黃小蘭,陳建耀,周世寧,謝麗純,楊雪韻,蔣華波,董林垚 (1.江西師范大學地理與環(huán)境學院,鄱陽湖濕地與流域研究教育部重點實驗室,江西 南昌 00；.中山大學地理科學與規(guī)劃學院,廣東 廣州 51075；.中山大學生命科學學院,廣東 廣州 51075)

小流域地下水與地表水微生物組成結構差異及其成因分析

黃小蘭1,2,陳建耀2*,周世寧3,謝麗純2,楊雪韻2,蔣華波2,董林垚2(1.江西師范大學地理與環(huán)境學院,鄱陽湖濕地與流域研究教育部重點實驗室,江西 南昌 330022；2.中山大學地理科學與規(guī)劃學院,廣東 廣州 510275；3.中山大學生命科學學院,廣東 廣州 510275)

對中山大學濱海水循環(huán)綜合試驗基地的河道水和地下水進行采樣,運用16S rRNA基因分析方法,研究微生物的群落組成、結構,同時,通過Mothur軟件分析不同采樣點的系統(tǒng)發(fā)育多樣性和文庫稀釋曲線.結果表明,上下游河道水和地下水均以變形菌(Proteobacteria),厚壁菌(Firmicutes),古菌(Archaea)為優(yōu)勢種群,變形菌在上游堰、下游堰、R1、R2、R3分別占各自總數的29.7%、30.3%、28.1%、20.9%、14.2%;厚壁菌在上游堰、下游堰、R1、R2、R3分別占各自總數的9.7%、20.3%、19.8%、8.6%、39.6%;古菌(不可培養(yǎng)的泉古菌和廣古菌)在上游堰、下游堰、R1、R2、R3分別占各自總數的14.2%、12.3%、11.7%、12.1%、3.5%.表明地下水、地表水微生物組成結構有一定的趨同性.另一方面,酸桿菌(Acidobacteria)、硝化螺旋菌(Nitrospira)、擬桿菌(Bacteroidetes) 和Candidate division OPx等在不同采樣點的豐度各異,不同埋藏條件下的地下水和地表水多樣性指數與稀釋曲線有所不同,揭示小流域的微生物組成、結構具有空間差異.研究顯示,受周圍水文地質條件、補給差異等影響,微生物種群隨之演化,微生物特征與水文地質、化學離子密切相關.

小流域；地下水；地表水；微生物；差異；成因

地表水-地下水的相互作用在全球水循環(huán)中發(fā)揮著重要的作用.國內外學者在地表水與地下水的相互作用[1-2]的研究取得了顯著成果,隨著多學科方法的綜合應用及交叉研究的加強,微生物-水-巖相互作用成為區(qū)域地下水地球化學研究的熱點,其中物理、化學、生物的耦合作用尤為重要[3].當前地表-地下水的相互作用幾乎涵蓋了水循環(huán)過程中降雨[4]、截留[5]、蒸發(fā)[6]、下滲[7]等數學模擬和物理過程,以及滲濾作用[8]、污染物遷移[9]、氯氟烴(CFCs)測年[10]等化學過程,而生物過程研究的內容主要出現在綜述性文章或者針對某種污染的生物修復[11]方面,原位地表水與地下水相互作用的生物過程研究則較少且偏宏觀[12].基于此,本研究從微生物的角度出發(fā),通過小流域地下水與地表水微生物組成結構差異及其成因分析,研究地表-地下水微生物分布特征與水文地質、化學離子之間的協(xié)同聯(lián)系,探討華南濱?；◢弾r小流域地下水與河道地表水的交互、演化和環(huán)境作用,以期為流域水資源規(guī)劃、生物多樣性和流域生態(tài)系統(tǒng)管理等研究提供參考.

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

珠海市位于北緯21°48′～22°27′、東經113°03′～114°19′.年降水量 1770～2300mm,屬亞熱帶季風氣候區(qū),海洋對本地氣候的調節(jié)作用十分明顯.選擇位于珠海市區(qū)的中山大學濱海水循環(huán)綜合試驗基地為研究對象,基地以雨水、地表水、土壤水、地下水、海水的水分相互轉化與物質遷移為理論框架,設立了相關的試驗觀測設施,整個試驗設施分空中、地表、地下3大模塊,本研究對象的地表模塊為試驗小流域的上游堰和下游堰(表1,圖 1),其基巖類型為強風化花崗巖,土壤主要是花崗巖風化土壤,土壤厚度 0～3m,該流域的地質特點在珠江三角洲濱海地區(qū)十分典型[13];地下模塊為R1～R3觀測井(表1,圖1),根據陜西工程勘察研究院的實地鉆探結果,R井組自上而下垂向分布有第四系全新統(tǒng)海陸交互相沉積層(Q4mc)、燕山期花崗巖(γ52),地下水為上層潛水和承壓基巖裂隙水.校區(qū)內地下水主要受大氣降水、地下徑流補給與附近地表水體滲透補給,以蒸發(fā)及地下水徑流的方式排泄,研究區(qū)上游堰和下游堰平均流速3～5m/s,地下水流速介于110～132m/a之間.采樣時間在2010年6月大雨過后,屬雨季.

圖1 河水-地下水水力聯(lián)系概念Fig.1 The water power correlation conception diagraph between river water and groundwater

1.2 研究方法

野外調研與實驗室分析相結合.野外采樣點現場采用GPS定位,用Horiba EC/pH計即時測量水電導率(EC)和pH值等(表1);實驗室分析先在現場用無菌聚乙烯瓶采集水樣 2L/井,隨即經0.8μm和0.22μm濾膜2級過濾,濾后的水樣保存好送實驗室進行化學離子分析,將 0.22μm濾膜放入消毒后的冷凍存管中,于冰盒中保存,當天運回實驗室-20℃以下冰存.

實驗室分析方面,采用酸堿滴定法輔以儀器設備分析主要化學組成成分(Ca2+、Mg2+、K+、Na+、Cl-、CO3-、SO42-、HC、Sidiss),然后用GW-Chart軟件作出Piper圖進行徑流不同采樣點的化學組成比較;同時,運用16S rRNA基因分析方法[14-15]檢測地下水與河道地表水的微生物種群,即首先采取改進的玻璃微珠法[16]提取水樣微生物總DNA,利用美國OMEGA公司膠回收試劑盒純化,置于-20℃保存?zhèn)溆?隨后按以下步驟進行實驗:(1)PCR(聚合酶鏈式反應)擴增(擴增采用的引物見表 2):原核類群 PCR反應過程為94℃變性4min,然后94℃,45s,52～55℃ 45s,72℃1min循環(huán)30次,72℃延伸10min;古菌PCR反應過程為 94℃變性 4min,94℃ 1min,50～60℃1min,72℃ 1min循環(huán) 26次,72℃延伸 10min. (2)PCR產物克隆及RFLP(限制性片斷長度多態(tài)性)分析:以2μL陽性克隆的菌落PCR產物為模板,分別選用RsaI(GT’ AC)和MspI(C’ CGG) 2種內切酶對 DNA沉淀進行完全酶切,酶切產物用3%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,分析不同陽性克隆所產生的PCR產物經酶切后的譜型,相同的譜型作為一個OTU,將具有不同譜型的克隆子送上海生工生物技術公司完成序列測定.(3)通過BLAST 程序將測序結果輸入 GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中進行序列相似性比對分析,通過Mothur和Excel軟件生成物種多樣性指數和稀釋曲線.

表1 樣本基本信息Table 1 Basic information of the samples

表2 PCR擴增采用的引物[17-19]Table 2 Primers used for PCR

2 結果與討論

水樣微生物 16S rDNA的部分序列在Genbank核苷酸數據庫中接受號為 HQ596988-HQ597006(網址為 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ nuccore/HQ596988- HQ597006).

2.1 微生物種群與多樣性

2.1.1 微生物優(yōu)勢種群 數理統(tǒng)計分析中,按占測序總數 5%以上[20]的同類微生物確定為優(yōu)勢種群(表3),試驗流域河道水和R井組地下水的微生物均以變形菌門(Proteobacteria),厚壁菌門(Firmicutes),古菌(Archaea)為優(yōu)勢種群,但同為優(yōu)勢群的變形菌門(Proteobacteria),在上游堰分布以α、 β、δ-proteobacteria為優(yōu)勢種群;在下游堰分布以γ、α、β-proteobacteria為優(yōu)勢種群;R1以 α、β、γ-proteobacteria 為 優(yōu) 勢 種 群 ;R2 以 β、δ-proteobacteria為優(yōu)勢種群;R3以 γ、βproteobacteria為優(yōu)勢種群;Archaea除R3外,其余4個水樣均屬優(yōu)勢微生物種群.Candidate division OPx(Candidate division OP3、OP8、OP11等總稱為OPx,x為數字)在上游堰、下游堰、R2井水樣中大量存在,而R1和R3井中卻沒有發(fā)現.硝化螺旋菌(Nitrospirae)在R2和R3井有,而在R1井沒有檢測出,相應地,反硝化細菌(Denitrifying bacterium)在R2和R3井中也有少量存在.藍細菌在R2、下游堰、上游堰均有分布,而R1和R3井沒有發(fā)現.

表3 樣本優(yōu)勢微生物種群Table 3 Predominant microbial population of the samples

圖2 各樣點的微生物聚類分析Fig.2 Cluster analysis of Ur, Ds, R1, R2, R3

用MOTHUR軟件的UPGMA算法對微生物種群進行聚類分析(圖2),從UPGMA樹看出,上游堰河道水與R2地下水之間關系較密切,下游堰與R1關系較近,而R3單獨一枝,說明13.2m深的地下水微生物與其他4個樣點之間的差異更為明顯.

系統(tǒng)發(fā)育多樣性分析運用MOTHUR軟件分析5個采樣點的系統(tǒng)發(fā)育多樣性(圖3),并生成16S rDNA克隆文庫的稀釋曲線(圖4).

圖3 河道水和地下水的系統(tǒng)發(fā)育多樣性分析Fig.3 The richness/diversity estimators from groundwater and surface water samples

結果表明,上游堰、下游堰和R2井水樣的香農指數(Shannon)大于R1、R3井,Simpson、Chao1和 Ace指數也驗證了前者的微生物多樣性指數高于后者.

圖4 16S rDNA克隆文庫的稀釋曲線Fig.4 The rarefaction curves from groundwater and surface water samples

當克隆文庫的稀釋曲線趨于平緩或者趨近平臺期時,就可以認為文庫的庫容已經足夠[21]. R3井和R1井的16S rDNA克隆文庫的稀釋曲線首先趨于平緩,說明R3井和R1井的多樣性指數雖然較低,但文庫已基本能夠代表樣品中微生物的多樣性.理論上,R1井樣品來自淺層非承壓含水層,與地表非飽和帶聯(lián)系密切,受地表水(河道)與雨水補給,可供微生物生長繁殖的營養(yǎng)物豐足,因而 R1井水的微生物多樣性指數應該也較高,其主要微生物種群與河道水基本一致,只是各種群的豐度稍有差異,這在本次采樣分析的前1次采樣結果中已有驗證(圖 5).本次實驗結果出現R1井水微生物多樣性指數低的原因可能是現場過濾水樣時耗費時間稍長,導致優(yōu)勢微生物生長過快而抑制了其他微生物的檢出.

2.2 成因分析

2.2.1 水文地質成因 一方面,地下水、地表水微生物組成結構有一定的趨同性;另一方面,受水文地質條件,補給差異等影響,各層微生物種群出現差異并體現地表-地下水之關聯(lián).R井組所監(jiān)測的地下水既包括潛水也包括承壓的基巖裂隙水,R1井地質構造以細砂為主,屬第四系全新統(tǒng)海陸交互相沉積層(Q4mc);R2井以中風化花崗巖為主,R3井以微風化花崗巖為主,為燕山期花崗巖(γ52).一般地,沉積層具有較豐富的有機質,其中所含的活性有機碳較高,可供微生物利用的物質也相對較高.林立虹等[22]在距地表2.8km深處巖石裂隙的水脈中,發(fā)現僅僅依靠地質作用產生的硫酸鹽、氫氣等能量而生存的微生物種群.R3觀測井打入基巖,由于細菌硫酸鹽還原作用(2CH2O+SO42?→H2S+2HCO3?)而富硫化氫,這種環(huán)境顯然不適合好氧微生物發(fā)展,在這缺氧的富硫化氫環(huán)境中,R3井水發(fā)現大量的Bacillus芽孢桿菌(屬于厚壁菌門 Firmicutes),芽胞是細菌在極端環(huán)境下產生的一種抗逆性強的構造,莢膜也是細菌在特殊環(huán)境下產生的一種可使細菌免受惡劣環(huán)境損傷的細菌附屬物[23],R3井為基巖裂隙水,其水量受補給源控制也不夠豐足,處于還原環(huán)境,在現場采水樣時有明顯的臭雞蛋味,因此在R3井水的分析結果中,各種芽孢桿菌占絕對優(yōu)勢,而其他微生物種群明顯少于另外 4個水樣.R2井表現一定的承壓與缺氧環(huán)境,相比而言,R2井水的微生物多樣性較豐富,可能與其含水層包涵更多的花崗巖風化破碎層因而與河道水聯(lián)通有關.

上游堰和下游堰的基巖類型為強風化花崗巖,土壤主要是花崗巖風化土壤,其河道水的補給源除地表徑流、壤中流之外,基流也是重要組成部分.曾松青等[24-25]利用同位素研究中山大學濱海水循環(huán)綜合試驗基地的花崗巖小流域,結果表明,基流占小流域全年徑流量的比例為 68%～74%.這與 Katsuyama等[26]發(fā)現一個花崗巖小流域的基巖地下水對河岸帶有大量的補給一致.因此,盡管采樣前下大雨,上游堰和下游堰河道水均有部分來自地下水.在微生物組成結構上,表現為上游堰河道水與 R2井水較為接近,均是古菌占最大優(yōu)勢,微生物香農指數也相近;下游堰河道水與 R1井水較為接近,均是厚壁菌門(Firmicutes)占最大優(yōu)勢,這從它們的水力聯(lián)系和地質構造上(圖 5)可得以解釋:上游堰與基巖風化殼(燕山期花崗巖(γ52))連通,R2井埋藏條件也主要為燕山期花崗巖風化殼(γ52);下游堰與第四系全新統(tǒng)海陸交互相沉積層(Q4mc)聯(lián)系密切,R1井埋藏條件也主要為第四系全新統(tǒng)海陸交互相沉積層(Q4mc),與微生物聚類結果一致.

對比分析試驗小組于 6月份實測上下游堰水位與R1～R3井水位變化資料(圖6),上游堰的水位變化幅度大,依次是下游堰、R1、R2、R3井.R1井埋藏條件為海陸交互相沉積層,與下游堰河床類似,水位變化幅度自然較大;R2井與R3井的主要差別在于前者包涵更多的花崗巖風化破碎層,而后者破碎層較少,但有一定裂隙發(fā)育.因而,河道水和R2井地下水比R3井地下水有更強的水力聯(lián)系;R3井地下水則比較平穩(wěn),受地表水影響較小.從時間來看,井水對河道水漲落無明顯的延遲,即地下水與河道水微生物的異同不受延遲影響.微生物分布方面,R2井Archaea為最優(yōu)勢種群,與上游堰一致,其余的優(yōu)勢種群如β-proteobacteria,Candidate division OPx, Firmicutes, δ-proteobacteria等,也與上游堰基本相同,但硝化細菌(Nitrospira)在R2井為優(yōu)勢微生物種群而在上游堰卻未發(fā)現,是因為硝化細菌大多數為專性化能自養(yǎng)型,只有少數為兼性自養(yǎng)型,大多數好氧,怕光.R1井Firmicutes為最優(yōu)勢種群,與下游堰一致,其他如 α, β, γ-proteobacteria、Archaea等也與下游堰基本類同,但R1井有優(yōu)勢種群酸桿菌(Acidobacteria)而下游堰只有少量酸桿菌存在,這與 R1井處于果園,與地表有較多的枯葉腐爛相關.R3井地下水處于還原環(huán)境,因而屬于厚壁菌門(Firmicutes)的各種芽孢桿菌占微生物總數的 39.6%,為絕對優(yōu)勢,其余優(yōu)勢種群γ-proteobacteria,β-proteobacteria,Nitrospira,Bacte roidetes所占比例明顯較少,處于5%～10%之間.

圖5 R1井地下水與河道水主要微生物種群Fig.5 Microbial communities of analyzed clones from R1 and surface water samples

圖6 地表水與地下水采樣點水位變化比較Fig.6 The comparing of water-level fluctuations between river water and groundwater

2.2.2 化學離子成因 地表地下水的微生物組 成、結構差異也表現與周邊環(huán)境的化學離子組成相適應,例如,硝化螺旋菌(Nitrospirae)在R2和R3井地下水中有,而在 R1井水中沒有檢測出,硝化螺旋菌對氮的硝化和亞硝酸鹽氧化起作用[27].原先R井所在位置有工人居住,受雞、鴨、羊等排泄物污染,但自 2009年始,中山大學珠海校區(qū)美化清潔校園環(huán)境,將果園的居民遷出,R井附近基本保持自然生態(tài)環(huán)境,最淺層井 R1由雨水和周邊地表水入滲補給后原污染物已慢慢稀釋和降解,R2和R3井為基巖裂隙水,原先雞、鴨等排泄污染物尚存留于基巖風化殼層中,因此,隨著周邊環(huán)境的日益變化,微生物組成、結構不斷地改變.

圖7 研究區(qū)地表水和地下水主要化學離子Piper圖Fig.7 Piper diagram for river water and groundwater in the Zhuhai Campus catchment

試驗流域基巖由單一的黑云母花崗巖組成,徑流的化學組成屬于Sidiss-Na+-HCO3?-Cl?型,以溶解Si、Na+、HCO3?和Cl-為主要成分,Ca2+、SO42?則變異系數較大[28],微生物種群中有少量硫酸鹽還原菌(sulfate-reducing bacterium)存在.在補給區(qū)R井組,地下水徑流條件較好,地下水在含水層中停留時間短,水交替迅速,含水層中易溶組分如Cl-、SO42-、Na+、K+等不斷被淋濾并由地下徑流帶走,離子以 Ca2+、HCO3-占優(yōu)勢,形成低礦化度的Ca2+- Na+-HCO3--Cl?型地下水,R井組地下水檢 測 出 屬 于 γ-proteobacteria 的 海 桿 菌(Marinobacter)和屬于β-proteobacteria的脫氯單胞菌屬(Dechloromonas),說明 R井組地下水有Na+、Cl?等離子循環(huán).高全洲等[29]研究表明,珠江三角洲濱海地區(qū)自然化學風化、海鹽沉降和人類活動對徑流化學組成有近于相等的貢獻水平,此外,自然化學風化過程所產生的 HCO3-離子響應洪水的稀釋效應,海鹽沉降通量也響應徑流的稀釋效應.從主要化學離子Piper圖(圖7)也可以看出,雨季尤其是暴雨時上下游河道水的離子成分更接近雨水,稀釋效應顯著.盡管如此,河道水與井水中的優(yōu)勢微生物種群一致性較高,不受這種稀釋效應影響,此特征表明可從微生物角度辨識地下水/地表水的相互作用.本次水樣中自然化學風化和海鹽沉降的貢獻份額都相對減小,酸沉降的貢獻稍有增加,如現場測定的 pH值偏弱酸性(表1),這在微生物組成、結構中也有所反映,表現在本次測序的微生物種群中酸桿菌(Acidobacteria,大多由嗜酸菌組成)均有存在,尤其是在R1井中已達到了優(yōu)勢種群水平.

3 結論

3.1 微生物組成結構方面,淺層潛水與地表非飽和帶(土壤)聯(lián)系密切,受地表水(河道)與雨水補給,一般為氧化環(huán)境,其中的微生物組成結構與下游河道水相似,表現為 Firmicutes為最優(yōu)勢種群,其他如,α, β, γ-proteobacteria、Archaea等也與下游河道水基本類同;處于花崗巖破碎帶的基巖裂隙水,其略帶承壓的含水層為主要聯(lián)系通道與上游河道水交互,相應的微生物組成結構與河道水有較大的相似性,表現為 Archaea為最優(yōu)勢種群,其余的優(yōu)勢種群如β-proteobacteria,Candidate division OPx,Firmicutes,δ-proteobacteria等,也與上游堰基本相同,且微生物多樣性指數和稀釋曲線也較為接近;處于裂隙發(fā)育但破碎層較少的基巖裂隙水,其承壓含水層受補給源控制水量不夠豐足,地下水位比較平穩(wěn),處于還原環(huán)境,各種芽孢桿菌占絕對優(yōu)勢,而其他微生物種群較少.

3.2 受水文地質和化學離子等綜合影響,酸桿菌在淺層潛水中表現為優(yōu)勢菌,藍細菌僅在花崗巖破碎帶的基巖裂隙水和河道水中系統(tǒng)發(fā)育同源性相近,硝化與反硝化菌主要在基巖裂隙水中存在,這些差異的存在表明在每個獨特地質構造的含水層中,地下水與地表水的交互程度不同,微生物的組成結構隨不同地理時空的物理化學差異而變化并且適應.

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Cause on the differences of microorganism between small watershed surface water and underground water.

HUANG Xiao-lan1,2, CHEN Jian-yao2*, ZHOU Shi-ning3, XIE Li-chun2, YANG Xue-yun2, JIANG Hua-bo2, DONG Lin-yao2(1.Key Laboratory of Poyang Lake Wetland and Watershed Research, Ministry of Education, School of Geography and Environment, Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, China；2.School of Geography and Planning, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, China；3.School of Life Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, China). China Environmental Science, 2012,32(9)：1647～1654

The surface and underground water of Sun Yat-sen University water cycle experiment base was sampled and analyzed by 16S rRNA gene analytical methods to acquire the data of microorganism communities’ distribution, then, the rarefaction curves and richness/diversity estimators were calculated and compared by Mothur software. Microbiological communities in groundwater were similar to those in surface water , with the predominant group of Proteobacterium, Firmicutes, Uncultured Archaeon(uncultured Crenarchaeote and Euryarchaeote). Proteobacteria made up 29.7%、30.3%、28.1%、20.9%、14.2% of the microbial communities from Shangyouyan, Xiayouyan, R1, R2, R3 , respectively. The same samples from Shangyouyan, Xiayouyan, R1, R2, R3 also consisted of 9.7%、20.3%、19.8%、8.6%、39.6% Firmicutes and 14.2%、12.3%、11.7%、12.1%、3.5% Archaea, respectively. On the other hand, the data of richness and diversity estimators such as Chao1, Ace, Shannon, and Simpson indicated that microorganism diversities were different in groundwater and surface water, which showed the difference among those microorganism’s characteristics. The study concluded that microorganism evolves in response to the change of the hydrogeological and ionic conditions that are influenced by the water environment and the recharging of water resources.

small watershed；groundwater；surface water；microorganism；difference；cause

2012-02-09

國家“973”項目(2012CB417003);廣東省自然科學基金項目(9251027501000021);江西省教育廳科技項目(GJJ12186);廣東水利科技創(chuàng)新與推廣項目(2009-2011);江西省博士后科研項目擇優(yōu)資助(2012)

* 責任作者, 教授, chenjyao@mail.sysu.edu.cn

X172

A

1000-6923(2012)09-1647-08

黃小蘭(1968-),女,江西贛州人,副研究員,博士, 主要研究方向為城市化水環(huán)境效應.發(fā)表論文20余篇.