鄭曉濤，隆小華，劉 玲 ，陳 良，劉兆普

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 江蘇省海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210095

菊芋(Helianthus tuberosus L.)，俗名洋姜，是菊科向日葵屬多年生草本植物。原產(chǎn)北美洲，十七世紀(jì)傳入歐洲，后傳入中國(guó)。它分布廣，適應(yīng)性強(qiáng)，極易種植，產(chǎn)量頗高，成本低廉［1］。其塊莖可用于發(fā)酵產(chǎn)乙醇［2］，也可水解生產(chǎn)高果糖漿［3］，其葉片提取物具有良好的殺菌活性，可用于開發(fā)植物源抑菌劑［4］。

黃酮類化合物具有多種的生物活性和藥用價(jià)值［5，6］，應(yīng)用價(jià)值廣泛，市場(chǎng)開發(fā)潛力很大。從上世紀(jì)六、七十年代開始，國(guó)內(nèi)外就有科研人員開展了對(duì)向日葵屬植物化學(xué)成分的研究，已從該屬的H. microcephali、H.angustifolii、H. corona-solis、H. grosseserrats、H. annuus 等 中 分 離 出 豐 富 的 黃 酮 類 化 合物［7-12］。本研究以菊芋葉為原料，采用回流法對(duì)菊芋葉總黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)不同采集時(shí)間的菊芋葉總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定，旨在確定菊芋葉總黃酮的最佳提取工藝條件和最佳采樣時(shí)間，為菊芋資源的綜合開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菊芋葉:分別于2010 年5、7、9 和11 月的中旬采集于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)大豐試驗(yàn)基地，菊芋品種為南芋1 號(hào)。單因素及正交試驗(yàn)所有葉片材料為9 月份所采。60 ℃烘干，粉碎后過(guò)40 目篩備用;蘆丁對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所);其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純;水為重蒸水。

1.2 儀器與設(shè)備

AUY 120 型分析天平(日本島津科學(xué)儀器公司);101A-Z 型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠);FZ102 微型粉碎機(jī)(天津泰斯特有限公司);UV-2450 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津科學(xué)儀器公司);HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋(國(guó)華電器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 提取工藝流程

菊芋葉→60 ℃烘干→粉碎→準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量→甲醇熱回流→過(guò)濾→定容至50 mL，即為提取液。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取蘆丁對(duì)照品12.35 mg，用70%甲醇(體積分?jǐn)?shù))溶解，轉(zhuǎn)入50 mL 量瓶中，用70%甲醇定容，配成0.247 mg/mL 的蘆丁對(duì)照品溶液。分別吸取對(duì)照品溶液0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL 于50 mL容量瓶中，各加水至25 mL;加入5%NaNO2溶液2 mL，搖勻;加入10% Al(NO3)3溶液2 mL，搖勻，放置6 min;加入4% NaOH 溶液10 mL，用70%甲醇定容，搖勻［13］。以第一管為空白，于510 nm 下檢測(cè)吸光值。以吸光值為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用最小二乘法作線性回歸，其回歸方程為:A= 8.369C + 0.008(r2=0.9972)。

1.3.3 總黃酮含量的測(cè)定

吸取2 mL 提取液置于50 mL 容量瓶中，按上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法配制溶液，并以試劑空白為參比液調(diào)零，510 nm 測(cè)取其吸光度。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算提取液中的總黃酮含量，總黃酮含量為:

式中:Y 為總黃酮含量;C 為由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出的待測(cè)試液的總黃酮質(zhì)量濃度(mg/mL);V 為待測(cè)試液的體積(mL);D 為待測(cè)試液的稀釋倍數(shù);m為菊芋葉粉末質(zhì)量(g)。

1.4 因素水平設(shè)定

1.4.1 單因素試驗(yàn)

1.4.1.1 甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮含量的影響

稱取1.00 g 菊芋葉，以不同的體積分?jǐn)?shù)(10%、30%、50%、70%、90%)的甲醇溶液為溶劑，料液比為1∶30，提取溫度為70 ℃，提取時(shí)間1 h。

1.4.1.2 提取時(shí)間對(duì)總黃酮含量的影響

稱取1.00 g 菊芋葉，以體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇溶液，料液比為1∶30，溫度70 ℃，回流提取0.5、1、2、3、4 h。

1.4.1.3 固液比對(duì)總黃酮含量的影響

稱取1.00 g 菊芋葉，用體積分?jǐn)?shù)70%的甲醇溶液，溫度70 ℃，按不同固液比(1 ∶5、1 ∶10、1 ∶20、1∶30、1∶40)，回流提取1 h。

1.4.1.4 提取溫度對(duì)總黃酮含量的影響

稱取1.00 g 菊芋葉，分別用不同的溫度(40、50、60、70、80 ℃)，以體積分?jǐn)?shù)70%的甲醇為提取劑，回流提取時(shí)間為1 h，固液比為1∶30，

1.4.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定以甲醇體積分?jǐn)?shù)(A)、提取時(shí)間(B)、固液比(C)、提取溫度(D)四個(gè)因素及其對(duì)應(yīng)的3 個(gè)較優(yōu)水平，選用L9(34)正交設(shè)計(jì)表進(jìn)行試驗(yàn)(表1)，優(yōu)化菊芋葉總黃酮的提取工藝，每個(gè)處理三次重復(fù)。

表1 L9(34)因素水平表Table 1 Factors and levels of the test L9(34)

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮含量的影響

隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的增大，提取的總黃酮含量逐漸增加，甲醇體積分?jǐn)?shù)從10%增加到70%時(shí)，測(cè)得的總黃酮含量從4.36%提高到5.91%，在70%時(shí)達(dá)到最大，其后隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的增大，測(cè)得的總黃酮含量反而降低，造成這種現(xiàn)象可能是由于甲醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)高時(shí)，水溶性黃酮的溶出減少而脂溶性雜質(zhì)如色素、鞣質(zhì)等溶出增多，由于雜質(zhì)與脂溶性黃酮競(jìng)爭(zhēng)溶劑，從而使黃酮提取量下降［14］。因此甲醇體積分?jǐn)?shù)選70%為宜。

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)總黃酮含量的影響

隨著提取時(shí)間的增加，提取的總黃酮含量逐漸增加，提取時(shí)間從0.5 h 增加至3 h 時(shí)，測(cè)得的總黃酮含量由5.16%增加至6.63%，而3 h 過(guò)后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，菊芋葉總黃酮的含量有所下降，這表明不同提取時(shí)間對(duì)總黃酮含量的影響很大，時(shí)間過(guò)短，目標(biāo)成分不能充分溶出，時(shí)間太長(zhǎng)，則可能造成部分對(duì)熱不穩(wěn)定的黃酮分解損失，使得總黃酮含量下降［15］。因此，提取時(shí)間選擇3 h 為宜。

2.1.3 固液比對(duì)總黃酮含量的影響

隨著固液比的增加，提取的總黃酮含量逐漸增加，當(dāng)固液比從1∶5 增加到1∶20 時(shí)，測(cè)得的總黃酮含量由3.53%增加至5.89%。當(dāng)固液比為1 ∶20時(shí)，提取就可以達(dá)到比較好的效果。再增加提取溶劑的量對(duì)總黃酮含量增加效果影響不大，考慮到生產(chǎn)成本，固液比以1∶20 為宜。

2.1.4 提取溫度對(duì)總黃酮含量的影響

隨著提取溫度的升高，提取的總黃酮含量也逐漸升高，當(dāng)溫度由40 ℃升高到70 ℃時(shí)，測(cè)得的總黃酮含量由4.97%增加到6.71%，當(dāng)溫度升高到80℃時(shí)，測(cè)得總黃酮含量為6.72%。這是因?yàn)殡S著提取溫度升高，分子的運(yùn)動(dòng)速度增加，滲透和擴(kuò)散作用增強(qiáng)，使得菊芋葉片中的黃酮類化合物更容易溶出。同時(shí)考慮到能耗，選擇70 ℃為宜。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

精確稱量干燥的菊芋葉每份1.00g，按表1 的因素水平，用L9(34)正交試驗(yàn)方法優(yōu)化菊芋葉總黃酮提取工藝結(jié)果見(jiàn)表2，并對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析(表3)。結(jié)果表明:四個(gè)因素都對(duì)總黃酮含量有極顯著影響。其中甲醇體積分?jǐn)?shù)(C)對(duì)總黃酮含量影響最大，提取溫度(D)、固液比(A)次之，提取時(shí)間(B)影響最小。經(jīng)極差分析和方差分析確定最佳工藝組合為A3B2C3D3，即用70%甲醇以1∶30 的固液比在80 ℃條件下提取2 h。

2.3 正交優(yōu)化驗(yàn)證性試驗(yàn)

由極差及方差分析得到的最佳提取工藝條件并不在正交試驗(yàn)表安排的試驗(yàn)中，需做驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)。用上述確定的最佳提取工藝條件進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，總黃酮含量為7.03%，RSD 0.3%，比3 號(hào)試驗(yàn)的提取率稍高，說(shuō)明所選取的工藝確為最佳工藝。

2.4 不同采收期菊芋葉總黃酮含量變化

精確稱量不同采收期菊芋葉干粉1.00 g，按正交試驗(yàn)確定的最佳工藝條件制備供試樣品溶液，按1.3.3 方法測(cè)定，每份樣品平行測(cè)定3 次。結(jié)果如圖1 所示，5～9 月份菊芋葉總黃酮含量呈上升趨勢(shì)，9 月份達(dá)到最高，11 月份含量下降。

表2 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 L9(34)orthogonal array design arrangement and results

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance for the total flavonoids content with different extraction conditions

圖1 不同采收時(shí)期對(duì)總黃酮的影響Fig.1 Total flavonoids content in different harvest time

3 結(jié)論

采用單因素及L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)菊芋葉總黃酮的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，確定菊芋葉總黃酮提取的最佳工藝條件為:選用甲醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取溫度80 ℃，固液比1∶30，回流時(shí)間2 h 時(shí)，總黃酮含量最大。驗(yàn)證試驗(yàn)表明，在此條件下，回流提取菊芋葉總黃酮含量可達(dá)7.03%。研究為菊芋葉黃酮的開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。

黃酮含量動(dòng)態(tài)變化研究發(fā)現(xiàn)，不同季節(jié)采摘的菊芋葉其總黃酮含量呈動(dòng)態(tài)積累的趨勢(shì)，在9 月份最高，于11 月份下降。通過(guò)對(duì)菊芋葉總黃酮含量的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，可確定其最佳的采收時(shí)間為9 月份。

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