劉亞旻，宋 波，李宗陽，姜保平，潘瑞樂

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植研究所 中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種以嚴(yán)重的認(rèn)知和記憶功能減退為臨床表現(xiàn)的神經(jīng)退行性病變［1，2］。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，尚不完全清楚。目前，被廣為接受的病理學(xué)說為“膽堿能缺失學(xué)說”，其學(xué)說認(rèn)為乙酰膽堿的缺失導(dǎo)致AD 患者認(rèn)知功能下降，記憶能力喪失［3］。而膽堿酯酶(ChE)是生物神經(jīng)傳導(dǎo)中的一種非常重要的酶，膽堿酯酶會(huì)催化乙酰膽堿的裂解反應(yīng)，導(dǎo)致乙酰膽堿的缺失、神經(jīng)信號(hào)傳遞失敗。膽堿酯酶根據(jù)其催化底物的特異性分為乙酰膽堿酯酶(AChE)和丁酰膽堿酯酶(BuChE)。故目前對(duì)老年癡呆的藥物治療主要是通過抑制ChE 來提高患者體內(nèi)的乙酰膽堿水平［4，5］。但是傳統(tǒng)的選擇性AchE 抑制劑，不但外周副作用較大，且長期用藥效果不理想，而選擇性BuchE 抑制劑可使細(xì)胞外乙酰膽堿濃度增加15 倍，且未發(fā)現(xiàn)膽堿樣副作用［6-8］。因此，尋找AChE 和BuChE 雙重抑制劑為治療AD 提供了新的思路。本課題組前期運(yùn)用薄層色譜生物自顯影和微孔高通量篩選方法，對(duì)40 種抗老年癡呆有潛在作用的中藥進(jìn)行了篩選，結(jié)果篩選出11 種具有膽堿酯酶雙重抑制作用的中藥，其中前胡(Radix Peucedani )是作用較強(qiáng)的中藥之一，總ChE 抑制率＞50%。應(yīng)用水蒸氣蒸餾法將前胡分為揮發(fā)油和水提物兩個(gè)部位，對(duì)兩個(gè)部位的膽堿酯酶抑制活性進(jìn)行篩選，結(jié)果表明揮發(fā)油具有較好的抑酶作用，而水提物部位作用較弱。本研究對(duì)前胡揮發(fā)油AChE 和BuChE 的體外抑制作用進(jìn)行了研究，并運(yùn)用GC-MS 結(jié)合Kovats 指數(shù)對(duì)揮發(fā)油成分進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器設(shè)備

美國GC (Varian 431-GC Gas Chromatograph，VF-5 布魯克)/MS(Varian 300-MS TQ Mass Spectrometer)儀;GC-MS Solution 色譜工作站;NIST 05 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫;DB-5 毛細(xì)管石英柱(0.32 mm ×30 m，0.25 μm，Agilent 公司);揮發(fā)油提取器，圓底燒瓶(1000 mL)，冷凝管，燒杯(華西醫(yī)科大學(xué)儀器廠);5 L 恒熱電熱套(上海中興儀器有限公司);電子天平(上海天平儀器廠);恒溫水浴鍋(GB11240-89 型號(hào)GSY-II 型 北京醫(yī)療);低溫高速離心機(jī)(Thermo 德國);微孔板掃描酶標(biāo)儀(BioTek 美國);SSW 型微電腦電熱恒水槽(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)。

1.1.2 藥材與試劑

前胡飲片(購于祥威中藥飲片廠，符合《中國藥典》及《北京市中藥飲片炮制規(guī)范》，且由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所張本剛研究員鑒定拉丁學(xué)名);正構(gòu)烷烴參考系C8-C40(美國Chem Service 公司);去離子水;高純氮;實(shí)驗(yàn)小鼠(購自北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心，均為健康雄性小鼠，體重20～24 g，【SCXK(軍)2007-004】);碘化硫代乙酰膽堿(A5751，純度≥98%)、氯化丁酰膽堿(B2753，純度≥98%)、5，5’-二硫雙硝基苯甲酸(DTNB，D8130，純度≥98%)、酶終止劑-十二烷基硫酸鈉(SDS，純度＞95%)、他克林(A3773，純度＞99%)、四異丙基甲基焦磷酰胺(ISO-OMPA，T1505，純度＞99%)，均購自SIGMA 公司;PBS 磷酸緩沖鹽溶液(索萊寶生物科技公司);96 孔板(Costar 3599 美國);二甲基亞砜(DMSO)、乙醇、環(huán)己烷等化學(xué)試劑為分析純(北京化工廠)。

1.2 方法與結(jié)果

1.2.1 試液的制備

1.2.1.1 供試液的制備

取上述前胡中藥飲片粉碎，過40 目篩，稱取200 g，加10 倍量水浸泡過夜后，用揮發(fā)油提取器按《中國藥典》附錄之揮發(fā)油測(cè)定法甲法項(xiàng)下測(cè)定，蒸餾至揮發(fā)油量不再增加，放置1h 后讀取揮發(fā)油量為2.1 mL，并計(jì)算提取率，經(jīng)無水硫酸鈉干燥即得。前胡揮發(fā)油為橙黃色油狀物，具有特殊香味。取前胡揮發(fā)油0.1 mL，以環(huán)己烷稀釋100 倍作供試品備用，即濃度為1 μL/mL。

前胡揮發(fā)油的提取率(%)=前胡中揮發(fā)油含量/前胡重量×100% =1.05%

1.2.1.2 底物的配制

分別取7.2 mg 碘化硫代乙酰膽堿和氯化丁酰膽堿，分別用PBS 溶液定容于2 個(gè)5 mL 的棕色容量瓶中，低溫保存，使用時(shí)每毫升用PBS 溶液稀釋40 倍。

1.2.1.3 顯色劑的配制

取25 mgDTNB 用PBS 溶液定容于25 mL 棕色容量瓶中，用時(shí)現(xiàn)配，避光保存。

1.2.1.4 酶終止劑的配制

取酶終止劑-十二烷基硫酸鈉3 g 溶解于100 mL PBS 溶液。

1.2.2 酶液的制備與活力的測(cè)定［9，10］

酶液源于小鼠(C57 品系正常小鼠，購自北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心，【SCXK(軍)2007-004】)的肝臟。將小鼠斷頸猝死，取其肝臟1 g 于玻璃勻漿器中，按1∶9(W/V)加入冰冷的PBS 磷酸鹽緩沖液(PH=7.4)，研成勻漿狀，移入離心管中4 ℃離心30 min(3000 轉(zhuǎn)/min)，吸取上清液貯于-20 ℃冰箱中備用。使用前加入冰冷的PBS 磷酸鹽緩沖液(PH=7.4)稀釋至約10 mL.酶活力的測(cè)定見參考文獻(xiàn)［10］。

1.2.3 前胡揮發(fā)油的膽堿酯酶抑制作用

1.2.3.1 乙酰膽堿酯酶抑制活性

采用改良的Ellman［11］方法:實(shí)驗(yàn)設(shè)空白組，溶劑對(duì)照組，樣品組及陽性對(duì)照組，反應(yīng)體系中各加入32 μL 酶液、160 μL(濃度為1 μL /mL)樣品抑制劑(溶劑對(duì)照組抑制劑為1‰DMSO，陽性對(duì)照組抑制劑為濃度1 mg/mL 陽性藥他克林)和400 μL 顯色劑DTNB(空白組在加完DTNB 后加入400 μL SDS終止反應(yīng))，補(bǔ)水至1.2 mL，37 ℃孵育5 min，加入底物400 μL 碘化硫代乙酰膽堿37 ℃孵育15 min，再加入400 μL SDS 終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在波長為412 nm 處測(cè)定吸光度值，計(jì)算乙酰膽堿酯酶抑制率，乙酰膽堿酯酶抑制率(%)={1-(A 樣本-A 空白)/(A 對(duì)照-A 空白)}×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果見表1。

1.2.3.2 丁酰膽堿酯酶抑制活性

采用改良的Ellman［11］方法，具體操作方法與乙酰膽堿酯酶抑制活性測(cè)定相同，將其底物碘化硫代乙酰膽堿換成氯化丁酰膽堿即可，其中陽性對(duì)照組抑制劑為濃度1 mg/mL 陽性藥四異丙基甲基焦磷酰胺，結(jié)果見表1。

表1 前胡揮發(fā)油的乙酰膽堿酯酶及丁酰膽堿酯酶抑制率Table 1 The inhibition ratio of acetyl cholinesterase and butyryl cholinesterase in the volatile oil of Radix Peucedani

1.2.3.3 前胡AChE-IC50和BuChE-IC50

吸取前胡揮發(fā)油3 μL，定容于3 mL 的DMSO中，濃度為1 μL/mL. 倍比稀釋為以下8 個(gè)濃度0.5，0.25，0.125，0.0625，0.03125 μL/mL。采用改良的Ellman 方法［11］:實(shí)驗(yàn)設(shè)空白組，溶劑對(duì)照組，樣品組及陽性對(duì)照組，反應(yīng)體系中各加入32 μL 酶液、160 μL 不同濃度的供試品溶液揮發(fā)油抑制劑(溶劑對(duì)照組抑制劑為1‰DMSO，陽性對(duì)照組抑制劑分別為濃度1 mg/mL 陽性藥他克林和四異丙基甲基焦磷酰胺)和400 μL 顯色劑DTNB(空白組在加完DTNB 后加入400 μL SDS 終止反應(yīng))，補(bǔ)水至1.2 mL，37 ℃孵育5 min，加入底物400 μL ATCH(碘化硫代乙酰膽堿)37 ℃孵育15 min，再加入400 μLSDS 終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在波長為412 nm 處測(cè)定吸光度值，分別計(jì)算乙酰膽堿酯酶抑制率，乙酰膽堿酯酶抑制率(%)={1-(A 樣本-A 空白)/(A 對(duì)照-A 空白)}×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果見表3。根據(jù)改良寇式法計(jì)算出其IC50:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)Xm。其中l(wèi)g 為 最大劑量，I 為l g(最大劑量/ 相臨劑量)，P 為陽性反應(yīng)率之和，Pm為最大陽性反應(yīng)率，Pn 為最小陽性反應(yīng)率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 前胡揮發(fā)油的AChE-IC50和BuChE-IC50值Table 2 the value of AChE-IC50 andBuChE-IC50in the volatile oil of Radix Peucedani

1.2.4 GC-MS 對(duì)前胡揮發(fā)油化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)確定

1.2.4.1 色譜條件

色譜柱DB-5 毛細(xì)管石英柱(0.32 mm ×30 m，0.25 μm，Agilent 公司)

檢測(cè)器溫度:300 ℃，氣化室溫度:300 ℃，柱前壓:137.2 kpa，載氣:He，載氣流速:1.0 mL/min，尾氣流速:50 mL/min，進(jìn)樣方式:分流進(jìn)樣，分流比:1:50，進(jìn)樣量1 μL。

程序升溫:40 ℃保持10 min，以1 ℃/min 至45℃，保持1min;以12 ℃/min 至220 ℃，保持2 min;以3 ℃/min 至290 ℃，保持1 min。進(jìn)樣口溫度:300 ℃。質(zhì)譜條件:EI 源，電離能量:70 eV，離子源溫度:230 ℃。掃描范圍:m/z 35～450。

1.2.4.2 樣品的測(cè)定

取前胡揮發(fā)油供試品1 μL，按上述優(yōu)化后的GC-MS 條件進(jìn)樣測(cè)定。總離子流圖見圖1。

圖1 前胡揮發(fā)油總離子流圖Fig.1 Total Ion Chromatogram of the volatile oil in Radix Peucedani

1.2.4.3 揮發(fā)油化學(xué)成分結(jié)構(gòu)確定

通過GC-MS 質(zhì)譜庫與保留指數(shù)聯(lián)合定性從前胡揮發(fā)油中鑒定出32 種主要化學(xué)成分，以面積歸一法計(jì)算，占總峰面積的88.34%，主要成分有α-蒎烯，左旋-β-蒎烯，月桂烯，1-甲基-3-(1-甲基乙基)苯，(R)-1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)環(huán)己烯，2-癸酮，萜品醇，2-羥基-5-甲基苯乙酮，柏木腦等，詳見表3。

表3 前胡揮發(fā)油主要化學(xué)成分Table 3 The main chemical constituents in volatile oil of Radix Peucedani

2 結(jié)論與討論

2.1 GC-MS 質(zhì)譜庫結(jié)合Kovats 指數(shù)鑒定揮發(fā)油結(jié)構(gòu)更準(zhǔn)確

2.2 前胡有可能成為抗老年癡呆的候選藥物

前胡為傘形科植物白花前胡Peucedanum praeruptorum Dumn 的干燥根，具有散風(fēng)清熱，降氣化痰的功效，用于治療風(fēng)熱咳嗽痰多，痰熱喘滿，咯痰黃稠［22］?，F(xiàn)代藥理研究表明前胡還具有抗心臟缺血、保護(hù)心肌、改善心臟功能、擴(kuò)張血管、降低血壓、抗氧化等多種活性［23］。本文以薄層色譜(TLC)-生物自顯影技術(shù)及微孔高通量篩選方法研究前胡膽堿酯酶抑制活性，結(jié)果表明前胡揮發(fā)油對(duì)乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶均具有抑制作用。本文研究結(jié)果提示前胡有可能對(duì)老年癡呆等神經(jīng)退行性疾病有一定的治療作用。

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