胡 磊,李 軼

(1.河海大學淺水湖泊綜合治理與資源開發(fā)教育部重點實驗室, 江蘇南京 210098;2.河海大學環(huán)境學院, 江蘇南京 210098)

生化需氧量(BOD)作為重要的衡量水與廢水中有機污染程度的指標,在水污染控制中具有非常重要的作用。傳統(tǒng)經(jīng)典的BOD 測量方法需要5 d 時間,而且操作復雜、受外界影響大,不能滿足對污染水體或污染源在線監(jiān)測的要求[1]。自Karube 等[2]于1977 年最先研制出用于測量BOD 的微生物傳感器后,國內外很多學者研發(fā)出各種基于不同菌種及混合菌種的BOD 傳感器[3-6]?，F(xiàn)有的基于微生物傳感器的快速測定方法將測量時間從5 d 縮短到30 min,極大地滿足了對水和廢水BOD 監(jiān)測的要求,但是也存在著對水樣中DO 依賴大等問題。

近年來,越來越多的學者[7-9]研究利用氧化還原介體代替分子氧作為監(jiān)測微生物分解代謝的最終電子受體。在微生物的生化反應中氧化態(tài)的介體失去電子,轉變?yōu)檫€原態(tài)的介體,此過程的電子變化產(chǎn)生傳感器電流響應,從而可以定量反應中氧化還原物質的量。很多利用介體促進微生物生化反應的研究,反應體系是水溶液,且介體的濃度很高,如達40 mmol/L[10]和55 mmol/L[11],導致介體的浪費。筆者針對以上問題,開發(fā)出基于接枝二茂鐵介體的微生物傳感器,將介體接枝到大分子材料中,并包埋于聚乙烯醇(PVA)中,保持了介體的性能并避免了介體的流失,很好地應用于測量廢水中的BOD。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

二茂鐵(Fc),KH550 (3-aminopropyltriethoxysilane,3-APTES), 聚乙烯醇(PVA, 醇解度90%, 分子量22 000)購自南京曙光化學有限公司,其余試劑均采用分析純試劑。磷酸鹽緩沖溶液(PBS, pH =7.2)(由36 mL 的71.64 g Na2HPO412H2O 和14 mL 的31.21 g NaH2PO42H2O 混合配制而成)。BOD 標準校正溶液(GGA)[12],采用葡萄糖(150 mg/L)、谷氨酸(150 mg/L)混合溶液。

1.2 二茂鐵介體的接枝

將Fc與微生物固定化于PVA 包埋材料中,在微生物對有機物的降解反應中代替氧為最終的電子受體。由于Fc 是小分子有機物,其分子的大小(nm 級)遠遠小于包埋材料的孔徑(平均為μm 級),故需要與大分子有機物進行接枝。SBA-15 是一種具有巨大比表面積的介孔氧化硅材料,其豐富的表面羥基為接枝創(chuàng)造了良好的條件,其制備過程見文獻[13] ,二茂鐵甲酸的制備見文獻[14] 。將6.9 g 二茂鐵甲酸和6.63g KH550 溶解在50mL 氯仿和50mL N,N-二甲基甲酰胺的混合溶劑中,加入4.67 g 1-羥基苯并三唑,當上述溶液冷卻到0 ℃時,加入6.68 g EDCI(1-Ethyl-3-[3-(dimethylamino)-propyl] carbodiimide hydrochloride)和3.6 g NMM(N-methylmorpholine)。將溶液從冰浴中取出,常溫攪拌24 h,加入8 g SBA-15并繼續(xù)攪拌48 h。過濾所得的混懸液,濾渣在索氏提取器中用氯仿過夜洗滌除去游離的成分,所得的固體真空干燥, 得到14.2 g 樣品, 樣品被標記為Fc-SBA-15。Fc-SBA-15 的合成步驟見圖1。

1.3 微生物培養(yǎng)及固定化

圖1 Fc-SBA-15 合成示意圖

微生物選用從活性污泥(取自江心洲污水處理廠)分離出的混合菌種。將取來的活性污泥經(jīng)雙層紗布過濾后,在濾液(混合菌種)中投加好氧菌培養(yǎng)基,包含0.1%蛋白胨,0.1%牛肉膏及0.1%CaCl2。在30 ℃水浴中曝氣培養(yǎng)24 h,菌液在550 nm 波長處的吸光度達到0.8 時,將菌液以7 200 r/min 離心5 min,離心后用pH 為7.2 的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗,清洗后的菌液再次離心。重復此過程兩遍后,將離心后的菌泥與Fc-SBA-15 介體懸濁液、10%的PVA 溶膠進行混合包埋,混合均勻后壓制成片(厚度為0.3μm),室溫晾干后裁剪成適合的大小,作為傳感器的生物敏感材料。

1.4 傳感器系統(tǒng)的構建

利用三電極系統(tǒng)作為電化學的換能器。分別用玻碳電極(截面直徑6mm)為工作電極,Pt 電極為對電極,飽和甘汞電極為參比電極,以通路的電流值為測量指標。玻碳電極在使用前分別用1.0 μm、0.3μm和0.05 μm α-Al2O3打磨至光滑,每次打磨后均用去離子水仔細清洗。最后打磨好的玻碳電極在室溫下晾干。和以前相關的研究[15]相比,本研究使用了更少的Fc 介體,并有效地阻止介體從包埋材料中流失。

2 結果和討論

2.1 接枝Fc 樣品的表征

分析Fc-SBA-15 和SBA-15 樣品的紅外光譜(圖2),SBA-15 在3 750 cm-1處有清晰的振動譜帶,此振動吸收為硅羥基吸收峰,Fc-SBA-15 在波數(shù)3 750 cm-1處此振動譜帶明顯退化,顯示硅羥基被反應消耗。Fc-SBA-15在波數(shù)3 100 ～2 800 cm-1和1 550 ～1 250 cm-1處有明顯的振動,此振動帶歸屬于N—H和C—H 鍵[11],因為純SBA-15 在此區(qū)域沒有振動,而KH550 中含有N—H 和C—H 鍵,說明KH550 的骨架存在于Fc-SBA-15 中。另外,1 700 ～1 500 cm-1處的振動歸屬于酰胺基團,酰胺基團是KH550 的氨基與二茂鐵甲酸的羧基縮合的結果,由此證明了Fc已被成功接枝到了SBA-15 上。

圖2 Fc-SBA-15 和SBA-15 的紅外譜圖

由圖3 可知,電極插入于0.01M 的PBS 溶液中,電位的掃描速度為50 mV/s,固定了Fc-SBA-15 的介體具有明顯的氧化還原峰,而對照樣SBA-15 則沒有氧化還原峰,證明了在電化學反應中起電子傳遞作用的物質是Fc。

圖3 介體的循環(huán)伏安

2.2 傳感器的性能

在實驗優(yōu)化的條件下,用BOD5為50 m/L 的GGA標準溶液對傳感器進行測試。結果表明,傳感器的質量濃度線性范圍為2 ～300 mg/L,單個傳感器連續(xù)測量20 個標準樣品的精密度為4.2%,傳感器能連續(xù)穩(wěn)定工作35 d(傳感器響應電流衰減在15%以下)。

2.3 pH、溫度和重金屬離子的影響

溶液中的pH 值影響著微生物的生理狀態(tài)?？疾煸谝欢ǖ臓I養(yǎng)條件(ρ(BOD5)=100 mg/L,pH 為6～9)下傳感器固定化微生物的活性。實驗表明,傳感器響應電流差ΔΙ隨著pH 值的增加而逐漸增大,響應電流差ΔΙ在pH 值為7.2 時最大,然后逐漸下降。因此pH 值為7.2 時是最佳條件,具體見圖4。

圖4 pH 對傳感器的影響

溫度是影響微生物生理代謝的重要因素,適宜的溫度能提高微生物的生理活性。在ρ(BOD5)=100mg/L,溫度為20 ～40 ℃的營養(yǎng)條件下,考察了傳感器的響應電流差。結果表明,隨著溫度的上升,傳感器的響應電流差逐漸增大,溫度達到30 ℃時響應值最高,隨后響應值緩慢下降。結果表明溫度為30 ℃時為系統(tǒng)微生物的最適宜溫度,詳見圖5。

圖5 溫度對傳感器的影響

生活污水和工業(yè)廢水中會含有多種重金屬。常見的重金屬離子有Cu2+、Zn2+、Pb2+、Cr3+、Cd2+等。適量的重金屬對微生物的生理影響不大,過量的重金屬對微生物會產(chǎn)生抑制作用,降低微生物的生理活性,使微生物從分解代謝為主轉為內源代謝為主,從而降低了傳感器的響應電流值。筆者研究了Cu2+、Zn2+、Pb2+、Cr3+、Cd2+這5 種重金屬離子對傳感器的影響。結果表明, 在重金屬濃度低于100 mmol/L 時,重金屬對傳感器響應無影響(抑制率小于5%)。重金屬濃度大于500 mmol/L 時,對傳感器的微生物有明顯的抑制作用(抑制率大于15%)。5種重金屬離子的抑制率由大到小順序為：Pb2+、Cd2+、Cu2+、Cr3+、Zn2+。

2.4 實際廢水監(jiān)測

對污染河道河水,污水處理廠(江心洲污水處理廠)進水、出水及食品工業(yè)廢水分別進行BOD 傳感器快速測量,并與BOD5相對照(表1)。結果均表明Fc傳感器法測得的BOD 值(BODs)與標準的五日法測定的值具有良好的可比性。相比而言,低濃度的河水水樣和污水處理廠出水的相關度略差?？赡苁且驗楹铀臀鬯幚韽S出水中難生物降解的大分子有機物相對較多,微生物短時間難以降解。

表1 實際廢水監(jiān)測結果

3 結 論

a.與大分子材料SBA-15 接枝處理而得的介體Fc-SBA-15,在保持了電化學活性的同時,也阻止了介體從包埋材料中流失。

b.實驗得出傳感器的最優(yōu)化工作條件為pH 7.2,溫度30 ℃。廢水中常見的Cu2+、Zn2+、Pb2+、Cr3+、Cd2+重金屬離子在100 mmol/L 濃度下對傳感器無影響。

c.傳感器的線性范圍為2 ～300mg/L,連續(xù)測量20 個樣品的精密度為4.2%,能連續(xù)工作35 d,在線性范圍內對低、中、高濃度實際廢水測得的BOD 值,與BOD5均具有較好的相關度。

[1] LIU J,MATTIASON B.Microbial BOD sensors for wastewater analysis[J] .Water Res,2002,36(15)：3786-3802.

[2] KARUBE I,MATSUNAGA T, MITSUDA S, et al.A microbial electrode BOD sensors[J] .Biotechnol Bioeng,1977,19(10)：1535-1547.

[3] 李洛娜, 鈕玉龍,李捷, 等.BOD 微生物傳感檢測儀中高效微生物膜的研究[J] .環(huán)境工程學報, 2009(3)：437-441.

[4] LIU J,BJORNSSON L,MATTIASSON B.Immobilised activated sludge based biosensor for biochemical oxygen demand measurement[J] .Biosens Bioelectron, 2000, 14(12)：883-893.

[5] 王建龍, 章一心.生物傳感器BOD 快速測定儀的研究進展[J] .環(huán)境科學學報,2007(7)：1066-1082.

[6] PANG H, KWOK N Y.CHAN P H, et al.High-throughput determination of biochemical oxygen demand(BOD)by a microplate-based biosensor[J] .Environ Sci Technol,2007, 41(11)：4038-4044.

[7] RAMSAY G,TURNER A.Development of an electrochemical method for the rapid determination of microbial concentration and evidence for the reaction mechanism[J] .Anal Chim Acta,1988,215：61-69.

[8] ERTL P, ROBELLO E, BATTAGLINI F, et al.Ferricyanide reduction by escherichia coli：kinetics, mechanism, and application to the optimization of recombinant fermentations[J] .Anal Chem,2000, 72：4949-4956.

[9] ERTL P, ROBELLO E,BATTAGLINI F, et al.Rapid antibiotic susceptibility testing via electrochemical measurement of ferricyanide reduction by escherichia coli and clostridium sporogenes[J] .Anal Chem, 2000,72：4957-4964.

[10] NAKAMURA H,SUZUK K,ISHIKURO H, et al.A new BOD estimation method employing a double-mediator system by ferricyanide and menadione using the eukaryote Saccharomyces cerevisiae[J] .Talanta,2007, 72：210-216.

[11] MORRIS K, CATTERALL K, ZHAO H, et al.Ferricyanide mediated biochemical oxygen demand：development of a rapid biochemical oxygen demand assay[J] .Anal Chim Acta,2001,442：129-139.

[12] Japanese Industrial Standard Committee.Apparatus for the estimation of biochemical oxygen demand (BOD) with microbial sensor[P] .Tokyo：Japanese Standards Association,1990.

[13] ZHAO D Y, FENG J, HUO Q, et al.Triblock copolymer syntheses of mesoporoussilica with periodic 50 to 300 angstrom pores[J] .Science,1998,279(5350)：548-552.

[14] 王世輝, 洪秀云, 孫蕊.二茂鐵甲酸的合成[J] .應用化工, 2007,36(6)：540-541.

[15] CHEN H, YE T, QIU B et al.A novel approach based on ferricyanide-mediator immobilized in an ion-exchangeable biosensing film for the determination of biochemical oxygen demand[J] .Anal Chim Acta,2008,612(1)：75-82.

[16] SREYASHI J, BUDDHADEB D, RAJESH B, et al.Anchoring of copper complex in MCM-41 matrix：a high efficient catalyst for epoxidation of olefins by tert-BuOOH[J] .Langmuir, 2007,23：2492-2496.