胡秀榮，黃振東，蒲占湑，杜丹超，陳國慶，鹿連明

(浙江省柑橘研究所，浙江臺(tái)州 318020)

柑橘青、綠霉病是柑橘類果品貯運(yùn)期間發(fā)生最普遍、危害最嚴(yán)重的侵染性病害［1］，其病原菌為青霉亞屬的2種不同真菌。這2種病原菌通?？赏瑫r(shí)侵染危害柑橘果實(shí)，且具有較強(qiáng)的侵染性和擴(kuò)散能力。受病菌感染的果實(shí)通常可在1～2周時(shí)間內(nèi)全果腐爛，同時(shí)病果上產(chǎn)生大量的分生孢子向四周擴(kuò)散侵染危害其他果實(shí)。因此，柑橘青、綠霉病對(duì)儲(chǔ)運(yùn)期柑橘造成了極大的危害。據(jù)統(tǒng)計(jì)，僅由于這2種病的感染，柑橘采后損失率即可高達(dá)30% ～50%［2］。

目前主要通過化學(xué)殺菌劑如咪鮮胺、抑霉唑和百可得等來防治柑橘青、綠霉病。但這些化學(xué)藥劑的長期大量使用，不僅使環(huán)境污染和果品中農(nóng)藥殘留等問題日漸突出，而且易誘導(dǎo)病菌產(chǎn)生抗藥性，使其對(duì)病害的實(shí)際防治效果大為下降。隨著人們生活質(zhì)量的提高，對(duì)農(nóng)藥殘留等食品安全問題愈來愈重視。于是，尋求安全、無毒、高效的控制柑橘類果品采后腐爛的新方法成為當(dāng)務(wù)之急，而利用拮抗微生物防治采后病害有望成為代替化學(xué)藥劑的一種安全、無毒及有效的新方法［3］。

黃巖被作為世界寬皮橘的始祖地，有著2 300多年的栽培歷史，擁有180多個(gè)柑橘品種，在栽培時(shí)間較長的橘園土壤中勢(shì)必存在著豐富的根際微生物，如能加以利用，篩選有益的生防菌株，對(duì)于植物病害的生物防治有著重要的意義。本研究擬于黃巖地區(qū)栽培時(shí)間較長的橘園中采集不同品種的柑橘根部樣品，從中分離內(nèi)生放線菌，以期篩選獲得對(duì)柑橘青霉病和綠霉病具有較好抑制效果的拮抗菌株，進(jìn)一步研究拮抗菌株對(duì)柑橘果實(shí)采后的防病效果并探討其應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 柑橘內(nèi)生放線菌的分離

1.1.1 樣品的采集

在黃巖地區(qū)本地早、椪柑、溫州蜜柑、槾桔、甜橙5個(gè)不同品種的柑橘園內(nèi)，采集柑橘植株根部樣品，每個(gè)品種10份，用于微生物的分離。

1.1.2 分離培養(yǎng)基

配制高氏合成1號(hào)培養(yǎng)基，成分如下:可溶性淀粉20 g，硝酸鉀1 g，磷酸氫二鉀0.5 g，硫酸鎂0.5 g，氯化鈉0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，重鉻酸鉀0.05 g，瓊脂20 g，純凈水1 000 mL，pH值7.2～7.4，于高壓滅菌鍋中滅菌后備用。

1.1.3 內(nèi)生放線菌的分離

將采集的柑橘根用自來水沖洗干凈，用99%乙醇處理1 min，3%次氯酸鈉處理5 min，再用99%乙醇處理30 s，最后用滅菌水沖洗3次。滅過菌的根用無菌剪刀在無菌操作臺(tái)上剪成1 cm的小段，置于分離培養(yǎng)基表面。之后將培養(yǎng)皿倒置于28℃微生物培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～6周，待放線菌長出，挑取菌絲進(jìn)行轉(zhuǎn)接純化，純化培養(yǎng)的菌株再接種到含分離培養(yǎng)基的試管中培養(yǎng)，然后放于4℃冰箱保存?zhèn)溆茫?］。

1.2 具抑菌活性的內(nèi)生放線菌的篩選

1.2.1 指示菌平板的制備

柑橘青、綠霉病的病原菌由本實(shí)驗(yàn)室從患病的柑橘果實(shí)上分離并保存。將保存的2種病原菌轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基平板上，置于28℃的微生物培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待菌落產(chǎn)生孢子后，往培養(yǎng)皿內(nèi)加入10 mL無菌水收集孢子，用無菌紗布過濾后，用無菌水調(diào)整孢子懸浮液濃度至104個(gè)孢子·mL-1，用移液器吸取20 μL孢子懸浮液均勻涂布于PDA平板上待用。

1.2.2 具拮抗活性菌株的篩選

采用挖塊法測(cè)定內(nèi)生放線菌的生物活性:將分離獲得的內(nèi)生放線菌接種于高氏合成1號(hào)培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)5 d后，在有菌生長處用打孔器取直徑5 mm的菌餅，置于接種有指示菌的平板中央，然后于28℃的微生物培養(yǎng)箱培養(yǎng)。48 h后觀察菌餅周圍透明抑菌圈的有無和大小，據(jù)此判定內(nèi)生放線菌的抑菌活性［4］。

1.3 菌株CR20發(fā)酵液對(duì)采后柑橘的防病效果

1.3.1 菌株CR20發(fā)酵液的制備

將菌株CR20接入高氏合成1號(hào)液體培養(yǎng)基(250 mL錐形瓶100 mL培養(yǎng)基)中，于28℃恒溫?fù)u床中200 r·min-1振蕩培養(yǎng)7 d后，將培養(yǎng)物分裝于離心管中，置于10 000 r·min-1的高速離心機(jī)中離心5 min，收集上清液，最后利用過濾除菌裝置使上清液透過細(xì)菌過濾膜去除其中的孢子，收集濾液即為菌株CR20的發(fā)酵液［5］。

1.3.2 菌株CR20對(duì)病害的防效測(cè)定

取溫州蜜柑的新鮮果實(shí)，用解剖刀在果實(shí)腰部刺一傷口 (3 mm×3 mm)，在傷口處滴入15 μL菌株CR20發(fā)酵液，同時(shí)以滴加高氏合成1號(hào)液體培養(yǎng)基的果實(shí)為陰性對(duì)照，滴加咪鮮胺藥液 (濃度為200 mg·mL-1)的果實(shí)為陽性對(duì)照，處理后的果實(shí)置于塑料盒內(nèi)，于室溫放置24 h，再分別接種濃度為104個(gè)孢子·mL-1的柑橘青霉菌和綠霉菌的孢子懸浮液，用保鮮袋密封塑料盒后放置于28℃下保濕培養(yǎng)，在接種后的第7，14天分別統(tǒng)計(jì)發(fā)病率并計(jì)算防效。每次實(shí)驗(yàn)處理30個(gè)果實(shí)，重復(fù)3次。

1.4 菌株CR20的形態(tài)學(xué)特征觀察

1.4.1 菌株CR20的菌絲和孢子形態(tài)觀察

制備菌株CR20的孢子懸浮液，吸取20 μL滴加在高氏合成1號(hào)培養(yǎng)基平板上，用無菌三角棒涂布均勻后，將滅菌的蓋玻片斜插入平板內(nèi)，每皿4片，放于28℃培養(yǎng)，在培養(yǎng)1，7和21 d后分別取出蓋玻片用細(xì)胞壁染色法染色 (1%磷鉬酸3～5 min，再用1%甲基綠染5 min)，無菌水沖洗后，將蓋玻片自然風(fēng)干，在油鏡下觀察［4］。

1.4.2 菌株CR20在不同培養(yǎng)基上的生長特性

采用國際通用的5種培養(yǎng)基，包括2種合成培養(yǎng)基:ISP-4和ISP-5;2種有機(jī)培養(yǎng)基:ISP-3和ISP-2;1種產(chǎn)黑色素培養(yǎng)基:ISP-6。將菌株CR20接種到以上培養(yǎng)基上，并至于28℃恒溫培養(yǎng)，接種后3～4周，觀察菌株CR20的氣生菌絲、基內(nèi)菌絲的生長情況及可溶性色素的產(chǎn)生情況［4］。

1.5 菌株CR20的生理生化特性的測(cè)定

用于菌株生理生化特性測(cè)定的試驗(yàn)如碳源利用、黑色素產(chǎn)生、H2S產(chǎn)生、七葉苷利用、纖維素利用、明膠液化、淀粉水解、牛奶凝固及凍化、纖維素水解、硝酸鹽還原等參照文獻(xiàn)［4］進(jìn)行。

1.6 菌株CR20的PCR擴(kuò)增及序列分析

1.6.1 放線菌總DNA的提取

取于高氏合成1號(hào)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4～5 d的CR20的菌液，分裝于無菌離心管中，10 000 rpm·min-1離心10 min后棄上清液，收集菌體沉淀并用無菌濾紙吸干多余水分后，稱取0.1～0.2 g菌體于無菌研缽中;加入少量PVP后用液氮研磨成粉末;之后參照王凡等［6］的方法利用CTAB法提取DNA，最后提取的DNA沉淀溶解于10～20 μL TE(含RNase 50 mg·L-1)中并放置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 放線菌16S rDNA的PCR擴(kuò)增

以提取的總DNA為模板，以細(xì)菌通用引物27F:5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'和1492R:5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'擴(kuò)增放線菌16S rDNA，PCR 反應(yīng)體系為:10×Buffer 2.5 μL，dNTPs 2 μL，上 下 游 引 物 (10 μmol· L-1) 各1.5 μL，Taq DNA 聚合酶0.2 μL，DNA 模板1 μL，無菌水補(bǔ)足至總體積25 μL。反應(yīng)條件為:94℃5 min;94℃ 1 min，55℃1 min，72℃ 2 min，35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物上樣于含有GelRed染料的瓊脂糖凝膠中電泳，并于凝膠成像系統(tǒng)中觀察拍照。

1.6.3 PCR產(chǎn)物測(cè)序及序列分析

于瓊脂糖凝膠上割取目的條帶，利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，純化產(chǎn)物送交上海Invitrogen公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果整理后，利用NCBI Blast進(jìn)行在線比對(duì)，查找Genbank數(shù)據(jù)庫中與之同源性較高的序列，通過 Mega4.1軟件中的Neighbor joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，在構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹時(shí)進(jìn)行自舉檢驗(yàn)，重復(fù)抽樣1 000次，隨機(jī)種子數(shù)為64 238顆。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生放線菌的分離

從采集的50份柑橘根部樣品中分離獲得內(nèi)生放線菌共42株，其中鏈霉菌屬Streptomyces放線菌占70%以上，其他一些則屬于鏈輪絲菌屬Streptoverticillium、小單孢菌屬M(fèi)icromonospora及一些尚未確定到屬的放線菌種類。同時(shí)發(fā)現(xiàn)不同柑橘品種根部?jī)?nèi)生防線菌種群數(shù)量有差別，其中本地早蜜橘內(nèi)生放線菌數(shù)量明顯高于其他，種植時(shí)間較長的老橘園中柑橘根部?jī)?nèi)生放線菌數(shù)量也明顯較高，推測(cè)老橘園土壤中可能富集更多的微生物。

2.2 具抑菌活性菌株的篩選

通過抑菌實(shí)驗(yàn)，從42株分離獲得的內(nèi)生放線菌中篩選出1株可同時(shí)對(duì)柑橘青霉菌和綠霉菌有抑菌活性的菌株，編號(hào)為CR20，該菌株較其他菌株對(duì)柑橘青、綠霉菌具有更為顯著的抑制效果，其抑菌圈直徑分別可達(dá)35和41 mm。

2.3 菌株CR20發(fā)酵液柑橘采后保鮮試驗(yàn)

從表1看出，接種7 d后，CR20發(fā)酵液對(duì)青霉病菌的防效達(dá)到100%，與咪鮮胺效果相當(dāng)，對(duì)綠霉病的防效達(dá)到88%，稍低于咪鮮胺的防效;接種14 d后，拮抗菌株CR20發(fā)酵液對(duì)青霉病菌的防效為55%，對(duì)綠霉病的防效為49%，均低于咪鮮胺防效。

表1 CR20菌株發(fā)酵液對(duì)柑橘果實(shí)采后病害防效

2.4 菌株CR20的形態(tài)特征

2.4.1 形態(tài)特征

菌株CR20在高氏合成1號(hào)培養(yǎng)基上生長茂盛，氣生菌絲為粉紅色，基內(nèi)菌絲為黃色，單個(gè)菌落表面有氣孔 (圖1)。在顯微鏡下可觀察到其氣生菌絲多分枝，孢子絲較直，孢子表面光滑，呈橢圓形至圓柱形。

圖1 CR20在高氏合成1號(hào)培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征

2.4.2 在不同培養(yǎng)基上的生長特性

菌株CR20在供試的6種培養(yǎng)基上生長情況見表2。在ISP-3和ISP-2這2種有機(jī)培養(yǎng)基上均可良好生長;在ISP-4和ISP-5這2種合成培養(yǎng)基上長勢(shì)相差較大，在ISP-4生長良好，而在ISP-5上生長貧乏;在ISP-6黑色素培養(yǎng)基上生長貧乏，且有黑色素生成。

表2 放線菌CR20菌株的培養(yǎng)特征

2.5 菌株CR20的生理生化特性

菌株CR20可利用蔗糖、半乳糖、葡萄糖、甘露醇作為碳源，而不能利用果糖、肌醇、棉子糖、鼠李糖和阿拉伯糖?？墒古Ｄ棠滩㈦嘶?，可以利用七葉苷及產(chǎn)生黑色素等 (表3)。

表3 放線菌CR20菌株的生理生化特征

2.6 菌株CR20 16S rRNA的PCR擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，可觀察到大小為1 500 bp左右的目的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致(圖2)。測(cè)序結(jié)果經(jīng)Blast比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，所測(cè)序列與Genbank中鏈霉菌屬的多個(gè)種均具有較高的同源性。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示 (圖3)，所分離菌株CR20與Streptomyces cinnamonensis和Streptomyces virginiae具有極近的親緣關(guān)系，其16S rRNA序列相似性可達(dá)100%。結(jié)合該菌種的形態(tài)學(xué)特征和生理生化特性，將菌株CR20初步鑒定為鏈霉菌屬的弗吉尼亞鏈霉菌 (Streptomyces virginiae)。

圖2 CR20的16S rDNA的PCR產(chǎn)物電泳圖譜

圖3 基于16S rDNA的菌株CR20與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 小結(jié)和討論

植物內(nèi)生放線菌是一類新的生防微生物資源，在植物病蟲害的防治中具有很大的應(yīng)用潛力。內(nèi)生放線菌作為內(nèi)生菌的重要類群，是較新的研究領(lǐng)域，鏈霉菌屬 (Streptomyces)少部分為稀有放線菌。從42株內(nèi)生放線菌中篩選出一株有價(jià)值的生防菌株CR20，經(jīng)鑒定初步確定為弗吉尼亞鏈霉菌(Streptomyces virginiae)。在利用內(nèi)生菌對(duì)柑橘青綠霉病菌的防治研究上，李輝等［7］從廣東果園土壤中分離獲得了一株吸水類群鏈霉菌 (Streptomyces hygroscopicus)，試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌株對(duì)柑橘綠霉病菌具有較強(qiáng)的拮抗活性。弗吉尼亞鏈霉菌作為拮抗菌株用于對(duì)病原菌的抑制前人也已有報(bào)道。如Hala M.Rifaat等［8］從埃及土壤中分離獲得弗吉尼亞鏈霉菌的HM3菌株，其對(duì)多種革蘭氏陰性和陽性細(xì)菌、酵母菌、真菌有較高的殺菌活性。卞光凱等［9］從紅豆杉根際土壤中分離獲得了一株弗吉尼亞鏈霉菌，研究表明，該菌株對(duì)植物病原菌可可球二孢菌具有明顯的抑菌活性。本研究所分離獲得的弗吉尼亞鏈霉菌菌株CR20對(duì)柑橘青綠霉病菌均具有較強(qiáng)的拮抗作用，其實(shí)際防效雖不及化學(xué)農(nóng)藥咪鮮胺，但可考慮通過對(duì)菌株進(jìn)行改良或發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化等，提高該菌株的實(shí)際應(yīng)用效果。另外，本研究用于分離菌株的材料為柑橘根部樣品，所用分離培養(yǎng)基為單一的高氏合成1號(hào)培養(yǎng)基，這可能在很大程度上限制了對(duì)具有更好拮抗活性的微生物資源的篩選獲得。因此，在今后的研究中，應(yīng)充分利用黃巖老柑橘產(chǎn)區(qū)的資源優(yōu)勢(shì)，采用多種分離培養(yǎng)基及培養(yǎng)策略以篩選獲得具有更好活性的生防菌株。

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