孫永梅, 楊建珍, 孫華英, 馬原野,*, 王建紅,*

(1. 中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所, 云南 昆明650223; 2. 中國(guó)科學(xué)院研究生院, 北京100049)

慢性嗎啡依賴(lài)樹(shù)鼩模型的建立

孫永梅1,2, 楊建珍1, 孫華英1, 馬原野1,*, 王建紅1,*

(1.中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所,云南 昆明650223; 2.中國(guó)科學(xué)院研究生院,北京100049)

嗎啡是一種有效的鎮(zhèn)痛藥, 但易使動(dòng)物產(chǎn)生耐受性和成癮性。在該實(shí)驗(yàn)中, 中緬樹(shù)鼩 (Tupaia belangeri chinensis)連續(xù)7 d, 每天接受三次肌肉注射遞增劑量(5、10、15、20 mg/kg體重)嗎啡后對(duì)嗎啡產(chǎn)生耐受和依賴(lài); 嗎啡注射完成后, 腹腔注射納洛酮(1.25 mg/kg體重)催癮, 可誘導(dǎo)其條件性位置厭惡(conditioned place aversion, CPA)及相應(yīng)嗎啡戒斷癥狀的出現(xiàn)。該結(jié)果提示樹(shù)鼩慢性嗎啡依賴(lài)模型的建立可用于研究嗎啡依賴(lài)和耐受的生物學(xué)機(jī)制,以及減輕戒斷癥狀藥物的篩選。

樹(shù)鼩; 嗎啡; 慢性依賴(lài); 條件性位置厭惡; 戒斷癥狀

嗎啡作為常見(jiàn)的阿片類(lèi)鎮(zhèn)痛藥物之一, 被廣泛用于臨床治療各種急、慢性疼痛(Ree et al, 1999; Waldhoer et al, 2004; Martell et al, 2007), 但因可能導(dǎo)致的耐受性(tolerance)、依賴(lài)性(dependence), 及成癮性, 其應(yīng)用受到限制(Ree et al, 1999; Martell et al, 2007)。現(xiàn)代成癮生物學(xué)的一個(gè)基本問(wèn)題是：為什么諸如嗎啡、海洛因等的阿片類(lèi)藥物極易導(dǎo)致耐受、依賴(lài)和成癮(Waldhoer et al, 2004)，而藥物依賴(lài)又會(huì)導(dǎo)致藥物濫用, 從而引發(fā)諸如社會(huì)暴力、艾滋病、肝炎傳染等一系列社會(huì)問(wèn)題(Leshner, 1997)。通過(guò)建立動(dòng)物模型來(lái)研究藥物依賴(lài)的生物學(xué)機(jī)制是回答該問(wèn)題的有效方法。

藥物依賴(lài)指持續(xù)應(yīng)用藥物后, 個(gè)體生理狀態(tài)發(fā)生改變, 而停止藥物應(yīng)用后, 個(gè)體將產(chǎn)生戒斷癥狀(Ree et al, 1999)。判斷動(dòng)物對(duì)某種藥物是否產(chǎn)生依賴(lài), 常通過(guò)停藥后觀察戒斷癥狀, 或者注射該藥物的受體拮抗劑催癮等方法。如：?jiǎn)岱纫蕾?lài)的大、小鼠在注射嗎啡4～8 h后, 腹腔注射阿片受體拮抗劑納洛酮會(huì)產(chǎn)生明顯的戒斷癥狀(Schulteis et al, 2004)。藥物戒斷后的條件性位置厭惡(conditioned place aversion, CPA)指由戒斷所致的厭惡動(dòng)機(jī)/情緒與特定的環(huán)境/信號(hào)搭配后可建立條件性反射, 當(dāng)條件化后的對(duì)象再次暴露于相同或相似的環(huán)境/信號(hào)時(shí), 個(gè)體所表現(xiàn)出的厭惡/回避行為(Li et al, 2006,Xu et al, 2004)。因此, CPA是一個(gè)判斷動(dòng)物是否產(chǎn)生藥物依賴(lài)及戒斷癥狀的靈敏方法(Azar et al, 2003)。

樹(shù)鼩屬于攀鼩目(Scandentia)樹(shù)鼩科(Tupaiinae),雖然其系統(tǒng)分類(lèi)地位仍有爭(zhēng)議, 但它具備一些近似原始靈長(zhǎng)類(lèi)的特征, 說(shuō)明它與現(xiàn)代靈長(zhǎng)類(lèi)親緣關(guān)系很近(Peng et al, 1991; Sargis, 2004)。因此, 樹(shù)鼩的慢性嗎啡依賴(lài)模型較大、小鼠模型能夠更好地模擬人類(lèi)藥物依賴(lài)及戒斷癥狀。

以樹(shù)鼩為模型進(jìn)行的藥物研究數(shù)據(jù)非常有限。Wiens et al (2008)發(fā)現(xiàn)由于馬來(lái)西亞筆尾樹(shù)鼩(Ptilocercus lowii) 的特殊代謝系統(tǒng), 使其在大量飲用含高濃度酒精的花蜜后并不表現(xiàn)醉酒的狀態(tài), 且無(wú)宿醉行為特征; 而酒精易成癮的大鼠品系對(duì)嗎啡也易成癮(John et al, 1967)。那么, 同屬樹(shù)鼩科的中緬樹(shù)鼩是否也保留了該特殊代謝系統(tǒng), 而該系統(tǒng)對(duì)成癮藥物嗎啡是否也有作用，本文擬通過(guò)持續(xù)性嗎啡注射觀察樹(shù)鼩對(duì)嗎啡產(chǎn)生的依賴(lài)及成癮狀況, 從而探討樹(shù)鼩嗎啡依賴(lài)/成癮模型的可行性及其在嗎啡、酒精成癮研究方面的應(yīng)用前景。

樹(shù)鼩體型小、繁殖快、易飼養(yǎng)，屬晝行性動(dòng)物,活動(dòng)高峰為6:00—9:30和15:00—18:30; 視覺(jué)發(fā)達(dá),能清楚區(qū)別紅、黃、綠和灰色, 且紅色對(duì)其具有最大的刺激閾值(Peng et al, 1991)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)合樹(shù)鼩的活動(dòng)及視覺(jué)特征, 采用CPA裝置, 通過(guò)納洛酮誘導(dǎo)位置厭惡和戒斷癥狀，以探討其對(duì)嗎啡的慢性依賴(lài)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

24只成年健康雄性中緬樹(shù)鼩(Tupaia belangeri chinensis), 體重110～146 g, 購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。動(dòng)物單籠飼養(yǎng)在12 h明暗交替(光照時(shí)間07:00—19:00)的動(dòng)物房中, 室溫(23±1) ℃, 自由飲食。所有樹(shù)鼩在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前,至少在動(dòng)物房適應(yīng)一周, 在此期間每天接受撫摸一次。其中2只在CPA箱中穿梭次數(shù)＜2被剔除, 4只注射嗎啡后死亡, 所以進(jìn)行CPA數(shù)據(jù)分析的樹(shù)鼩共18只。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

鹽酸嗎啡：針劑, 10 mg/mL, 沈陽(yáng)第一制藥廠,批號(hào)070802; 鹽酸納洛酮：粉劑, Sigma-Aldrich, 批號(hào)2066110, 注射當(dāng)天用0.9%生理鹽水配至1.25 mg/mL。

1.3 實(shí)驗(yàn)裝置

CPA箱：箱體為有機(jī)玻璃頂蓋的木質(zhì)箱, 兩個(gè)可以活動(dòng)的隔板將其分為三個(gè)箱體。兩側(cè)大箱體(33 cm×33 cm×33 cm), 即條件化匹配箱壁和底板分別為黑色和紅色; 中間小箱體(40 cm×17 cm× 33 cm), 即選擇箱壁和底板黑色和紅色各半。箱體上方1.5 m 高的天花板上懸掛記錄動(dòng)物行為的攝像頭, 監(jiān)控?cái)?shù)據(jù)傳入置于另一房間的電腦中, 以便進(jìn)行離線(xiàn)分析。

戒斷癥狀記錄裝置：粉色鐵絲籠(39 cm×27 cm ×29 cm)一只, 作為樹(shù)鼩戒斷場(chǎng)地; 磁帶式攝像機(jī)一部, 用于記錄樹(shù)鼩戒斷癥狀。

1.4 行為測(cè)試和記錄

1.4.1 納洛酮誘導(dǎo)慢性嗎啡依賴(lài)樹(shù)鼩的CPA CPA行為訓(xùn)練分為3個(gè)階段：條件化前期、條件化期和測(cè)試期。訓(xùn)練時(shí)間根據(jù)樹(shù)鼩活動(dòng)規(guī)律安排。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為3組：慢性嗎啡注射+納洛酮催癮組(morphine+naloxone, MN組)、慢性嗎啡注射+生理鹽水組(morphine+saline, MS組)和慢性生理鹽水注射+納洛酮催癮組(saline+naloxone, SN組)。其中MS組和SN組為對(duì)照組。

條件化前期(第1天～第5天, D1～D5)：每天8:00、14:00和20:00, MN組和MS組分別肌肉注射嗎啡或者SN組肌肉注射等體積生理鹽水, 劑量見(jiàn)表1。注射完畢后動(dòng)物立即回到飼養(yǎng)籠。每天16:00將動(dòng)物放入除去隔板的CPA箱體中, 使其自由活動(dòng)15 min。第4天和第5天的數(shù)據(jù)作為CPA分?jǐn)?shù)基準(zhǔn)值。剔除進(jìn)入任何一個(gè)條件化匹配箱的次數(shù)＜2的動(dòng)物, 條件化期(第6天, D6)：該天動(dòng)物的給藥方式和時(shí)間同條件化前期。但3組動(dòng)物于16:00腹腔注射0.9%生理鹽水(1 mL/kg體重)后被立即限制在非偏愛(ài)箱30 min; 18:00, MN組與SN組腹腔注射納洛酮(1.25 mg/kg體重)；而MS腹腔注射生理鹽水后, 動(dòng)物被立即限制在偏愛(ài)箱30 min。

測(cè)試期(第7天, D7)：該天動(dòng)物的給藥方式和時(shí)間同條件化前期。16:00, CPA裝置的隔板被移除, 動(dòng)物在CPA箱體中自由活動(dòng)15 min, 錄像記錄其行為。

1.4.2 戒斷癥狀的記錄 戒斷癥狀記錄(第8天和第9天, D8 和 D9): D8, 8:00 MN 組和MS組樹(shù)鼩肌肉注射嗎啡(25 mg/kg體重)并立即放回飼養(yǎng)籠中, 4 h后(12:00), 兩組動(dòng)物腹腔注射生理鹽水(1 mL/kg體重)后放入粉色鐵絲籠中記錄其行為15 min, 然后, 12:15腹腔注射納洛酮(1.2 5 mg/kg)后再記錄其行為15 min。D9對(duì)SN組樹(shù)鼩分別記錄腹腔注射生理鹽水和納洛酮后的行為, 記錄時(shí)間同D8, 與D8不同之處是8:00, SN組樹(shù)鼩肌肉注射生理鹽水。CPA行為訓(xùn)練及戒斷癥狀的記錄安排詳見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)日程和處理因素Tab. 1 Experiment design and the schedule

1.4.3 體重監(jiān)測(cè) 行為測(cè)試期間, 每天 7:00—8:00稱(chēng)量所有樹(shù)鼩體重。

1.5 數(shù)據(jù)處理

CPA數(shù)據(jù)處理：統(tǒng)計(jì)動(dòng)物停留在紅色和黑色箱體的時(shí)間(秒), 并依據(jù)以下公式轉(zhuǎn)化為CPA分?jǐn)?shù)R值。 R(紅箱CPA分?jǐn)?shù))=紅箱內(nèi)停留時(shí)間/(紅箱內(nèi)停留時(shí)間+黑箱內(nèi)停留時(shí)間)。如果R＞0.50, 表示該動(dòng)物偏愛(ài)紅色箱體, 則紅箱為條件化期18:00的伴納洛酮箱, 黑箱為非偏愛(ài)箱; 若R＜0.50, 則黑色箱體為伴納洛酮箱, 紅色箱為非偏愛(ài)箱。

體重：D1～D5的數(shù)據(jù)用于分析和比較, D1的體重為基準(zhǔn)值, 以Mean±SD表示。

所有統(tǒng)計(jì)分析均用SPSS 16.0 for Windows進(jìn)行。CPA分?jǐn)?shù)以Mean±SE表示,組內(nèi)采用配對(duì)t-檢驗(yàn), 組間采用獨(dú)立樣本t-檢驗(yàn)。P≤0.05 表示在統(tǒng)計(jì)上有顯著性差異,P≤0.01表示有極顯著差異。

2 結(jié) 果

2.1 三組樹(shù)鼩CPA評(píng)定結(jié)果

MN組經(jīng)納洛酮催癮后, 對(duì)伴納洛酮箱明顯厭惡(t=2.903,P=0.034); 雖然統(tǒng)計(jì)上無(wú)顯著性, MS組(t=3.18,P=0.13)停留在偏愛(ài)箱的時(shí)間在條件化后增多; 同樣劑量的納洛酮并沒(méi)有導(dǎo)致SN組厭惡伴納洛酮箱(t=?2.038,P=0.134) (圖1)。以上數(shù)據(jù)說(shuō)明, MN組樹(shù)鼩產(chǎn)生厭惡并不是因?yàn)樵搫┝考{洛酮具有使動(dòng)物產(chǎn)生厭惡的作用, 而是由于納洛酮誘導(dǎo)了嗎啡依賴(lài)樹(shù)鼩產(chǎn)生戒斷癥狀, 進(jìn)而誘發(fā)了對(duì)伴納洛酮側(cè)箱體的厭惡。

圖1 三組樹(shù)鼩CPA分?jǐn)?shù)Fig. 1 The CPA score of three tree shrew groups

2.2 戒斷癥狀分析與比較

通過(guò)MS組和MN組自身對(duì)照以及與SN組的組間對(duì)照, 我們觀察到以下戒斷癥狀, 并與大鼠的戒斷癥狀進(jìn)行了比較（表2）。

表2 樹(shù)鼩和大鼠戒斷癥狀比較Tab. 2 Withdrawal symptoms comparison between rats and tree shrews

2.3 嗎啡注射后樹(shù)鼩體重變化

與基準(zhǔn)值相比, 嗎啡組樹(shù)鼩在注射嗎啡1 d后體重急劇下降(t=8.698,P＜0.001), 隨后趨于平穩(wěn),表明樹(shù)鼩對(duì)嗎啡產(chǎn)生了耐受(圖2)。生理鹽水組樹(shù)鼩體重變化不明顯。同時(shí), 我們觀察到在嗎啡注射期間, 樹(shù)鼩的飲食量與注射前、后相比均明顯減少。

圖 2 條件化前期嗎啡組(M組)和生理鹽水組(S組)樹(shù)鼩體重變化Fig. 2 Body weight changes in M group and S group during pre-conditioning session

2.4 條件化前期嗎啡注射樹(shù)鼩對(duì)紅色箱體的偏愛(ài)程度

條件化前期第4、5天, 與生理鹽水組相比, 嗎啡注射樹(shù)鼩表現(xiàn)出對(duì)紅色箱體的極顯著偏愛(ài)(t=3.454,P=0.003)(圖3)。

圖3 條件化前期嗎啡組(M組)和生理鹽水組(S組)動(dòng)物的紅色箱體停留分?jǐn)?shù)Fig. 3 Red box scores of M group and S group in pre-conditioning session

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 每天三次注射遞增劑量嗎啡, 樹(shù)鼩能夠?qū)岱犬a(chǎn)生一定的耐受和依賴(lài), 通過(guò)納絡(luò)酮催癮, 可觀察到戒斷癥狀, 并促使樹(shù)鼩形成CPA。

正性和負(fù)性強(qiáng)化機(jī)制在藥物依賴(lài)中具重要作用(Tiffany et al, 2004)。藥物的獎(jiǎng)賞作用是正性強(qiáng)化因素, 而藥物戒斷所產(chǎn)生的戒斷癥狀及厭惡情緒是負(fù)性強(qiáng)化因素。在本實(shí)驗(yàn)中, 正性強(qiáng)化因素是嗎啡注射, 而負(fù)性強(qiáng)化因素是納絡(luò)酮催癮產(chǎn)生的戒斷癥狀, 以及與戒斷癥狀相關(guān)的環(huán)境因素。實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)：MN組樹(shù)鼩與MS組、SN組比較, 明顯表明出對(duì)伴納洛酮箱體的回避。該結(jié)果與嚙齒類(lèi)動(dòng)物相關(guān)報(bào)道一致(Marc et al, 2003; Karyn et al, 2010)。這說(shuō)明樹(shù)鼩對(duì)嗎啡產(chǎn)生依賴(lài)后用阿片受體拮抗劑納洛酮催癮, 會(huì)由于戒斷癥狀而對(duì)催癮相關(guān)的環(huán)境線(xiàn)索產(chǎn)生回避行為, 且該模型可作為研究藥物成癮及戒斷的有效方法之一。

人類(lèi)阿片類(lèi)毒品戒斷癥狀包括嘔吐、打呵欠、流眼淚、腹瀉、腹痛、螞蟻爬骨的異樣感覺(jué)、睡眠障礙及抑郁等。樹(shù)鼩的戒斷癥狀與人類(lèi)有一定的相似之處。比如：樹(shù)鼩戒斷過(guò)程中, 叫聲和倒立反映其煩躁不安情緒, 與人類(lèi)的心理戒斷癥狀相似;前、后爪拍地, 與人類(lèi)的不寧腿綜合征相似; 頭、尾貼地走, 與人類(lèi)的“靜坐不能”癥狀相似；但因?yàn)閯?dòng)物種屬不同, 樹(shù)鼩的某些戒斷癥狀無(wú)法和人類(lèi)相比較，而未觀察到樹(shù)鼩腹瀉現(xiàn)象, 原因可能是由于樹(shù)鼩在面對(duì)新異環(huán)境或刺激時(shí), 強(qiáng)烈的應(yīng)激反應(yīng)可能使它們對(duì)嗎啡的耐受增高, 同時(shí)腸胃功能也能夠迅速恢復(fù)。在本實(shí)驗(yàn)中, 樹(shù)鼩的體重在注射嗎啡初始迅速下降, 之后便趨于平穩(wěn), 這從另一方面也說(shuō)明, 樹(shù)鼩消化道功能的適應(yīng)能力很強(qiáng), 因而沒(méi)有產(chǎn)生腹瀉癥狀。該推測(cè)需要通過(guò)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。另外, 催癮癥狀與納洛酮的劑量有關(guān), 還需要相關(guān)實(shí)驗(yàn)探討不同劑量的納洛酮是否能誘導(dǎo)樹(shù)鼩腹瀉等癥狀。

CPA和戒斷癥狀都是判斷動(dòng)物是否產(chǎn)生藥物依賴(lài)的指標(biāo)。藥物成癮的核心特征是強(qiáng)迫性藥物使用(Leshner, 1997)。因此, 藥物依賴(lài)模型可以揭示成癮是怎樣從隨機(jī)地、有控制地用藥到強(qiáng)迫性用藥。

以往的研究發(fā)現(xiàn), 嚙齒類(lèi)動(dòng)物體重的減輕可以作為嗎啡依賴(lài)的指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 樹(shù)鼩在嗎啡給藥一天后也出現(xiàn)了體重的顯著降低, 說(shuō)明體重減輕也可作為其嗎啡依賴(lài)的指標(biāo)之一。但是, 在之后的給藥期間樹(shù)鼩體重波動(dòng)不明顯, 提示其對(duì)嗎啡產(chǎn)生耐受, 而耐受是限制嗎啡臨床使用的因素之一, 因此, 中緬樹(shù)鼩嗎啡依賴(lài)模型也可用于研究嗎啡耐受機(jī)制。

中緬樹(shù)鼩可以對(duì)嗎啡產(chǎn)生依賴(lài)并出現(xiàn)戒斷癥狀的一個(gè)重要因素可能是給藥方式。我們?cè)谇捌诘念A(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn), 兩種恒定劑量(10 mg/kg體重 和15 mg/kg體重), 每天腹腔注射一次, 連續(xù)8 d的給藥方式不能建立CPA。首次注射劑量太高(15 mg/kg體重), 樹(shù)鼩死亡率高達(dá)75%, 而劑量太低, 樹(shù)鼩又易產(chǎn)生耐受。因而，我們選用每日3次遞增劑量給藥方式, 使嗎啡藥效作用時(shí)間延長(zhǎng), 并能避免因藥量大和藥效快導(dǎo)致的動(dòng)物急性死亡。

由于黑色所給予的安全感, 樹(shù)鼩天生偏愛(ài)黑色,但嗎啡注射后的樹(shù)鼩對(duì)紅色具顯著偏愛(ài), 這可能是因?yàn)閱岱冉獬酥袠幸种葡到y(tǒng)的作用，從而使中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮而導(dǎo)致樹(shù)鼩對(duì)紅色箱的偏愛(ài)。

藥物伴隨(包括戒斷時(shí))的環(huán)境因素是導(dǎo)致復(fù)吸的重要因素之一(Deroche-Gamonet et al, 2004)。因此, 納洛酮誘導(dǎo)的慢性嗎啡CPA模型不僅可以用于探討戒斷癥狀在成癮過(guò)程中的作用機(jī)理, 也可用來(lái)探討相關(guān)環(huán)境線(xiàn)索是怎樣影響復(fù)吸的。另外, 該模型也可以用來(lái)篩選減輕嗎啡戒斷癥狀的藥物。本研究通過(guò)CPA、戒斷癥狀觀察和體重監(jiān)測(cè)等方法, 初步建立了中緬樹(shù)鼩的嗎啡依賴(lài)模型，且由于樹(shù)鼩進(jìn)化地位及腦結(jié)構(gòu)較嚙齒類(lèi)動(dòng)物均更接近靈長(zhǎng)類(lèi), 該模型具有廣大的應(yīng)用前景。

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Establishment of tree shrew chronic morphine dependent model

SUN Yong-Mei1,2, YANG Jian-Zhen1, SUN Hua-Ying1, MA Yuan-Ye1,*, WANG Jian-Hong1,*

(1. Kunming Institute of Zoology, the Chinese Academy of Sciences, Kunming, 650223, China;
2. Graduate School of the Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

The clinical use of morphine to reduce pain is limited because of its drug tolerance, dependence and addiction. In the present study, the tree shrews (Tupaia belangeri chinensis) developed morphine tolerance and chronic morphine dependence by morphine injections with increasing doses (5, 10, 15, 20 mg/kg body weight for 7 days). Meanwhile, the naloxone (1.25 mg/kg body weight)-induced conditioned place aversion (CPA) and the withdrawal symptom were also found. The tree shrew model of chronic morphine dependence can be used to investigate the withdrawal symptoms and to select potential withdrawal symptoms reducing drugs in the future.

Tree shrew; Morphine; Chronic dependence; Conditioned place aversion; Withdrawal symptom

Q959.832; Q95-33; Q189

A

0254-5853-(2012)01-0014-05

10.3724/SP.J.1141.2012.01014

2011-12-19；接受日期：2012-01-05

“973”項(xiàng)目((2011CB707800);中國(guó)科學(xué)院知識(shí)創(chuàng)新工程重要方向項(xiàng)目(KSCX2-EW-R-11)

?通信作者(Corresponding authors)，E-mail: yuanma0716@vip.sina.com; wangjh@mail.kiz.ac.cn

孫永梅,碩士研究生