劉軍，張朋書，于晴，邱海波

(東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 ICU，江蘇南京 210009)

小鼠由于來源廣泛、免疫及遺傳背景清楚、基因與人類相似、價格便宜、所需試劑的量相對較小，是急性肺損傷(ALI)、肺部感染、哮喘、肺氣腫、肺纖維化等肺部疾病動物模型中常用的動物［1］。制備小鼠肺單細(xì)胞懸液為近年一些實驗室常用的技術(shù)，是肺細(xì)胞生物學(xué)研究的前提。實體肺組織單細(xì)胞懸液的制備較為困難，獲得產(chǎn)率高、活性高、功能強的單細(xì)胞對于進(jìn)一步的實驗研究十分必要，而細(xì)胞數(shù)量不足、細(xì)胞碎片過多、細(xì)胞粘連成團(tuán)等均可導(dǎo)致整個實驗的失敗［2］。近年來，盡管小鼠作為模式動物在生物醫(yī)學(xué)研究中的優(yōu)勢越來越明顯，但目前有關(guān)肺單細(xì)胞懸液制備的報道較少，尤其是動物實驗中小鼠肺組織量極少(成年小鼠肺組織僅約100～150 mg)，如何應(yīng)用少量小鼠肺組織制備足量的肺單細(xì)胞懸液以進(jìn)一步進(jìn)行實驗研究值得關(guān)注。

目前常見的分散組織以制備單細(xì)胞懸液的方法有機械法和化學(xué)(酶消化)法［3］?，F(xiàn)在分離組織單細(xì)胞懸液常用的有以下方法:機械法，適宜于一些纖維成分很少的軟組織，但該方法對組織損傷較大，易引起細(xì)胞損傷和丟失;酶消化法，適宜于含結(jié)締組織成分多的標(biāo)本，所需的組織需要量少，但酶可消化細(xì)胞膜上的某些成分［3］。機械分離法簡單，但由于分離組織不徹底、含有組織塊較多、分離的細(xì)胞數(shù)量偏少等原因，現(xiàn)已較少采用，宜根據(jù)組織類型、研究目的及要求選擇恰當(dāng)?shù)姆椒ê驮噭?。制備小鼠肺單?xì)胞懸液是非常重要的一個實驗環(huán)節(jié)，對于研究肺部疾病的細(xì)胞學(xué)機制，探討防治策略具有重要意義。本實驗應(yīng)用少量的小鼠肺組織，采用膠原酶Ⅴ酶消化法成功制備了小鼠肺單細(xì)胞懸液，并應(yīng)用細(xì)胞計數(shù)和流式細(xì)胞術(shù)等對其進(jìn)行了鑒定。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級健康雄性C57BL/6小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供［合格證號:蘇SCXK(軍)2007-004］。

1.1.2 主要試劑及配制 Ⅴ型膠原酶和臺盼藍(lán)均購自Sigma公司，Hank's平衡液、PBS液和紅細(xì)胞裂解液由碧云天生物技術(shù)研究所提供，牛血清白蛋白購自Roche公司。

應(yīng)用Hank's平衡液以175 U·ml-1濃度配制膠原酶Ⅴ消化液，牛血清白蛋白使用時以新鮮配制的PBS液配制為1%濃度。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠肺的采集 小鼠處死，75%醫(yī)用乙醇消毒局部皮膚，無菌操作打開胸腔取出肺臟并移入平皿中，無菌PBS清洗肺組織表面的血液及血凝塊，去除氣管和支氣管。

1.2.2 膠原酶Ⅴ消化法制備肺單細(xì)胞懸液 取30 mg肺組織，無菌狀態(tài)下應(yīng)用眼科剪將肺組織輕柔剪成1～2 mm3小塊，然后用勻漿機勻漿1 min。將組織加入預(yù)熱至37℃的新鮮膠原酶Ⅴ消化液中，置入37℃的水浴箱中，每隔3～5 min輕輕振搖1次。60 min時可見肺組織幾乎全部消化，冰浴終止消化，輕輕吹打分散細(xì)胞，收集消化液;200目不銹鋼網(wǎng)過濾;離心(1 000 r·min-1，5 min);去上清，加入PBS輕柔吹打;離心去上清;加入紅細(xì)胞裂解液5 ml，冰上孵育10 min;離心去上清;加入PBS吹打，再離心漂洗1～2次，去上清，加入含1%BSA的4℃ PBS2 ml得到小鼠肺單細(xì)胞懸液。

1.3 細(xì)胞鑒定

1.3.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 光學(xué)顯微鏡下觀察肺細(xì)胞形態(tài)。

1.3.2 細(xì)胞計數(shù) 吸取少量細(xì)胞懸液，加到細(xì)胞計數(shù)板上，在倒置顯微鏡(10×物鏡)下計數(shù)4個大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)。按公式計算，細(xì)胞數(shù)目=(4大格細(xì)胞數(shù)之和/4)×104×細(xì)胞原液量(ml)。

1.3.3 細(xì)胞活性測定(臺盼藍(lán)排斥實驗) 吸取9滴細(xì)胞懸液，加入1滴0.4%臺盼藍(lán)，混勻后在3 min內(nèi)計數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞數(shù)量，計數(shù)細(xì)胞活性率。藍(lán)染細(xì)胞為死亡細(xì)胞，活細(xì)胞不著色。計數(shù)200個細(xì)胞，計算出活細(xì)胞百分率。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測肺細(xì)胞懸液 取小鼠肺單細(xì)胞懸液樣本，離心去上清，加入0.5 ml PBS溶液，混勻后應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測分析。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞形態(tài)

光鏡下，膠原酶Ⅴ消化法所得小鼠肺細(xì)胞多種多樣、大小不一，但細(xì)胞形態(tài)完整、邊界清晰、分散度好、背景較干凈、雜質(zhì)及細(xì)胞碎片較少、細(xì)胞團(tuán)較少(圖1)。

圖1 分離的小鼠肺細(xì)胞圖 ×100Fig 1 Morphology of isolated lung cells in mice ×100

2.2 細(xì)胞計數(shù)及細(xì)胞活性率

膠原酶Ⅴ消化肺細(xì)胞產(chǎn)量高、活力好，通常30 mg小鼠肺組織可提取有核細(xì)胞數(shù)量為(1～4)×106個。肺單細(xì)胞懸液中活細(xì)胞百分率均在95%以上(圖2)。

圖2 小鼠肺單細(xì)胞懸液臺盼藍(lán)染色圖 ×400 Note:arrows indicate necrotic cells stained with blueFig 2 Trypan blue staining of lung single cell suspension in mice ×400

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測肺單細(xì)胞懸液

流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠肺單細(xì)胞懸液見大量的肺細(xì)胞(圖3)。

3 討 論

呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)病率高，在該領(lǐng)域內(nèi)的實驗性研究已從實驗動物的大體水平漸轉(zhuǎn)移到單細(xì)胞乃至分子水平［4-5］，要從結(jié)果復(fù)雜的肺組織檢測某種細(xì)胞必須對肺組織進(jìn)行分離，制備肺單細(xì)胞懸液是進(jìn)行細(xì)胞體外培養(yǎng)和細(xì)胞生物學(xué)研究的首要環(huán)節(jié)，這就需要一種簡單、穩(wěn)定、高效的肺實質(zhì)細(xì)胞的分離方法，以為科研工作提供高效的平臺。

圖3 小鼠肺單細(xì)胞懸液流式細(xì)胞圖Fig 3 The representative dot plot showing mice lung single cell suspension

目前分離組織單細(xì)胞懸液常用的有以下方法:機械分離法，適宜于一些纖維成分很少的軟組織，但該方法對組織損傷較大，易引起細(xì)胞損傷和丟失;酶消化法適宜于含結(jié)締組織成分多的標(biāo)本，所需的組織需要量少，但酶可消化細(xì)胞膜上的某些成分［3］。機械分離法簡單，但由于分離組織不徹底、含有組織塊較多、分離的細(xì)胞數(shù)量偏少等原因現(xiàn)已較少采用。

由于小鼠本身肺組織量少，含結(jié)締組織較多，本研究采用酶消化法直接制備肺單細(xì)胞懸液。膠原酶僅對細(xì)胞間質(zhì)有消化作用而對實質(zhì)細(xì)胞影響不大，且其消化作用不受一些離子和血清等成分的影響，故本實驗應(yīng)用膠原酶Ⅴ進(jìn)行酶消化［3，6］。

本研究結(jié)果顯示，應(yīng)用膠原酶Ⅴ酶消化法制備肺單細(xì)胞懸液，光鏡下見細(xì)胞大小不一、形態(tài)多樣，提示是多種細(xì)胞的混合物，可能包括各型上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等。另外，少量肺組織(30 mg)可以獲得(1～4)×106個肺細(xì)胞，提示本方法分離少量肺組織獲得的單細(xì)胞數(shù)量足以滿足一般肺細(xì)胞生物學(xué)研究的需要，便于施加處理因素，并有利于進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞培養(yǎng)等實驗。

流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用于肺組織細(xì)胞研究，具有快速、準(zhǔn)確、高靈敏、多參數(shù)檢測細(xì)胞等特點，用流式細(xì)胞術(shù)對肺組織單細(xì)胞各種免疫表型分析都必須基于單細(xì)胞基礎(chǔ)之上，肺單細(xì)胞懸液樣品制備是其分析的關(guān)鍵［2，7］。我們采用流式細(xì)胞術(shù)鑒定分離的肺細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)肺細(xì)胞懸液中有大量的單細(xì)胞(圖3)，也證實膠原酶Ⅴ酶消化制備肺單細(xì)胞懸液方法高效可靠。被分散的肺組織細(xì)胞是多種細(xì)胞的混合物，可通過分析熒光標(biāo)記的特異性抗體表達(dá)，進(jìn)一步檢測某個或某些特定的細(xì)胞群。

實體組織單細(xì)胞懸液制備比較困難，需注意的事項較多。本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)以下因素與實驗成功率和分離的細(xì)胞數(shù)量密切相關(guān):(1)掌握無菌原則。包括取肺、配制試劑等應(yīng)注意無菌原則，避免滋生一些不必要的細(xì)菌，影響到最后的檢測結(jié)果。(2)操作動作輕柔。避免損傷組織細(xì)胞，盡量減少細(xì)胞碎片。(3)不銹鋼網(wǎng)孔徑。不銹鋼網(wǎng)孔徑影響過濾細(xì)胞的大小，過大則可能液體中含大量的細(xì)胞團(tuán)塊，孔徑過小會引起大量細(xì)胞丟失。(4)離心速度和時間。離心速度過快、時間過長，造成細(xì)胞損傷，甚至死亡，同時會擠壓細(xì)胞，細(xì)胞凝集重新變成團(tuán)塊狀，不利于均勻分散懸浮，且還會使得在最后的檢測中發(fā)現(xiàn)大量殘余的細(xì)胞碎片，影響結(jié)果;離心速度太慢或時間過短，組織細(xì)胞容易懸浮，既不能有效去除碎片，更造成不必要的細(xì)胞損失;因此，在離心時要注意離心的速度和時間。(5)膠原酶Ⅴ消化液工作溫度。在膠原酶Ⅴ作用期間要注意保持37℃消化。(6)酶消化液作用時間。時間會影響酶消化效果，本實驗發(fā)現(xiàn)，30 mg的肺組織膠原酶Ⅴ在37℃消化1 h，可以取得滿意結(jié)果。(7)酶消化液量。一般要求酶消化液容積為肺組織體積30～50倍，本研究在進(jìn)行酶消化時，一般30 mg的肺組織給予4 ml的膠原酶Ⅴ酶消化液(175 U·ml-1)可取得較好效果。(8)振搖。酶消化時每隔數(shù)分鐘輕輕振搖數(shù)次以增加酶作用面積，如能放置在37℃的恒溫震蕩水浴箱中更好，如組織塊經(jīng)振搖后成細(xì)胞團(tuán)或單個細(xì)胞，即可認(rèn)為已消化充分。(9)酶消化液最好臨用時配制，新鮮酶消化液效率高。(10)細(xì)胞在保存液中的狀態(tài)。不同的細(xì)胞其保存液的濃度不同，這就要求調(diào)試到最適合濃度以使得細(xì)胞在液體中能保持單個的均勻分散的狀態(tài)。

總之，應(yīng)用膠原酶Ⅴ酶消化法制備肺單細(xì)胞懸液簡單、高效、穩(wěn)定，無需進(jìn)行肺細(xì)胞培養(yǎng)卻可以直接得到大量單細(xì)胞，非常適合于肺細(xì)胞病理、生理變化的研究。

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