何 芬,王立華,寧大亮,郭 光,王 慧* (.清華大學(xué)環(huán)境學(xué)院,北京 00084；.河北北方學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所,河北 張家口 075000)

嗜鹽菌群對(duì)菲的降解及萘雙加氧酶基因的表達(dá)規(guī)律

何 芬1,王立華2,寧大亮1,郭 光1,王 慧1*(1.清華大學(xué)環(huán)境學(xué)院,北京 100084；2.河北北方學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所,河北 張家口 075000)

從勝利油田富集了一個(gè)能夠降解多環(huán)芳烴的嗜鹽菌群,通過(guò)克隆文庫(kù)技術(shù)解析了菌群萘雙加氧酶(ndo)基因的多樣性.結(jié)果表明,該嗜鹽菌群有6種ndo基因型,其中3種主要基因型(占總克隆子92.7%)與經(jīng)典nah-like基因的相似度為89%.采用real-time RT-PCR等技術(shù)分析了不同鹽度下菲降解過(guò)程中ndo基因的表達(dá)量、降解速率、生長(zhǎng)曲線以及菲的生物可利用度,探索了菌群對(duì)菲的降解及ndo基因的表達(dá)規(guī)律.結(jié)果表明,當(dāng)鹽度由10%升高到20%,菌群完全降解100mg/L菲的時(shí)間從6d延長(zhǎng)到9d,菌群生長(zhǎng)的遲滯期由1d延長(zhǎng)為3d.溶解菲的濃度在菌群生長(zhǎng)過(guò)程中呈增加的趨勢(shì).Ndo基因的表達(dá)量在降解過(guò)程中呈先降低后隨溶解菲濃度升高而升高的趨勢(shì),表明高濃度菲在初始階段可能抑制ndo基因的表達(dá).單因素方差分析(n=3, P＞0.05)表明溶解菲濃度在10%和20%鹽度下沒(méi)有顯著差異,表明一定范圍的鹽度不會(huì)影響菌群降解過(guò)程中菲的溶解度.菌群ndo基因的相對(duì)表達(dá)量在10%鹽度下較在20%鹽度下高,說(shuō)明鹽度對(duì)嗜鹽菌群功能基因的表達(dá)具有抑制作用.

嗜鹽菌群；基因表達(dá)；生物可利用度；菲的溶解度；萘雙加氧酶

多環(huán)芳烴(PAHs)由于具有潛在致畸性、致癌性和遺傳毒性而受到廣泛關(guān)注[1].PAHs的污染常常伴隨著鹽環(huán)境和大幅鹽度波動(dòng)[2-3].高鹽度和鹽度的波動(dòng)往往導(dǎo)致非嗜鹽微生物的修復(fù)效率明顯降低,甚至喪失修復(fù)能力[2,4].利用嗜鹽微生物降解或修復(fù)鹽環(huán)境下PAHs污染是一條可行的解決途徑.研究發(fā)現(xiàn),較高的鹽度會(huì)限制菌群降解石油、苯和甲苯等污染物的能力[3,5-6],但是長(zhǎng)時(shí)間暴露在污染下,微生物對(duì)污染物的降解會(huì)增加[3,5].PAHs的生物降解往往受到其生物可利用度的限制(溶解度低或者易于被土壤吸附),而鹽度會(huì)影響PAHs的溶解度[7].Kleubsteuber等[3]發(fā)現(xiàn),隨著鹽度在 0～20%間波動(dòng),以石油為底物的菌群的代謝多樣性會(huì)改變,優(yōu)勢(shì)菌屬也會(huì)隨之改變.可見(jiàn),PAHs的生物降解是一個(gè)易受鹽度影響的復(fù)雜過(guò)程.但是目前缺乏對(duì)高鹽環(huán)境下 PAHs的生物降解過(guò)程及其分子機(jī)制的深入探索.

本文采用克隆文庫(kù)和real-time RT-PCR等方法,旨在解析嗜鹽菌群中萘雙氧酶(ndo)基因的多樣性,并通過(guò)分析不同鹽度下菲降解過(guò)程中萘雙氧酶(ndo)基因的表達(dá)量、降解速率、生物量以及溶解態(tài)菲濃度變化的動(dòng)力學(xué)關(guān)系,探討了嗜鹽菌群對(duì)菲的生物降解及 ndo基因的表達(dá)規(guī)律,為建立和發(fā)展復(fù)雜環(huán)境中PAHs生物降解動(dòng)力學(xué)及生物修復(fù)方法和策略提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

菲 (98%純,Aldrich Chemical Co., USA),菌株E.coli DH5α和感受態(tài)細(xì)胞PUC19(天根生化科 技 ),質(zhì) 粒 pMD?19-T Simple Vector (TAKARA),反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKARA),Real-time SYBRGreen染料(TAKARA),Real-time 儀器(Bio-Rad, America),高效液相色譜(島津,10Avp).

油污染土壤樣品采自中國(guó)山東省勝利油田,-80℃貯存.

按照Z(yǔ)hao等[8]的方法配制不同鹽度的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(SSDM,sea salt-defined media).當(dāng)SSDM 培養(yǎng)基中添加 0.01%的酵母粉定義為SSDMY培養(yǎng)基.菌株E.coli DH5α生長(zhǎng)于LB培養(yǎng)基上.

1.2 菌群的富集

按照Z(yǔ)hao等[8]的方法采用添加400mg/L菲和10%鹽度的SSDM培養(yǎng)基富集中度嗜鹽菌群.

1.3 降解曲線和溶解菲的測(cè)定

將20mL富集的菌群在6000r/min、常溫離心10min后接種到滅菌的SSDMY培養(yǎng)基中,同時(shí)設(shè)置加滅活菌液的對(duì)照樣(100mg/L菲)進(jìn)行降解實(shí)驗(yàn).2組降解實(shí)驗(yàn)條件分別是 100mg/L菲,10%鹽度和100mg/L菲,20%鹽度.在降解過(guò)程中定時(shí)取樣同時(shí)測(cè)菌群的OD值、菲的濃度和基因表達(dá)量.每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行樣.

總菲測(cè)定:從培養(yǎng)液中均勻取出 1000μL菌液,加入2倍體積的二氯甲烷進(jìn)行萃取.萃取液用0.22μm濾膜過(guò)濾后,采用HPLC測(cè)定萃取液中菲濃度.

溶解菲測(cè)定:采用帶注射器的 0.22μm的纖維素膜過(guò)濾樣品以去除微粒菲,使用前過(guò)濾同樣的樣品 2mL[9-10].去除微粒菲的樣品按照總菲測(cè)定的方法處理.

HPLC條件:色譜柱為 C18反相柱(依利特,Hypersil BDS C18,250mm×4.6mm×5μm),測(cè)定時(shí)間 20min;流動(dòng)相為 90%甲醇;流速為1.0mL/min;柱溫為 35℃;進(jìn)樣量為 20μL;檢測(cè)波長(zhǎng)254nm.測(cè)定結(jié)果為3個(gè)平行樣的平均值.

1.4 菌群的生長(zhǎng)量

取 4mL菌液檢測(cè),采用紫外分光光度儀(UV-2401PC,島津,日本)在600nm下檢測(cè)嗜鹽菌群的生長(zhǎng).菌群的OD600采用式(1)計(jì)算:

式中,樣品 OD600指所取菌液的 OD600,樣品上清液OD600指菌液離心后上清液的OD600.把培養(yǎng)基中菲濃度帶入菲濃度與 OD600標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算獲得樣品菲 OD600.10%鹽度和 20%鹽度下菲濃度與OD600標(biāo)準(zhǔn)曲線分別是:

式中: y為OD600值,x為菲的濃度.測(cè)定結(jié)果為3個(gè)平行樣的均值.

1.5 Ndo基因的克隆文庫(kù)

收集富集的菌液,經(jīng)過(guò)DNA提取,PCR及產(chǎn)物純化、連接至質(zhì)粒pMD?19-T Simple Vector、轉(zhuǎn)化獲得單克隆.擴(kuò)增引物是簡(jiǎn)并引物 NAH-F和 NAH-R[11],反應(yīng)體系為 50μL:25μL r-Taq (TAKARA),模板 DNA 1μL,引物(10μmol/L)各1μL,ddH2O 22μL.PCR 程序如下:95℃預(yù)變性10min;95℃變性 1min,49℃退火 1min,72℃延伸2min,30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10min.采用藍(lán)白斑和菌落PCR篩選含有目的基因的單克隆.將含有ndo基因片段的71個(gè)克隆子送往北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)公司測(cè)序,構(gòu)建克隆文庫(kù).采用Mega4.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,構(gòu)建方法為Neighborjoining.

1.6 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建

參考Cebron等[12]方法構(gòu)建2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒,分別為目標(biāo)基因ndo和內(nèi)參基因16S rDNA.從ndo基因的克隆文庫(kù)中挑選覆蓋率最大的單克隆擴(kuò)大再培養(yǎng)后提取質(zhì)粒.利用 NanoDrop分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒的質(zhì)量濃度(單位為ng/μL)后,計(jì)算質(zhì)粒的拷貝數(shù),將該質(zhì)粒按10的比例逐級(jí)稀釋10個(gè)梯度,分裝后-20℃保存.

內(nèi)參基因16S rDNA采用E.coli DH5α構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒,構(gòu)建方法參考 ndo基因.擴(kuò)增引物為968f和 1401r[13].PCR 體系:25μL r-Taq,模板DNA1μL, 引物各1μL,ddH2O 22μL.PCR程序:95℃預(yù)變性 5min,94℃變性1min,56℃退火 45s,72℃延伸 1min,30個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10min.將含16S rDNA基因片段的克隆子3個(gè)送出測(cè)序.測(cè)序結(jié)果與E.coli DH5α菌株的16S rRNA基因的對(duì)應(yīng)位置序列一致即可用做標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建.

1.7 目標(biāo)基因ndo拷貝數(shù)的檢測(cè)

提取和純化:采用TRIZOL方法提取總RNA.參考說(shuō)明書,采用DNaseI(TAKARA)去除總RNA中的基因組DNA.純化后的總RNA同時(shí)采用1% Agarose電泳(120V,30min)和Nanodrop檢測(cè).

反轉(zhuǎn)錄和檢測(cè):反轉(zhuǎn)錄后的 RNA,采用real-time PCR在同一批次中測(cè)定同一樣品中的ndo和16S rRNA基因的絕對(duì)拷貝數(shù).同時(shí)設(shè)空白對(duì)照并做標(biāo)準(zhǔn)曲線.目標(biāo)基因 ndo的 Real-time PCR的反應(yīng)體系為:SYBR?Premix Ex TaqTM10μL,上下游引物各0.6μL,反轉(zhuǎn)錄的cDNA 1μL,雙蒸水 7.8μL.反應(yīng)程序如下:1個(gè)循環(huán):95℃, 30s;40 個(gè)循環(huán):95℃,1min,47℃,1min,72℃, 2min(收集熒光);熔解曲線的過(guò)程為:95℃,1min,從60℃開始每30s溫度升高0.5℃,總共進(jìn)行71個(gè)循環(huán),結(jié)束溫度為95℃,反應(yīng)結(jié)束之后4℃保存.內(nèi)參基因16S rRNA Real-time PCR的反應(yīng)體系為:SYBR?Premix Ex TaqTM10μL,上下游引物各0.4μL,反 轉(zhuǎn) 錄 的 cDNA 1μL,雙 蒸 水8.2μL.Real-time PCR 反應(yīng)程序如下:1個(gè)循環(huán):95℃,30s;50個(gè)循環(huán):95℃,30s,56℃,30s,72℃, 30s(收集熒光);熔解曲線的過(guò)程同ndo基因.參考Praffl[14]的方法,用同一樣品中的 ndo和 16S rRNA絕對(duì)拷貝數(shù)的比值作為ndo的相對(duì)表達(dá)量.采用方差分析real-time PCR結(jié)果的差異性(n＝3,P＝0.05), Student-Newman-Keuls (SNK)法用于檢驗(yàn)一組數(shù)據(jù)間的差異.方差分析和SNK檢驗(yàn)均采用SPSS軟件.

2 結(jié)果與分析

2.1 生長(zhǎng)曲線和降解曲線

圖1 初始菲濃度100mg/L,不同鹽度下菲的降解和菌群的生長(zhǎng)曲線Fig.1 The biodegradation and growth curve of the bacterial consortium growing with 100mg/L phenanthrene at different salinity

本文從勝利油田富集了一個(gè)中度嗜鹽菌群,16S rRNA PCR-DGGE技術(shù)解析結(jié)果表明優(yōu)勢(shì)菌屬與Halomonas, Alcanivorax, Marinobacter , Idiomarina和 Martelella 這些嗜鹽菌屬相似度最高(＞96%),另外還有不可培養(yǎng)細(xì)菌(數(shù)據(jù)未發(fā)表).圖1表明,該菌群的生長(zhǎng)過(guò)程包括遲滯期、對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期.在菲初始濃度為 100mg/L,10%鹽度下,經(jīng)過(guò)1d的遲滯期,菌群進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,到第4d菌群進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期.在20%鹽度下,遲滯期延長(zhǎng)到3d,菌群在第4d進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,第9d進(jìn)入穩(wěn)定期.鹽度從10%增加到20%,對(duì)數(shù)期間菌群的生長(zhǎng)速率由 0.051d－1(R2=0.978)降低到0.028d－1(R2=0.972),菌群的生物量分別增加了0.198和0.207.

在遲滯期,菲的濃度略有下降,這可能是由微生物細(xì)胞對(duì)菲的降解或細(xì)胞膜對(duì)菲的吸附引起的[15].在對(duì)數(shù)期,10%和 20%鹽度下,菲的降解動(dòng)力學(xué)呈線性關(guān)系,動(dòng)力學(xué)方程分別是 y=-27.39x+ 105.8(R2=0.978)和 y=-13.96x+127.0 (R2=0.965),平均降解速率分別是 27.39,13.96mg/(L·d).菲分別在6d內(nèi)被降解了98.9%,9d內(nèi)被降解了97.6%.表明鹽度從10%增加到20%,中度嗜鹽菌群需要更長(zhǎng)時(shí)間適應(yīng)環(huán)境,降解速率和生長(zhǎng)速率均受到抑制.

2.2 溶解菲濃度的變化

圖2 10%和20%鹽度下菌群降解100mg/L菲過(guò)程中溶解菲濃度的變化曲線Fig.2 The evolution of dissoluble phenanthrene concentration during biodegration at 10% and 20% salinity

由圖2可見(jiàn),鹽度由10%升高到20%,初始溶解菲的濃度由1.13mg/L降低到1.06mg/L.這是因?yàn)殡S著鹽度升高,菲的溶解度降低.在菌群生長(zhǎng)的遲滯期和對(duì)數(shù)期,初始溶解菲的濃度在10%鹽度和20%鹽度下分別增加了30%和49%,且溶解菲的動(dòng)態(tài)變化均符合一級(jí)動(dòng)力學(xué),擬合方程為y = 0.235ln(x+1)+1.064(R2= 0.924)和y＝0.330ln (x+1) +1.064 (R2=0.970).Reddy等[9]研究短芽孢桿菌PDM-3對(duì)菲的降解,發(fā)現(xiàn)菌株在降解過(guò)程中產(chǎn)生糖脂類的表面活性劑,通過(guò)結(jié)合分析上清液的表面張力、乳化指數(shù)EI24和菲的降解過(guò)程,推測(cè)所研究的菌株在利用水溶性的菲的同時(shí)向細(xì)胞外分泌了表面活性劑,而表面活性劑進(jìn)一步促進(jìn)菲的溶解,提高菲的溶解度,進(jìn)而加強(qiáng)菲的生物可利用度.同樣,本研究中溶解菲的濃度在菌群生長(zhǎng)過(guò)程中呈緩慢增加的趨勢(shì),但單因素方差分析(n=3,P＞0.05)表明對(duì)數(shù)期溶解菲濃度在10%和20%鹽度下沒(méi)有顯著差異,表明一定范圍的鹽度不會(huì)影響菌群降解過(guò)程中菲的生物可利用度.

2.3 Ndo基因多樣

Ndo(萘雙加氧酶基因)是編碼催化PAHs降解起始步驟的多環(huán)芳烴雙氧酶基因[16],它的種類和活性直接影響生物降解的速率.因此,本文構(gòu)建了中度嗜鹽菌群的 ndo基因文庫(kù),并進(jìn)一步研究了菌群ndo基因的多樣性以及降解過(guò)程中鹽度對(duì)其表達(dá)的影響.在測(cè)序的71個(gè)含有ndo基因的克隆子中,序列比對(duì)表明僅有 1個(gè)克隆子與 GenBank中等位基因相似度低于 50%,可能由擴(kuò)增錯(cuò)誤引起.按照1個(gè)氨基酸序列的差異將70個(gè)克隆子分為6個(gè)OUT(代表1個(gè)基因型),克隆文庫(kù)的覆蓋率達(dá)到 90%.每個(gè)基因型挑選一個(gè)氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3).從圖3可以看出,該中度嗜鹽菌群中ndo基因均為nah-like基因.其中,序列A,B和 C與菌株 Pseudomonas aeruginosa Pak1和Pseudomonas stutzeri AN10中的經(jīng)典nah-like基因最相似,相似度達(dá)到89%.A,B和C之間的兩兩相似度高于97.3%.序列A,B和C為主要基因型,占總克隆子 92.7%,并且單獨(dú)聚為一類,表明 A,B和 C有可能是新的萘雙加氧酶基因.一些海洋菌中 ndo基因的同源性分析也表明其與菌株P(guān)seudomonas stutzeri AN10和Pseudomonas sp. C18中nah-like基因最相似[17-18].

2.4 降解過(guò)程中ndo基因的表達(dá)規(guī)律

本研究表明菌群中主要基因型序列 A、B和C的相似度大于97.3%,為經(jīng)典nah-like基因(豐度超過(guò)92.7%),因此,本研究以該ndo基因?yàn)槟繕?biāo)基因,利用Real-time PCR實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)該基因在降解過(guò)程中表達(dá)量的變化.由圖 4可以看出,在10%和20%鹽度下,相對(duì)菌群初始基因表達(dá)水平,ndo的表達(dá)量均在遲滯期降低1個(gè)數(shù)量級(jí),在對(duì)數(shù)期增加1個(gè)數(shù)量級(jí),到穩(wěn)定期時(shí)增加了約2個(gè)數(shù)量級(jí).Pearson相關(guān)性分析表明 ndo基因表達(dá)量與溶解菲的濃度正相關(guān)(P=0.05,雙邊檢驗(yàn),R2＝0.712).可見(jiàn),高濃度菲在初始階段可能抑制ndo基因的表達(dá),經(jīng)過(guò)一段遲滯期后,ndo基因的表達(dá)量會(huì)被溶解菲誘導(dǎo)而逐漸升高.同時(shí),在對(duì)數(shù)期ndo基因表達(dá)量與總菲濃度呈負(fù)線性相關(guān)(圖 5),這說(shuō)明,在總菲濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)菲溶解度的條件下,即使是固態(tài)菲也可能對(duì)菌群功能基因的表達(dá)產(chǎn)生抑制作用.在相同生長(zhǎng)時(shí)間,菌群ndo的表達(dá)量在10%鹽度下比20%鹽度下高,表明鹽度升高同樣可能抑制功能基因的表達(dá),降解速率的測(cè)定結(jié)果也表明了高鹽度對(duì)降解有明顯抑制作用.即使在對(duì)數(shù)期,ndo表達(dá)量與降解速率也不存在相關(guān)性,可能是由于功能基因的表達(dá)量只能精確指示翻譯過(guò)程中操縱子的起始轉(zhuǎn)錄水平,不會(huì)必然反映降解酶的活性和數(shù)量[19];另一方面,降解酶的活性和數(shù)量也可能只是影響生物降解速率的一個(gè)主要因素,同時(shí)還可能存在其他影響因素.

圖3 根據(jù)菌群ndo基因克隆文庫(kù)的70個(gè)氨基酸序列(110殘基)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on the analysis of the 70 deduced amino acid sequences (110 residues) of the amplified ndo gene fragments in the clone libraries

3 討論

本研究中,在嗜鹽菌群降解菲的過(guò)程中菌群ndo基因的絕對(duì)拷貝數(shù)與16S rRNA基因絕對(duì)拷貝數(shù)的比值保持在10-6和10-4之間波動(dòng).Cebron等[12]研究土壤和沉積物中 PAH-環(huán)羥基化雙加氧酶基因(PAH-RHDα)的擴(kuò)增和定量的特異性和準(zhǔn)確性,在基因組水平上,PAH-RHDα與 16S rRNA基因的比值在PAHs污染水平高的樣品中波動(dòng)范圍是1×10-5到9.22×10-3,比無(wú)PAHs污染的樣品至少高 1個(gè)數(shù)量級(jí)[12].采用 2-ΔΔCT方法計(jì)算添加蚯蚓糞的PAHs污染土壤中ndo相對(duì)表達(dá)量,結(jié)果表明經(jīng)過(guò)1個(gè)月的孵化后ndo的拷貝數(shù)增加了2～3個(gè)數(shù)量級(jí)[20].雖然由于分析方法和樣品不同,功能基因的相對(duì)表達(dá)量并不適合與其他研究比較.但是,這些數(shù)據(jù)的大小和波動(dòng)范圍與本文檢測(cè)結(jié)果一致.

圖4 10%和20%鹽度下,100mg/L菲降解過(guò)程中菌群ndo的表達(dá)Fig.4 The expression of ndo genes in the bacterial consortiums growing at 10% and 20% salinity with 100mg/L phenanthrene

圖5 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)菌群ndo基因的表達(dá)量與總菲濃度的關(guān)系Fig.5 The correlations between total phenanthrene concentration and ndo gene expression in the bacterial consortium growing at 10% and 20% salinity with 100mg/L phenanthrene at logarithmic phase

基因的表達(dá)量與微生物生理狀態(tài)、外界環(huán)境、有毒中間代謝產(chǎn)物的積累、基因調(diào)控方式等有著密切而復(fù)雜的聯(lián)系.Corbella等[19]分析了 2株 純 菌 銅 綠 假 單 胞 菌 株 (Pseudomonas aeruginosa) 142和JB2的上、下游關(guān)鍵降解基因ohbA和hybA分別在遲滯期末期和穩(wěn)定期基因表達(dá)量的比值,結(jié)果發(fā)現(xiàn)2個(gè)基因表達(dá)量在不同生長(zhǎng)階段的平均比值分別為 1.17±0.9和 0.07± 0.02.Marlowe等[21]則發(fā)現(xiàn)表面活性劑可以影響菲的降解速率和萘雙加氧酶基因(nahAc)的表達(dá)量,在有表面活性劑時(shí)nahAc表達(dá)呈雙峰模式.從這些研究可以看出,降解基因的調(diào)控是精致的,不同菌屬的不同功能的基因表達(dá)規(guī)律不同,并同時(shí)受很多環(huán)境因素的影響.本研究發(fā)現(xiàn)混合菌群的降解基因表達(dá)量的變化趨勢(shì)與 Corbella等[19]在純菌中的觀察到的結(jié)果相似,都是在遲滯期降低,對(duì)數(shù)期升高,穩(wěn)定期持續(xù)升高,說(shuō)明當(dāng)環(huán)境因素變化時(shí),降解微生物會(huì)從最初的受抑制到適應(yīng)再到響應(yīng)(如通過(guò)改變降解酶表達(dá)量及調(diào)控模式)形成應(yīng)付環(huán)境變化的生存能力,這可能是一種環(huán)境(以混合菌群為主)中較為普遍的現(xiàn)象.

在鹽度和污染物濃度的影響面,Minai-Tehrani等[22]在研究0～5%NaCl鹽度對(duì)PAHs降解的影響時(shí),發(fā)現(xiàn)鹽度增加會(huì)降低土壤中石油和PAHs的降解速率.Zhao等[8]則發(fā)現(xiàn)在 10%鹽度下從石油土壤中富集的中度嗜鹽菌群在 20%鹽度下基本喪失了降解菲的能力.本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為明確地表明了高濃度污染物和鹽度均可能抑制ndo基因的表達(dá)和生物降解速率.一般認(rèn)為鹽度對(duì)生物降解可能有雙重影響:一方面,鹽度可以通過(guò)滲透壓等因素影響微生物的生理活性;另一方面,鹽度會(huì)降低污染物的可溶解性從而影響污染物的生物可利用度.本研究發(fā)現(xiàn),在一定的范圍內(nèi),鹽度的增加確實(shí)降低了菌群生物降解活性,但對(duì)污染物的生物可利用度并沒(méi)有顯著的影響,反而發(fā)現(xiàn)固態(tài)的污染物對(duì)降解酶基因的表達(dá)有抑制作用.Di Gennaro等[20]發(fā)現(xiàn)萘污染土壤中低污染水平(10μg/g)比高污染(100μg/g)下ndo基因表達(dá)量高,這與本研究發(fā)現(xiàn)在超過(guò)污染物飽和溶解度情況下,關(guān)鍵降解酶基因ndo的表達(dá)量與總菲濃度負(fù)相關(guān)的結(jié)果一致.當(dāng)鹽度從 10%升高到20%,ndo的表達(dá)量降低了.但10%和20%鹽度下溶解菲的濃度并沒(méi)有顯著差異,說(shuō)明鹽度可能是通過(guò)影響其它因素而不是誘導(dǎo)底物的濃度抑制ndo基因的表達(dá).因此,功能基因ndo的表達(dá)調(diào)控可能受底物的誘導(dǎo)和其它因素的共同作用.此外,普遍認(rèn)為關(guān)鍵降解酶基因表達(dá)量能夠反映生物降解本質(zhì),并能指示生物降解效率和潛能.但是在本研究條件下,關(guān)鍵功能基因的表達(dá)量與生物降解速率沒(méi)有明顯的相關(guān)性.因此,在復(fù)雜環(huán)境條件下以及復(fù)合微生物菌群中,如何使用功能基因表達(dá)量來(lái)反映生物降解的本質(zhì),指示生物降解的效率還需要進(jìn)一步探討,而鹽度對(duì)生物降解的影響機(jī)制仍需要深入研究.

4 結(jié)論

4.1 從石油烴污染鹽堿土壤中富集出一個(gè)中度嗜鹽菌群,該菌群有6種ndo基因型,均與nah-like基因最相似.其中 3種主要基因型(占總克隆子92.7%)單獨(dú)聚為一類,與菌株 Pseudomonas aeruginosa Pak1和Pseudomonas stutzeri AN10中的經(jīng)典nah-like基因最相似,相似度達(dá)到89%.

4.2 溶解菲的濃度在菌群生長(zhǎng)過(guò)程中呈增加的趨勢(shì).單因素方差分析(n=3,P＞0.05)表明溶解菲濃度在10%和20%鹽度下沒(méi)有顯著差異,表明一定范圍的鹽度不會(huì)影響菌群降解過(guò)程中菲的溶解度.Ndo基因的表達(dá)量在降解過(guò)程中呈先降低后隨溶解菲濃度升高而升高的趨勢(shì),表明高濃度菲在初始階段可能抑制ndo基因的表達(dá),經(jīng)過(guò)一段遲滯期后,ndo基因的表達(dá)量會(huì)被溶解菲誘導(dǎo)而逐漸升高.鹽度由10%升高到20%,ndo基因表達(dá)量降低,但溶解菲濃度沒(méi)有顯著差異,說(shuō)明鹽度可能通過(guò)影響其它因素而不是誘導(dǎo)底物的濃度抑制ndo基因表達(dá).

4.3 在 10%和 20%鹽度下,嗜鹽菌群分別在 6d內(nèi)和9d內(nèi)降解了97.6%菲,相應(yīng)的菌群生長(zhǎng)的遲滯期由 1d延長(zhǎng)為 3d,表明鹽度升高會(huì)抑制菌群的生長(zhǎng)速率和菌群對(duì)菲的降解速率.

[1] Santodonato J. Review of the estrogenic and antiestrogenic activity of polycyclic aromatic hydrocarbons: relationship to carcinogenicity [J]. Chemosphere, 1997,34(4):835-848.

[2] Diaz M P, Boyd K G, Grigon S J, et al. Biodegradation of crude oil across a wide range of salinities by an extremely halotolerant bacterial consortium MPD-M, immobilized onto polypropylene fibers [J]. Biotechnology and Bioengineering, 2002,79(2):145-153.

[3] Kleinsteuber S, Riis V, Fetzer I, et al. Population dynamics within a microbial consortium during growth on diesel fuel in saline environments [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2006,72(5):3531-3542.

[4] Margesin R, Schinner F. Biodegradation and bioremediation of hydrocarbons in extreme environments [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2001,56(5/6):650-663.

[5] Riis V, Kleinsteuber S, Babel W. Influence of high salinities on the degradation of diesel fuel by bacterial consortia [J]. Canadian Journal of Microbiology, 2003,49(11):713-721.

[6] Nicholson C A, Fathepure B Z. Aerobic biodegradation of benzene and toluene under hypersaline conditions at the Great Salt Plains, Oklahoma [J]. FEMS Microbiology Letters, 2005, 245(2):257-262.

[7] Tremblay L, Kohl S D, Rice J A, et al. Effects of temperature, salinity, and dissolved humic substances on the sorption of polycyclic aromatic hydrocarbons to estuarine particles [J]. Marine Chemistry, 2005,96(12):21-34.

[8] Zhao B, Wang H, Mao X, et al. Biodegradation of phenanthrene by a halophilic bacterial consortium under aerobic conditions [J]. Current Microbiology, 2009,58(3):205-210.

[9] Reddy M S, Naresh B, Leela T, et al. Biodegradation of phenanthrene with biosurfactant production by a new strain of Brevibacillus sp. [J]. Bioresource Technology, 2010,101: 7980-7983

[10] Story S P, Kline E L, Hughes T A, et al. Degradation of aromatic hydrocarbons by Sphingomonas paucimobilis strain EPA505 [J]. Archives of Environmental Contamination and Toxicology, 2004,47(2):168-176.

[11] Baldwin B R, Nakatsu C H, Nies L. Detection and enumeration of aromatic oxygenase genes by multiplex and real-time PCR [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2003,69(6):3350-3358.

[12] Cebron A, Norini M P, Beguiristain T, et al. Real-Time PCR quantification of PAH-ring hydroxylating dioxygenase (PAH-RHDalpha) genes from Gram positive and Gram negative bacteria in soil and sediment samples [J]. Journal of Microbiological Methods, 2008,73(2):148-159.

[13] Felske A, Akkermans A D L, DE VOS W M. Quantification of 16S rRNAs in complex bacterial communities by multiple competitive reverse transcription PCR in temperature gradient gel electrophoresis fingerprints [J]. Applied and Environmental Microbiology, 1998,64(11):4581-4587.

[14] Pfaffl M W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR [J]. Nucleic Acids Research, 2001,29(9): 2002-2007.

[15] Tian L, Ma P, Zhong J J. Kinetics and key enzyme activities of phenanthrene degradation by Pseudomonas mendocina [J]. Process Biochemistry, 2002,37(12):1431-1437.

[16] Habe H, Omori T. Genetics of polycyclic aromatic hydrocarbon metabolism in diverse aerobic bacteria [J]. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2003,67(2):225-243.

[17] Ferrero M, Llobet-brossa E, Lalucat J, et al. Coexistence of two distinct copies of naphthalene degradation genes in Pseudomonas strains isolated from the western Mediterranean region [J]. Applied Environmental Microbiology, 2002,68(2):957-962.

[18] Hedlund B P, Geiselbrecht A D, Staley J T. Marinobacter strain NCE312 has a Pseudomonas-like naphthalene dioxygenase [J]. FEMS Microbiology Letters, 2001,201(1):47-51.

[19] Corbella M E, Puyet A. Real-time reverse transcription-PCR analysis of expression of halobenzoate and salicylate catabolism-associated operons in two strains of Pseudomonas aeruginosa [J]. Applied Environmental Microbiology, 2003,69(4): 2269-2275.

[20] Di Gennaro P, Moreno B, Annoni E, et al. Dynamic changes in bacterial community structure and in naphthalene dioxygenase expression in vermicompost-amended PAH-contaminated soils [J]. Journal of Hazardous Materiais, 2009,172(23):1464-1469.

[21] Marlowe E M, Wang J M, Pepper I L, et al. Application of a reverse transcription-PCR assay to monitor regulation of the catabolic nahAc gene during phenanthrene degradation [J]. Biodegradation, 2002,13(4):251-260.

[22] Minai-tehrani D, Minoui S, Herfatmanesh A. Effect of salinity on biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) of heavy crude oil in soil [J]. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 2009,82(2):179-184.

Phenanthrene biodegradation and dynamic change of expression of naphthalene dioxygenase (ndo) genes in a halophilic bacteria consortium.

HE Fen1, WANG Li-hua2, NING Da-liang1, GUO Guang1, WANG Hui1*(1.School of Environment, Tsinghua University, Beijing 100084, China；2.Institute of Applied Chemistry, Hebei North University, Zhangjiakou 075000, China). China Environmental Science, 2012,32(9)：1662～1669

A halophilic bacterial consortium capable of degrading phenanthrene was developed from Shengli Oilfield in China. The diversity of naphthalene dioxygenase (ndo) genes in the bacterial consortium was analyzed by the method of clone library. Consortium consist of six nah-like genes. Three of them (covered 92.7% of the total clones) related to the classic nah-like genes with identity of about 89%. Using real-time reverse transcription PCR and other techniques, this study investigated the dynamic expression of ndo genes, biodegradation rate, biomass and bioavailability of phenanthrene in bacterial consortium growing at different salinities. As the salinity increased from 10% to 20%, the lag phase increased from 1 day to 3 days, the time needed for degrading 100mg/L phenanthrene increased from 6 days to 9 days. Both of the dissolved phenanthrene concentrations at 10% and 20% salinity increased constantly during the biodegradation, and One-way ANOVA(n=3, P＞0.05) analysis showed there were no significant difference between them. A certain range of salinity probably not affected the bioavailability of phenanthrene. The expression of ndo genes at 20% salinity was lower than that at 10% salinity, while both of them decreased at the lag phase, and then increased constantly. Increasing salinity and high concentration of phenanthrene inhibited the expression of ndo genes.

halophilic bacteria consortium；gene expression；bioavailability；solubility of phenanthrene；naphthalene dioxygenase gene

2012-02-18

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30970098)

* 責(zé)任作者, 教授, wanghui@mail.tsinghua.edu.cn

X172

A

1000-6923(2012)09-1662-08

何 芬(1987-),女,湖北武漢人,清華大學(xué)環(huán)境學(xué)院碩士研究生,研究方向?yàn)樯镄迯?fù).發(fā)表論文3篇.