王秋艷，藍(lán)袁洋，李海峰，張亞麗，黃黎鋒

（杭州師范大學(xué)生物醫(yī)藥與健康中心，浙江 杭州 311121）

短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆、序列分析及表達(dá)

王秋艷，藍(lán)袁洋，李海峰，張亞麗，黃黎鋒

（杭州師范大學(xué)生物醫(yī)藥與健康中心，浙江 杭州 311121）

為獲得具有催化活性的糖基轉(zhuǎn)移酶純酶，本研究以短小芽孢桿菌基因組DNA為模板，利用簡并PCR技術(shù)擴(kuò)增到基因（GT-A）全長序列.該序列全長1 287bp、編碼423個氨基酸，分子量約為49.2KD.經(jīng)序列分析，該基因?qū)儆谔腔D(zhuǎn)移酶基因.根據(jù)GT-A 基因開放閱讀框序列設(shè)計(jì)引物，構(gòu)建了原核表達(dá)重組質(zhì)粒GTA-pet28a，并在大腸桿菌BL21（DE3）中成功誘導(dǎo)出了一個約50kD的融合蛋白.純化后測定其糖基轉(zhuǎn)移酶活性，與37℃相比，80℃的反應(yīng)溫度其活性能提高3.4倍左右.研究結(jié)果表明，該酶是一種具有應(yīng)用潛力的嗜高溫糖基轉(zhuǎn)移酶.

短小芽孢桿菌；原核表達(dá)；糖基轉(zhuǎn)移酶

糖基轉(zhuǎn)移酶（EC 2.4.x.y）是自然界存在的最為多樣性的一大類酶，糖基轉(zhuǎn)移酶負(fù)責(zé)將活性供體的單糖部分轉(zhuǎn)移至糖、蛋白質(zhì)、脂類、核酸以及另外一些小分子，即完成糖基化反應(yīng)，形成具有很多生物學(xué)功能的糖基化產(chǎn)物[1－2].糖基轉(zhuǎn)移酶在所有生命體中都扮演著重要的生物學(xué)角色，日益引起人們的重視.蛋白質(zhì)的糖基化修飾和天然糖蛋白的去糖基化是研究糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)和功能的重要手段之一.其中糖基轉(zhuǎn)移酶是該反應(yīng)中的有用工具.已純化的糖基轉(zhuǎn)移酶是目前糖基化工程中的重要酶，為研究糖蛋白糖鏈的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系以及細(xì)胞表面糖基化修飾提供了極好的方法[3－5].目前對這些酶的研究還處于起步階段，純化的酶種類依然很少.本實(shí)驗(yàn)利用PCR技術(shù)從短小芽孢桿菌中克隆了糖基轉(zhuǎn)移酶基因，構(gòu)建了原核表達(dá)重組質(zhì)粒，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，純化后測定其活性，為利用糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行活性產(chǎn)物改造提供了有利條件.

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用短小芽孢桿菌為本實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)所得，DH5а，BL21（DE3）感受態(tài)為實(shí)驗(yàn)室自制，限制性內(nèi)切酶，T4連接酶，Taq DNA聚合酶，瓊脂糖凝膠回收試劑盒，PMD-19Teasy購于大連寶生物工程公司

（TaKaRa Biotechnology），Pet28a質(zhì)粒、質(zhì)粒提取試劑盒購自 Novagen，對硝基苯基－α-D-吡喃葡萄糖苷購于百靈威科技有限公司.

1.2 方法

1.2.1 糖基轉(zhuǎn)移酶基因（GT-A）的克隆測序

根據(jù)GenBank中Bacillus pumilus基因組序列，設(shè)計(jì)引物Bp-as TATCCTAAACACCTCCTTGAA，Bp-aRs GAACAACATATTGATTCCCTCT，擴(kuò)增條件：94 ℃ 10min；94 ℃30s，50 ℃ 45s，72℃90s，30個循環(huán)；72℃10min.PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的片段切膠回收，與PMD-19Teasy連接，轉(zhuǎn)化DH5а感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選，利用通用引物M13進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，陽性克隆送上海生工測序.1.2.2 重組糖基轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)測出的糖基轉(zhuǎn)移酶序列開放閱讀框設(shè)計(jì)引物，上游引物為Bba-bds：ccgGaattccggatggtggctgatgtttta（下劃線為EcoRI位點(diǎn)），下游引物為Bba-bdRs：ccgCtcgagcggtcacccgcttttcttttg（下劃線為xhoI位點(diǎn)），擴(kuò)增條件：94℃10min；94℃30s，50℃45s，72℃90s，30個循環(huán)；72℃10min.將目的片段1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測回收并與PMD-19Teasy載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5а感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選，用通用引物M13進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證.

將陽性菌落轉(zhuǎn)接過夜培養(yǎng)，利用質(zhì)粒提取試劑盒提取陽性重組質(zhì)粒GTA-T.分別用EcoRI和xhoI雙酶切重組質(zhì)粒GTA-T和質(zhì)粒pet28a（Novagen），瓊脂糖凝膠電泳回收酶切片段，按照質(zhì)粒DNA與目的基因用量比1∶3，用T4連接酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5а感受態(tài)細(xì)胞，在卡那霉素抗性平板上篩選轉(zhuǎn)化子，隨機(jī)挑取克隆菌落PCR鑒定，并測序驗(yàn)證.將測序正確的陽性克隆過夜搖菌，并提取重組質(zhì)粒GTA-pet28a.

1.2.3 重組糖基轉(zhuǎn)移酶基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

經(jīng)鑒定的陽性GTA-pet28a重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）中，挑取單菌落到含有50ng／μL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，180rpm／min培養(yǎng)過夜，1%接種至新鮮LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至菌體光密度值OD600≈0.6～0.8，加入IPTG至終濃度為1mM／L，28℃150rpm／min繼續(xù)培養(yǎng)5h后，取1mL菌液，5 000r／min離心10min，去除上清，用pH7.4PBS將沉淀重新懸浮5 000r／min離心10min，收集菌體，用20μLPBS重懸浮，并加入20μL 2×SDS凝膠加樣緩沖液后震蕩懸浮，煮沸10min后進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳分析.

1.2.4糖基轉(zhuǎn)移酶基因（GT-A），酶活測定

GT-A粗酶液，經(jīng)過低溫Ni-NTA 柱純化、透析，得到純酶液.在300μL pH7.0的磷酸緩沖液中，加入純化的GTA酶液100μL，1g／L對硝基苯基－α-D-吡喃葡萄糖苷200μL為底物，分別在37℃、80℃下保存0（空白對照）、10、20、60min.之后在波長405nm處測吸光值.

2 結(jié)果與分析

2.1 糖基轉(zhuǎn)移酶基因（GT-A）的PCR擴(kuò)增

提取短小芽孢桿菌的基因組DNA為模板.采用引物Bp-as／BpaRs，擴(kuò)增出一條約1.2kb大小的DNA片段.如圖1所示.回收PCR產(chǎn)物與載體PMD-19Teasy連接，轉(zhuǎn)化DH5а感受態(tài)細(xì)胞，在含有IPTG（40mg／mL）和 X-gal（20mg／mL）的氨卞抗生素（100μg／mL）的LB平板上進(jìn)行37℃過夜培養(yǎng).

2.2 糖基轉(zhuǎn)移酶基因（GT-A）的序列分析

隨機(jī)挑取糖基轉(zhuǎn)移酶的陽性克隆，對插入片段進(jìn)行測序，結(jié)果如圖2所示.序列含有一個完整的開放閱讀框，編碼423個氨基酸，分子量約為49.2kD.等電點(diǎn)約為9.361.其中含187個疏水性氨基酸96個極性偏中性氨基酸47個堿性氨基酸和35個酸性氨基酸.測序結(jié)果用BLAST進(jìn)行比對，GT-A蛋白與來源于芽孢桿菌糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白（SAFR-032）同源性為72%、（QM B1551）同源性65%、（DSM319）同源性62%.由此可見，GT-A蛋白為一種新型糖基轉(zhuǎn)移酶.

注：lane1，糖基轉(zhuǎn)移酶基因增產(chǎn)物；lane2，DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量Note：lane1，PCR product of glycosyltransferase；Lane 2，DNA marker

圖2 核酸和氨基酸序列結(jié)果Fig.2 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence

2.3 糖基轉(zhuǎn)移酶基因（GT-A）表達(dá)載體構(gòu)建

利用測出的糖基轉(zhuǎn)移酶序列，設(shè)計(jì)表達(dá)引物，兩端引入酶切位點(diǎn)，將擴(kuò)增產(chǎn)物與PMD-19Teasy連接后，轉(zhuǎn)化DH5а感受態(tài)細(xì)胞，并挑取陽性克隆放大培養(yǎng)，提取GTA-T陽性重組質(zhì)粒.GTA-T陽性重組質(zhì)粒EcoRI與XhoI雙酶切結(jié)果如圖3所示，將GTA-T雙酶切產(chǎn)物回收與同樣酶切的pet28a連接轉(zhuǎn)化DH5а，利用通用引物T7鑒定陽性重組質(zhì)粒GTA－pet28a，如圖4所示.鑒定為陽性菌的重新提取重組質(zhì)粒GTA－pet28a，轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）感受態(tài)中，挑陽性克隆培養(yǎng).

2.4 糖基轉(zhuǎn)移酶基因（GT-A）的誘導(dǎo)表達(dá)

含有GTA－pet28a的BL21（DE3）工程菌，在氨芐LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng).按1／1 000轉(zhuǎn)接到新的氨芐LB培養(yǎng)基中，在 OD值達(dá)到0.6～0.8之間，加入1.0mM IPTG，不同時間6、8、10h誘導(dǎo)后，SDS-PAGE膠電泳，考馬斯亮藍(lán)染色后，在大約50KD處有一明顯的特異蛋白條帶.通過對GT-A酶進(jìn)行不同時間段的誘導(dǎo)，我們可以看出8h之前沒有明顯表達(dá)量的差距，在10h誘導(dǎo)之后，可以得到相對較好的表達(dá)量（圖5）.根據(jù)PET-28a載體所帶的6xHis標(biāo)簽特性，利用Ni-NTA純化GTA粗酶液，經(jīng)過SDS-PAGE膠鑒定，可以在50KD處有一條明顯特異性條帶（圖6），使GT-A得到了一定程度的純化.為我們下一步進(jìn)行活性測定奠定了基礎(chǔ).

2.5 糖基轉(zhuǎn)移酶基因（GT-A）的酶活測定

取純化GTA酶液，以硝基苯基－α-D-吡喃葡萄糖苷為底物，在80℃隨著反應(yīng)時間的增長，產(chǎn)物增多，與37℃下的活性相比，提高了約3.4倍（圖7）.可以判斷此糖基轉(zhuǎn)移酶為嗜熱酶，在高溫下有較好的活性.

3 結(jié) 論

糖基是許多功能性化合物如堿性黃酮、抗生素等的重要組成部分[6－9]，糖基轉(zhuǎn)移酶參與糖苷類化合物生物合成，是對糖分子進(jìn)行生物學(xué)方法改造的重要對象[10].其可以催化不同的糖基與特定的受體分子結(jié)合，從而產(chǎn)生大量的寡糖、多聚糖和其它結(jié)構(gòu)多樣性的糖苷類化合物[11].本研究利用引物簡并性，運(yùn)用PCR技術(shù)在短小芽孢桿菌中成功克隆到一個糖基轉(zhuǎn)移酶基因的全長.通過對其擴(kuò)增結(jié)果與GenBank上的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對、成功誘導(dǎo)表達(dá)、純化和活性測定，結(jié)果表明，該酶是一種新酶，具有較合適的誘導(dǎo)條件、在高溫下具有較高的酶活性，具有一定程度的應(yīng)用特性.

圖7 GT-A酶活測定Fig.7 Detection of GT-A activites

[1]Faijes M，Planas A.In vitro synthesis of artificial polysaccharides by glycosidases and glycosynthases[J].Carbohydrate Research，2007，342（12／13）：1581-1594.

[2]盧麗麗，肖敏，趙晗.具有轉(zhuǎn)糖基活性的糖苷酶的分子進(jìn)化[J].生命的化學(xué)，2007，27（1）：45-48.

[3]Kren V，MartínkováL.Glycosides in medicine：“The role of glycosidic residue in biological activity”[J].Current Medicinal Chemistry，2001，8（11）：1303-1328.

[4]Hancock S M，Vaughan M D，Withers S G.Engineering of glycosidases and glycosyltransferases[J].Current Opinion in Chemical Biology，2006，10（5）：509-519.

[5]代煥琴，王浩鑫，沈月毛.抗生素糖基轉(zhuǎn)移酶研究進(jìn)展[J].中國抗生素雜志，2007，32（5）：257-262.

[6]Palomo E S，Hidalgo M，Gonzalez-Vinas M，etal.Aroma enhancement in wines from different grape varieties using exogenous glycosidases[J].Food Chemistry，2005，92（4）：627-635.

[7]Sianidis G，Wohlert S E，Pozidis C，etal.Cloning，purification and characterization of a functional anthracycline glycosyltransferase[J].Journal of Biotechnology，2006，125（3）：425-433.

[8]Lairson L，Henrissat B，Davies G，etal.Glycosyltransferases：structures，functions，and mechanisms[J].Biochemistry，2008，77（1）：521.

[9]Luzhetskyy A，Mendez C，Salas J A，etal.Glycosyltransferases，important tools for drug design[J].Current Topics in Medicinal Chemistry，2008，8（8）：680-709.

[10]Stanley P，Ioffe E.Glycosyltransferase mutants：key to new insights in glycobiology[J].The FASEB Journal，1995，9（14）：1436-1444.

[11]吳佳茜，王旻，陳代杰.糖基轉(zhuǎn)移酶定向進(jìn)化研究進(jìn)展[J].生命科學(xué)，2009（3）：388-393.

Cloning，Sequence Analysis and Prokaryotic Expression of the Glycosyltransferase Gene inBacilluspumilus

WANG Qiu-yan，LAN Yuan-yang，LI Hai-feng，ZHANG Ya-li，HUANG Li-feng
（Center for Biomedicine and Health，Hangzhou Normal University，Hangzhou 311121，China）

To get purified glycosyltransferase with catalytic ability，a full length sequence ofGT-Agene was amplified by PCR reaction with genomic DNA inBacillus pumilusas the template.The 1 287bp sequence encoded a protein of 423 amino acid with molecular weight of about 49.2kD.Sequence analysis implied that the gene was a glycosyltransferase gene.Prokaryotic recombinant expression vectorGTA-pet28awas constructed based on the ORF （open reading frame）of the glycosyltransferase gene and was expressed in Escherichia coli BL21（DE3）.A recombinant protein of about 50kD was produced in the inducible expression system.The activity of the enzyme at 80℃ was 3.4times higher than that at 37℃.The results show that the glycosyltransferase is a thermophilic enzyme with potential applications.

Bacilluspumilus；prokaryotic expression；glycosyltransferase

Q75

A

1674-232X（2012）04-0364-05

11.3969／j.issn.1674-232X.2012.04.015

2011-12-12

杭州市科技局科研項(xiàng)目（KH10365；20090231T06）.

黃黎鋒（1979—），男，副研究員，博士，主要從事分子生物學(xué)與酶學(xué)研究.E-mail：huang＠hznu.edu.cn