎn)物的清除DPPH自由基能力較0.25 h都有所下降，在2～4 h內(nèi)相同酶解時間下，雙酶酶解產(chǎn)物清除DPPH自由基能力顯著大于木瓜蛋白酶及堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物(P＜0.05)。因此，采用雙酶酶解較單獨使用木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶得到的酶解產(chǎn)物具有更好的清除DPPH自由基的能力，同時該實驗也表明了木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物都具有清除DPPH自由基的能力。

圖3 酶解時間對鱷魚骨酶解物清除自由基能力的影響

2.3.3 還原力

鱷魚魚骨蛋白經(jīng)酶解后，不同酶解時間的酶解物的還原力如圖4所示。由圖4可知，相同酶解時間下，0～1 h內(nèi)3種酶解產(chǎn)物的還原力沒有顯著性差異(P＞0.05)，但隨著酶解時間的延長，2～4 h內(nèi)雙酶酶解產(chǎn)物的還原力均大于木瓜蛋白酶及堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物(P＜0.05)，而木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物則沒有明顯區(qū)別。本試驗結(jié)果不僅表明了木瓜蛋白酶及堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物具有增強還原力的作用，同時也證明了較單一酶酶解而言，雙酶酶解得到的酶解產(chǎn)物具有更好的增強還原力的作用。

圖4 酶解時間對鱷魚骨酶解物還原力的影響

2.4 功能特性

2.4.1 溶解性

不同條件下的鱷魚骨酶解產(chǎn)物的溶解性見表2?？梢钥闯觯附猱a(chǎn)物經(jīng)酶解之后溶解性良好，其中雙酶酶解產(chǎn)物在pH 7時的溶解性均大于84.34%，最高達到97.02%，可能是因為雙酶酶解使蛋白質(zhì)大分子電離出更多的親水基團和離子基團，其數(shù)量與蛋白質(zhì)的水合作用程度有關(guān)。相同的酶解條件下的酶解產(chǎn)物，在0.25～4.00 h內(nèi)pH 7時不同酶解時間下酶解產(chǎn)物的溶解性均大于 pH 4時的溶解性(P＜0.05)，Quaglia等［12］指出，pH 值會影響酶解產(chǎn)物肽段的靜電荷數(shù)量從而導(dǎo)致溶解性的變化。同時，相同水解度下，在2.00～4.00 h內(nèi)的雙酶酶解產(chǎn)物在pH 4和pH 7下顯著大于木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物(P＜0.05)。

2.4.2 熱穩(wěn)定性

酶解產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性是衡量其是否適于在食品中應(yīng)用的一個重要指標(biāo)［11］。不同條件下的鱷魚骨酶解產(chǎn)物經(jīng)熱處理后的溶解性見表3?？梢钥闯?，酶解產(chǎn)物經(jīng)93℃，10 min熱處理之后溶解性略有下降，但熱穩(wěn)定性仍然良好。其中雙酶酶解產(chǎn)物在pH 7下熱處理后溶解性均大于77.38%。這可能是由于蛋白質(zhì)經(jīng)酶解后肽鏈展開，親水-疏水平衡得到改善，更易于水分子形成氫鍵，所以熱處理之后分子之間不容易聚集，仍可保持較高的溶解性［13］。

表2 不同條件下鱷魚骨酶解產(chǎn)物的溶解性

表3 不同條件下鱷魚骨酶解產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性

2.4.3 乳化性

蛋白質(zhì)的乳化性是指蛋白質(zhì)能使水油結(jié)合在一起，形成穩(wěn)定的乳狀液的性能［14］，乳化活性表征乳化體系分散相的分散程度及相界面的界面比，反映乳化體系維持兩相穩(wěn)定存在的能力。不同酶解時間下的鱷魚骨酶解產(chǎn)物的乳化性見圖5。隨著酶解時間的延長，堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的乳化性呈下降趨勢。而在0.25～3.00 h內(nèi)木瓜蛋白酶及雙酶酶解產(chǎn)物的乳化性分別在1.0 h和2.0 h達到最大，這可能是因為蛋白質(zhì)被酶解后，分子內(nèi)部的疏水殘基暴露，蛋白質(zhì)在油-水界面吸附、擴散能力提高，乳化能力增強。隨后其乳化性減小，這可能是由于其酶解產(chǎn)物中小分子的肽和氨基酸增多，不利于蛋白質(zhì)在油-水界面的擴散和吸附，導(dǎo)致乳化性的下降［15］。相同酶解時間下，雙酶酶解2.0 h和3.0 h得到的產(chǎn)物的乳化性顯著高于其他組(P＜0.05)。

圖5 酶解時間對鱷魚骨水解產(chǎn)物乳化活性指數(shù)指數(shù)的影響

3 結(jié)論

(1)鱷魚魚骨蛋白酶解產(chǎn)物的抗氧化性受酶解時間及蛋白酶種類的影響，采用木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶雙酶酶解產(chǎn)物的抗氧化性較強，具有作為天然抗氧化劑的潛力。

(2)采用此種雙酶酶解法酶解鱷魚骨，在溫度60℃和pH7.0條件下，按酶底物比3.87 g/kg加入木瓜蛋白酶酶解1 h后，100℃滅酶10 min，于60℃調(diào)節(jié)pH8.0后加入堿性蛋白酶酶解1h得到的酶解產(chǎn)物具有較好的抗氧化性和功能性質(zhì)，可以考慮取該條件下的酶解產(chǎn)物制備抗氧化劑應(yīng)用于食品工業(yè)。

［1］ 許東暉，馬海萍，梅雪婷，等.鱷魚的活性物質(zhì)及其藥理作用、保健功效研究進展［J］.中國海洋藥物，2007，26(6):44-47.

［2］ 吳素玲.鱷魚精滋補液營養(yǎng)成分分析［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2000，26(2):83-85.

［3］ 陳獻君，許金旺，陳海峰.鱷魚健康養(yǎng)殖技術(shù)研究［J］.中國水產(chǎn)，2005(9):87-89.

［4］ Alder-Nissen J.Determination of the degrees of hydrolysis of food protein hydrolysates by trinitribenzenesulfonic acid［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1979，27(6):1 256-1 263.

［5］ Spellman D，McEvoy E，O'Cuinn G，et al.Proteinase and exopeptidase hydrolysis of whey protein:comparison of the TNBS，OPA and pH stat methods for quantification of degree of hydrolysis［J］.International Dairy，2003，13(6):447-453.

［6］ Decker E A，Welch B.Role of ferritin as a lipid oxidation catalyst in muscle food［J］.Agricultural and Food Chemistry，1990，38(3):674-677.

［7］ Bougatef A，Nedjar-Arroume N，Manni L，et al.Purification and identification of novel antioxidant peptides from enzymatic hydrolysates of sardinelle(Sardinella aurita)by product proteins［J］.Food Chemistry，2010，118(3):559-565.

［8］ Oyaizu M.Studies on products of browning reaction:antioxidative activities of products of browning reaction prepared from glucosamne［J］.Japanse Journal of Nutrition，1986，44:307-315.

［9］ 李雪，羅永康，呂元萌，等.鰈魚下腳料酶解產(chǎn)物的功能特性［J］.肉類研究，2011，25(7):5-7.

［10］ Pearce K N，Kinsella J E.Emulsifying Properties of Proteins:Evaluation of a Turbidimetric Technique［J］.Agricultural and Food Chemistry，1978，26(3):716-723.

［11］ 李雪，羅永康，尤娟.草魚魚肉蛋白酶解物抗氧化性及功能特性研究［J］.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2011，16(1):94-99.

［12］ Quaglia G B，Orban E.Influence of the degree of hydrolysis on the solubility of the protein hydrolysates from sardine(Sardinapilchardus)［J］.Journal of Science of Food and Agriculture，1987，38(3):271-276.

［13］ Yust M M，Pedroche J，Millan-Linares M C，et al.Improvement of functional properties of chickpea proteins by hydrolysis with immobilised Alcalase［J］.Food Chemistry，2010，122(4):1 212-1 217.

［14］ 郭興鳳，慕運動，阮詩豐.不同測定方法對大豆分離蛋白乳化性測定結(jié)果的影響［J］.食品研究與開發(fā)，2007，28(2):129-131.

［15］ Klompong V，Benjakul S，Kantachote D，et al.Antioxidative activity and functional properties of protein hydrolysate of yellow Trevally(Selaroides leptolepis)as influenced by the degree of hydrolysis and enzyme type［J］.Food Chemistry，2007，102(4):1 317-1 327.