高小朋,王 平,薛小龍,賀曉龍,任桂梅

(延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 陜西延安 716000)

陜北是我國重要的新興能源化工基地,石油產(chǎn)業(yè)在開采、儲(chǔ)運(yùn)、加工等過程中,經(jīng)常會(huì)發(fā)生泄漏,陜北油井中10%的井場位于水源一級(jí)、二級(jí)保護(hù)區(qū)[1],泄漏的原油對(duì)水體、土壤造成了嚴(yán)重的污染,使陜北地區(qū)的環(huán)境污染與生態(tài)破壞有加劇趨勢[2-3]。石油污染的修復(fù)技術(shù)研究是目前環(huán)境科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[4]。理化方法處理石油污染物因其造價(jià)高,二次污染嚴(yán)重等問題而使其應(yīng)用受到限制[5],而生物處理法是迄今為止處理石油烴污染比較好的一種方法,因處理效果好、費(fèi)用低、無二次污染等優(yōu)點(diǎn)而受到人們的廣泛關(guān)注[6]。筆者利用已有的高效石油降解菌,對(duì)從陜北油區(qū)靖邊天賜灣注水井、子長余家坪選油站和青化砭選油站采集采油污水進(jìn)行了凈化實(shí)驗(yàn),為陜北地區(qū)的采油廢水的微生物凈化提供一定的技術(shù)探索、為建設(shè)環(huán)境友好型社會(huì)提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

a.實(shí)驗(yàn)材料：實(shí)驗(yàn)菌株CT-6 由延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供;實(shí)驗(yàn)所用采油污水和石油分別采自靖邊天賜灣注水井、子長余家坪選油站、青化砭選油站(編號(hào)分別為油樣A、油樣B、油樣C;水樣A、水樣B、水樣C)。

b.試劑：濃硫酸(95%～98%,分析純,西安三浦精細(xì)化工廠生產(chǎn))、石油醚(沸程90 ～120 ℃,分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn))、無水硫酸鈉(分析純,天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠生產(chǎn))。

c.儀器：隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(PYX-DHS-40*50-BS,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠生產(chǎn))、紫外分光光度計(jì)(UVmini-1240,日本島津生產(chǎn))、pH 計(jì)(pHS-25C,上海康儀儀器有限公司生產(chǎn))、立式壓力蒸汽滅菌鍋(LS-B50L,江陰濱江醫(yī)療儀器廠生產(chǎn))。

1.2 方 法

a.實(shí)驗(yàn)菌株的活化與擴(kuò)大培養(yǎng)：將實(shí)驗(yàn)菌株CT-6 接種于LB 液體培養(yǎng)基中,實(shí)驗(yàn)條件為37 ℃、180 r/min、24 h 后將菌液按5%的接種量接種于LB培養(yǎng)基中,實(shí)驗(yàn)條件為37 ℃、180 r/min、培養(yǎng)13 h,如此重復(fù)3 次。

b.污水中石油類物質(zhì)質(zhì)量濃度的檢測。 ①石油波長的選擇[7]：不同產(chǎn)地的石油及其產(chǎn)品在紫外區(qū)不同波長處都有特征吸收峰,不同產(chǎn)地的石油敏感波長不同[8],將不同來源的石油樣品進(jìn)行全波長掃描,確定各種樣品的敏感吸收峰。 ②不同樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[9]：將原油樣品用石油醚稀釋至10 mg/mL作為儲(chǔ)備液待用,分別取儲(chǔ)備液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL 于10 mL 容量瓶中,用石油醚定容, 得到質(zhì)量濃度分別為1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、3.0 mg/mL、4.0 mg/mL、5.0 mg/mL 的石油-石油醚標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量溶液。以石油醚為參比,測定其在特征波長下的光密度(OD)值,以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、相應(yīng)OD 值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由于不同產(chǎn)地原油組分不同,需分別繪制不同產(chǎn)地原油的標(biāo)準(zhǔn)曲線。 ③石油類物質(zhì)質(zhì)量濃度的測定。用紫外分光廣度法[10]測定各樣品中的石油類物質(zhì)質(zhì)量濃度。

c.實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)污水中石油的降解實(shí)驗(yàn)：根據(jù)已有研究結(jié)果[11-12],菌株CT-6 能夠在質(zhì)量濃度分別為葡萄糖5.7 g/L、氯化銨3.8 g/L 的培養(yǎng)基中迅速生長,且在接種量8%、39.6 ℃、198 r/min 實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)石油有較高的降解率,故該實(shí)驗(yàn)在前敘條件下進(jìn)行。在每種污水中按ρ=5.7 g/L、ρ=3.8 g/L 的質(zhì)量濃度分別加入葡萄糖和氯化銨為實(shí)驗(yàn)Ⅰ組,不加任何營養(yǎng)物質(zhì)的污水為實(shí)驗(yàn)Ⅱ組,兩組實(shí)驗(yàn)各做3個(gè)重復(fù),每組同時(shí)以不加菌的污水作為對(duì)照組,從實(shí)驗(yàn)開始,2 d、4 d、6 d、8 d 后分別測定各污水水樣中的殘油量。

2 結(jié)果與分析

2.1 全波長掃描結(jié)果

對(duì)采集3 個(gè)地點(diǎn)的原油樣品進(jìn)行全波長掃描,結(jié)果見圖1。圖1 中的1,2,3,4, …分別代表掃描曲線在此處峰值的數(shù)量。

圖1 3 個(gè)地點(diǎn)的油樣波長分析

由圖1(a)可知,靖邊縣天賜灣原油樣品有最大吸收峰在波長225.20 nm 處,故確定該樣品的特定波長為225.20 nm。

由圖1(b)可知,子長余家坪選油站原油樣品的最大吸收峰在波長226.20 nm 處,故確定該樣品的特定波長為226.20 nm。

由圖1(c)可知,青化砭選油站原油樣品的最大吸收峰在波長226.10 nm 處,故確定該樣品的特定波長為226.10 nm。

2.2 實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)污水中原油的降解結(jié)果

a.經(jīng)分光光度法測定污水中的石油類物質(zhì)質(zhì)量濃度,水樣A 在不同處理?xiàng)l件下的石油類物質(zhì)質(zhì)量濃度見圖2。

圖2 水樣A 實(shí)驗(yàn)

由圖2(a)、(b)可知,實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)采自靖邊縣天賜灣含油污水中的原油降解效果非常明顯,但兩組實(shí)驗(yàn)之間的處理結(jié)果沒有明顯差異,2 d 后實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)實(shí)驗(yàn)Ⅰ組、實(shí)驗(yàn)Ⅱ組水樣中原油的降解率分別達(dá)到了83.40%、85.18%, 質(zhì)量濃度分別為9.42 mg/L、7.86 mg/L,都達(dá)到了國家石油類物質(zhì)排放二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(≤10 mg/L)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,降解效果增加不明顯,8 d 時(shí)實(shí)驗(yàn)Ⅰ組的質(zhì)量濃度降至5.49 mg/L,實(shí)驗(yàn)Ⅱ組水樣的質(zhì)量濃度為4.21 mg/L,實(shí)驗(yàn)Ⅱ組達(dá)到了國家石油類物質(zhì)排放一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(≤5 mg/L)。其原因可能是：實(shí)驗(yàn)Ⅰ組加入營養(yǎng)物質(zhì),為菌株提供碳、氮源, 和石油物質(zhì)產(chǎn)生共代謝, 加速了石油降解[13],當(dāng)營養(yǎng)物質(zhì)利用完后,降解率也不再增加;實(shí)驗(yàn)Ⅱ組沒有添加營養(yǎng)物質(zhì),在較低的原油質(zhì)量濃度下,實(shí)驗(yàn)菌株可以將原油作為碳源,有效地將原油分解利用。

b.經(jīng)分光光度法測定污水中的石油類物質(zhì)質(zhì)量濃度,水樣B 在不同處理?xiàng)l件下的石油類物質(zhì)質(zhì)量濃度見圖3。

圖3 水樣B 實(shí)驗(yàn)

由圖3(a)、(b)可知,實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)采自子長余家坪選油站含油污水中的石油降解效果較為明顯。2 d 時(shí)實(shí)驗(yàn)Ⅰ組和Ⅱ組水樣中的石油類物質(zhì)質(zhì)量濃度分別為：51.42 mg/L、182.34 mg/L,隨著降解時(shí)間的增加,水樣中的石油類物質(zhì)質(zhì)量濃度逐漸降低,到第8 天時(shí),實(shí)驗(yàn)Ⅰ組、實(shí)驗(yàn)Ⅱ組水樣中的石油類物質(zhì)質(zhì)量濃度分別為32.56 mg/L、19.52 mg/L,降解率分別達(dá)到49.56%、85.49%,實(shí)驗(yàn)Ⅱ組達(dá)到了石油類物質(zhì)國家排放三級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(≤20 mg/L)。在實(shí)驗(yàn)2 ～6 d時(shí),實(shí)驗(yàn)Ⅰ組的處理效果要優(yōu)于實(shí)驗(yàn)Ⅱ組,其原因可能是,實(shí)驗(yàn)Ⅰ組因?yàn)榧尤霠I養(yǎng)物質(zhì)和石油物質(zhì)產(chǎn)生共代謝,加速了石油的降解[13]。而當(dāng)營養(yǎng)物質(zhì)消耗完畢,降解率便不再增加。而實(shí)驗(yàn)Ⅱ組從實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)入污水中開始,就開始適應(yīng)環(huán)境,隨著對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性增強(qiáng),降解能力也在不斷增加。

c.經(jīng)分光光度法測定污水中的石油類物質(zhì)質(zhì)量濃度,水樣C 在不同處理?xiàng)l件下的石油類物質(zhì)質(zhì)量濃度見圖4。

圖4 水樣C 實(shí)驗(yàn)

從圖4(a)、(b)可知,實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)采自青化砭選油站的含油污水中的原油降解效果并不明顯,經(jīng)過8 d 的降解,實(shí)驗(yàn)Ⅰ組的和實(shí)驗(yàn)Ⅱ組的石油類物質(zhì)質(zhì)量濃度分別為678.35 mg/L、802.13 mg/L,實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)原油的降解率分別為6.8%和2.4%。這可能是由于原油質(zhì)量濃度過高,處理效果比較差,其原因可能是：①經(jīng)事后了解,在采樣之前,水樣C 進(jìn)行了酸化處理,過高的酸度可能導(dǎo)致了實(shí)驗(yàn)菌株的死亡,所以,處理效果比較差;②可能與水樣C 中的原油本身的理化性質(zhì)有關(guān),因?yàn)樵诓煌貐^(qū)所產(chǎn)石油的組分和理化性質(zhì)有一定差異,這對(duì)微生物的降解也存在影響。有研究報(bào)道[14],用同一種微生物降解不同地區(qū)產(chǎn)的石油,有不同的降解效果,這說明石油本身的性質(zhì)對(duì)微生物的降解有一定的影響。

3 結(jié) 論

a.利用陜北石油高效降解菌分別對(duì)采自靖邊天賜灣注水井、子長余家坪選油站、青化砭選油站的含油污水進(jìn)行了凈化處理,結(jié)果為：靖邊天賜灣注水井水樣在處理2 d 后,達(dá)到國家石油類物質(zhì)排放二級(jí)標(biāo)準(zhǔn),8 d 后達(dá)到一級(jí)排放標(biāo)準(zhǔn);子長余家坪選油站水樣處理8 d 后,達(dá)到國家石油類物質(zhì)排放三級(jí)標(biāo)準(zhǔn);青化砭選油站水樣處理效果并不明顯。

b.3 個(gè)水樣的初始石油類物質(zhì)質(zhì)量濃度排序是水樣A ＜水樣B ＜水樣C,從整體處理效果來看,水樣A 優(yōu)于水樣B、水樣B 優(yōu)于水樣C。其原因可能是和各水樣中的初始石油類物質(zhì)質(zhì)量濃度有關(guān),初始石油類物質(zhì)質(zhì)量濃度越大,處理效果越差。這是因?yàn)槭皖愇镔|(zhì)濃度對(duì)降解有很大影響,油量越大,覆蓋于水樣表面的油膜越厚、面積越大,使得氧氣難以進(jìn)入,從而影響實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)氧的利用,抑制其生長[15],在石油類物質(zhì)濃度過高時(shí),也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株利用其他的營養(yǎng)鹽產(chǎn)生一定的阻礙,這一結(jié)果也和Arco 等[16]提出的“隨石油濃度的升高,最終降解率逐漸降低,降解率與石油濃度成負(fù)相關(guān)關(guān)系”觀點(diǎn)相吻合。

c.從每一水樣的兩組實(shí)驗(yàn)來看,結(jié)果并不完全相同,水樣A 和水樣B 的處理結(jié)果說明,實(shí)驗(yàn)Ⅱ組比實(shí)驗(yàn)Ⅰ組處理效果好,由于實(shí)驗(yàn)Ⅱ組不用加營養(yǎng)物質(zhì),因此,對(duì)這兩個(gè)水樣,采用直接給水樣中投加菌體的方法較好一些。

[1] 許瑾.陜西省將對(duì)陜北石油開發(fā)中的環(huán)境污染問題進(jìn)行專項(xiàng)整治[N] .華商報(bào),2005-02-26(04).

[2] 孫寧生, 周軍.延安市石油開采污染治理調(diào)查及其防治對(duì)策[J] .陜西環(huán)境,2001, 8(1)：11-12.

[3] 史紅星, 黃廷林.石油類污染物在黃土高原地區(qū)環(huán)境中遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律的研究[D] .西安：西安建筑科技大學(xué),2001.

[4] 曹娟,徐志輝, 李凌之,等.產(chǎn)生物表面活性劑的石油降解菌Acinetobacter BHSN 的研究[J] .生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境學(xué)報(bào), 2009,25(1)：73-78.

[5] 宋志文, 夏文香, 曹軍.海洋石油污染物的微生物降解與生物修復(fù)[J] .生態(tài)學(xué)雜志,2004,23(3)：99-102.

[6] 郝洪強(qiáng), 孫瑋敏, 陳洪利.石油烴類的微生物降解研究進(jìn)展[J] .河北化工,2008,31(12)：4-6.

[7] 顧貴洲,王戰(zhàn)勇, 于泳,等.石油降解菌株的篩選及鑒定[J] .遼寧石油化工大學(xué)學(xué)報(bào),2007(1)：26-28.

[8] 王哲,王麗娟, 劉少玉,等.黃土地區(qū)石油污染土壤生物修復(fù)的強(qiáng)化技術(shù)初探[J] .現(xiàn)代地質(zhì), 2009(1)：116-121.

[9] 李春榮,文科, 曹玉清,等.石油污染物的微生物降解研究[J] .生態(tài)環(huán)境,2008,17(1)：113-116.

[10] 奚旦立, 孫裕生,劉秀英.環(huán)境監(jiān)測[M] .北京：高等教育出版社, 1995：389-407.

[11] 高小朋, 王躍,邊志波, 等.一株石油降解菌培養(yǎng)基的優(yōu)化[J] .生物技術(shù),2010(6)：12-13.

[12] 高小朋, 徐盈,邊志波, 等.一株石油降解菌降解條件的優(yōu)化[J] .食品發(fā)酵工業(yè),2009,35(6)：75-78.

[13] 謝丹平.石油污染生物修復(fù)技術(shù)研究[J] .四川環(huán)境,2006,25(4)：109-112.

[14] DELILLE D,DELILLE B.Field observations on the variability of crude oil impact on indigenous hydrocarbon -degrading bacteria from sub-Antarctic intertidal sediments[J] .Marine Environmental Research,2000,49：403-417.

[15] 蘇瑩, 陳莉, 劉兆普.一株海洋石油降解菌的特性研究[J] .環(huán)境科學(xué)研究,2008,21(5)：32-36.

[16] ARCO J P, FRANCA F P.Influence of oil contamination levels on hydrocarbon biodegradation in sandy sediment[J] .Environmental Pollution,2001,110：515-519.