楊雪芬 熊光源 周桂蓮 林映才 蔣宗勇*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，農(nóng)業(yè)部動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料(華南)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，廣東省動(dòng)物育種與營(yíng)養(yǎng)公共實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640;2.貴州省凱里市畜牧獸醫(yī)局，凱里 556000)

腸道和皮膚表面菌群數(shù)量比人體和動(dòng)物體細(xì)胞還要多，據(jù)估測(cè)為10倍［1］。腸道定植有大量的微生物，它作為機(jī)體與微生物接觸最密集的界面，免疫活動(dòng)異常劇烈。與此相對(duì)應(yīng)，腸道聚集的T淋巴細(xì)胞數(shù)超過(guò)機(jī)體總數(shù)的50%。因而，腸道菌群數(shù)量和結(jié)構(gòu)是維持腸道健康和動(dòng)物生長(zhǎng)性能的關(guān)鍵因素。因此，有必要弄清楚新生仔豬腸道菌群是如何建立及母乳中是否存在促進(jìn)有益菌的快速增殖因子，以保護(hù)幼畜。研究發(fā)現(xiàn)，乳汁中含有的寡糖可作為乳酸菌(Lactobacillus)和雙歧桿菌(Bifidobacterium)唯一碳源(即專(zhuān)嗜性)而促使它們快速增殖［2-3］。本文從這一角度出發(fā)，試圖闡明母畜通過(guò)乳源性寡糖幫助幼畜腸道乳酸菌和雙歧桿菌快速定植，進(jìn)而抑制有害菌繁殖，調(diào)節(jié)腸道菌群發(fā)育，調(diào)節(jié)腸道免疫發(fā)育和免疫耐受，最終保護(hù)幼畜。

1 乳寡糖的種類(lèi)

目前，尚不知豬乳汁中乳寡糖的含量。人初乳中寡糖含量較高，為20～23 g/L，常乳為7～12 g/L。豬乳與牛乳含有的寡糖相似，分別為29種和40種，但卻遠(yuǎn)比人乳寡糖種類(lèi)(130種)少，原因是人乳寡糖的同分異構(gòu)體很多，有些多達(dá)8種，而豬乳和牛乳很少或基本上沒(méi)有［4］。并且在豬乳中，酸性與中性乳寡糖的比例為70∶20，這與牛乳相似，而與人乳剛好相反。酸性乳寡糖大多是在寡糖的非還原性末端被唾液酸化，包括N-?；窠?jīng)氨酸(N-acetylneuraminic acid，NeuNAc)和N-糖基神經(jīng)酸(N-glycolylneuraminic acid，NeuGc)的寡糖，而中性寡糖非還原性末端則是海藻糖(L-fucose，F(xiàn)uc)、半乳糖(D-galactose，Gal)、葡萄糖(D-glucose，Glc)、N-?；前?N-acetylglucosamine，GlcNAc)、和 N- ?；肴樘?N-acetylgalactosamine，GalNAc)化的寡糖。目前鑒定，組成乳寡糖的基本單元有乳糖、Fuc、Gal、Glc-NAc、GalNAc、NeuNAc、NeuGc，其中，乳糖是核心單元，在此基礎(chǔ)上以不同糖苷鍵形成單元數(shù)不同的乳寡糖［5］。人和家畜腸道不存在能水解三單元以上寡聚糖糖苷鍵的酶類(lèi)，因而乳寡糖只能被腸道專(zhuān)嗜性的微生物如乳酸菌和雙歧桿菌等所利用。

2 乳寡糖調(diào)節(jié)新生仔豬腸道乳酸菌和雙歧桿菌定植

2.1 豬腸道微生物菌群發(fā)育

從空間角度而言，由于胃腸道前段pH較低，食糜流速較快，食糜豐富程度亦低等原因，豬胃腸道前段菌群數(shù)量要比后段少［6-7］;從時(shí)間角度來(lái)看，豬胃腸道菌群在哺乳期、斷奶前期和生長(zhǎng)肥育期亦發(fā)生顯著變化［1，6-8］。1～4周齡哺乳期仔豬胃、小腸、大腸壁黏膜的優(yōu)勢(shì)微生物為乳酸菌、擬桿菌(Bacteroides)+梭菌(Clostridium)、鏈球菌(Streptococcus)，它們?cè)谛∧c后段的lg CFU/g值(每克黏膜菌落形成單位的對(duì)數(shù)值)分別可達(dá)8.2、7.4、6.8，而腸球菌、葡萄球菌、腸桿菌和大腸桿菌(E.coli)數(shù)量較少。從前至后腸道內(nèi)各微生物菌群數(shù)量增加，但從胃至小腸前段，乳酸菌所占比例較為穩(wěn)定，約為60%，而擬桿菌+梭菌比例有所增加，即從胃的8%增至大腸前段的23%。在4～8周齡的斷奶期，胃腸道各段黏膜各菌群急劇下降，其中，乳酸菌降至25%，而擬桿菌 +梭菌降至13%［6］。在斷奶期，隨著有害菌大腸桿菌的增加，腸道各段有益菌乳酸菌所占比例降低［8］。超早期斷奶(2日齡)仔豬在15日齡時(shí)盲腸內(nèi)容物中乳酸菌比例僅為 10%［9］。

Leser等［7］檢測(cè)了腸道菌群的16S rDNA后得知，12～18周齡的生長(zhǎng)肥育豬回腸、盲腸、大腸食糜的菌群數(shù)量分別為86、231、298，Shannon-Wiener值(反映多樣性)分別為 4.65、6.78、6.90，顯示出菌群種類(lèi)在腸道空間上的漸變性。腸道主要菌群及比例大致為:優(yōu)桿菌(Eubacterium)33%、梭菌29%、乳酸菌 +鏈球菌12.3%、鼠孢菌(Sporomusa)4%(前均屬厚壁菌門(mén))、屈撓桿菌(Flexibacter)+噬胞菌(Cytophaga)+擬桿菌(Bacteroides)(屬擬桿菌門(mén))11.2%、變形桿菌(Proteobacteria)(屬變形體門(mén))5.3%、支原體(Mycoplasma)(屬柔膜菌門(mén))2.1%、高胸腺嘧啶+胞嘧啶(G+C)菌 1.1%、螺旋體菌(Spirochetes)0.5%(屬螺旋體門(mén))。類(lèi)似的方法也用于分析豬糞便中微生物區(qū)系以反映大腸菌群變化。最近，Kim等［1］采用高通量DNA測(cè)序法分析了10～22周齡生長(zhǎng)肥育豬糞便中的微生物區(qū)系，結(jié)果顯示，豬大腸微生物區(qū)系主要由厚壁菌門(mén)(一類(lèi)低G+C革蘭氏陽(yáng)性菌)和擬桿菌門(mén)組成，兩者所占總菌數(shù)的比例為90%左右，其他如變形菌門(mén)、放線(xiàn)菌門(mén)(雙歧桿菌屬于此門(mén))、螺線(xiàn)體門(mén)、混雜門(mén)比例均小于1%，未分類(lèi)菌群則約占10%。從10～13周齡，厚壁菌門(mén)菌群比例從60%提高至70%左右，22周齡時(shí)提高至80%;相反，擬桿菌門(mén)菌群隨年齡降低，從10周齡時(shí)的35%左右降至22周齡10%。其中，厚壁菌門(mén)中梭菌綱和芽孢桿菌綱比例在10～22周齡的變化趨勢(shì)分別為40%→67%和18%→9%;擬桿菌門(mén)主要由擬桿菌綱菌群組成，變化趨勢(shì)為33%→10%，而黃桿菌綱和鞘脂桿菌綱菌群很少(＜1%)。在厚壁菌門(mén)菌群中，非產(chǎn)氣菌(Anaerobacter)變化最大，從10周齡的0.6%增至22周齡的24.3%，有類(lèi)似變化趨勢(shì)的主要菌群(試驗(yàn)期平均比例大于1%)還有優(yōu)桿菌(0.4%→8.0%)、顫 桿 菌 克 (Oscillibacter)(1.4%→2.4%)、八疊球菌(Sarcina)(0.1% →3.6%);隨周齡而降低的菌群有:乳酸菌(11.0%→3.1%)、巨型球菌(Megasphaera)(5.9%→0.2%)、梭菌科Subdoligranulum(2.9% →0.7%)、復(fù)數(shù)菌(Blautia)(3.0% →0.9%)、梭 菌 科 Faecalibacterium(2.8%→ 0.2%)、假 丁 酸 弧 菌 (Pseudobutyrivibrio)(2.3%→0.4%)、韋榮氏菌科 Dialister(2.3%→0.2%);從10周齡到16周齡再到22周齡先增高后降低的有:鏈球菌(4.6%→9.5%→4.2%)、糞球菌(3.2% →5.6% →4.6%)、毛螺旋菌科 Roseburia(0.7%→1.8%→1.3%)。在擬桿菌綱的菌種(或?qū)?中，普氏菌(Prevotella)最為豐富，其變化趨勢(shì)為 26.1% →3.8%［1］。值得一提的是，雙歧桿菌(屬于放線(xiàn)菌門(mén))的數(shù)量?jī)H占0.1% ～0.3%。還有利用變性高效液相色譜法、末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性法［10］和實(shí)時(shí) PCR 法［11］分析生長(zhǎng)肥育豬糞便中微生物區(qū)系，結(jié)果顯示大腸主要菌群為厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)。目前，尚不清楚這2類(lèi)菌群在哺乳期、斷奶期豬大腸的發(fā)育模式。鑒于它們的時(shí)空發(fā)育關(guān)系［1］，可推測(cè)厚壁菌和擬桿菌菌群可定植于新生仔豬腸壁上，按照有關(guān)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，它們應(yīng)歸類(lèi)為豬腸道的正常菌群。最近發(fā)現(xiàn)，豬大腸擬桿菌綱菌群數(shù)量與背膘厚呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(R2=0.63)，而梅山豬大腸中擬桿菌數(shù)量比“杜×長(zhǎng)×大”三元雜交豬少，這至少部分地解釋了梅山豬有較高體脂這一現(xiàn)象［11］。這也暗示了腸道各菌群有不同營(yíng)養(yǎng)功能。反過(guò)來(lái)講，幼齡豬腸道較高比例的擬桿菌菌群是否與機(jī)體蛋白質(zhì)沉積有關(guān)，仍有待于研究證實(shí)。

2.2 乳寡糖促進(jìn)新生期豬腸道乳酸菌和雙歧桿菌的定植

當(dāng)前，鮮有研究直接證實(shí)乳寡糖可影響新生豬腸道正常菌群如厚壁門(mén)和擬桿菌門(mén)菌群在早期的定植。不過(guò)，據(jù)推測(cè)，乳寡糖是哺乳期乳酸菌(屬于厚壁菌門(mén))和雙歧桿菌(屬于放線(xiàn)菌門(mén))定植于腸道，并減少大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和輪狀病毒等致病微生物繁殖的一個(gè)重要營(yíng)養(yǎng)因素。第一，乳酸菌是哺乳仔豬小腸和大腸的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群，而大腸桿菌比例極低［6］;第二，由于飼糧結(jié)構(gòu)的變化，豬腸道各段乳酸菌和雙歧桿菌數(shù)量和比例是隨日齡增長(zhǎng)而降低，提示它們對(duì)寡糖有專(zhuān)嗜性，不過(guò)，乳酸菌在成年豬小腸各段比例仍大于20%［6］;第三，在哺乳期，人大腸中乳酸菌和雙歧桿菌為主要優(yōu)勢(shì)菌群，而在1周歲時(shí)，人腸道菌群［12］與生長(zhǎng)豬的相似［1］;第四，初乳中的寡糖含量很高，常乳相對(duì)較低，暗示新生動(dòng)物腸道急需快速建立有益微生物菌群，尤其是乳酸菌和雙歧桿菌［5，13］。這也從另一方面說(shuō)明，乳寡糖的缺失應(yīng)為斷奶后豬腸道乳酸菌和雙歧桿菌數(shù)量和比例降低的一個(gè)主要因素［8-9］。全基因組序列分析顯示，長(zhǎng)雙歧桿菌(B.longum)比嬰兒雙歧桿菌(B.infantis)含有更多利用植物性碳水化合物的基因，相反后者含有更多利用乳寡糖的基因，可見(jiàn)B.infantis更能適應(yīng)哺乳期的腸道環(huán)境，而 B.longum更適合成年期［12］。代謝結(jié)果也同樣證實(shí)，B.infantis能利用純化的乳寡糖作為唯一的碳源，而格氏乳桿菌(L.gasseri)卻不能［2］，但嗜酸乳酸桿菌(L.acidophilus)能以低聚半乳糖作為唯一碳源，原因是在其長(zhǎng)度為16.6 kbp的gal-lac基因簇中，存在GPH(galactoside-pentose-hexuronide)透膜酶，此酶基因在低聚半乳糖存在時(shí)表達(dá)量提高5.1倍，顯示其在菌體具有利用寡糖的作用［3］。這些研究表明，乳汁寡糖是母體保護(hù)幼畜的一個(gè)重要機(jī)制，它可選擇特定的雙歧桿菌和乳酸菌在腸道定植［3，5，13］。腸道在早期附著的雙歧桿菌和乳酸發(fā)揮著重要的營(yíng)養(yǎng)生理功能，如影響后期菌群模式［14-15］，抑制病原菌的定植［3，6，8］，調(diào)節(jié)腸道黏膜免疫發(fā)育等［16-18］。

3 乳寡糖在腸道健康中的作用

3.1 腸道早期菌群定植影響后期菌群模式

研究報(bào)道，給新生嬰兒飼喂含有8 g/L寡聚糖(半乳寡聚糖:果寡聚糖=9∶1)奶粉6個(gè)月，發(fā)現(xiàn)3月齡和6月齡時(shí)糞便中乳酸菌和雙歧桿菌數(shù)量顯著增加，pH顯著降低，有意思的是，12月齡時(shí)，這種效應(yīng)仍然存在，這提示早期菌群定植模式有一種“印記效應(yīng)”，即腸道早期菌群定植可影響后期菌群模式［14］。與此類(lèi)似，母乳喂養(yǎng)的嬰兒腸道雙歧桿菌數(shù)量比奶粉喂養(yǎng)的在種類(lèi)和數(shù)量都要多，且這種效應(yīng)在18月齡仍可檢測(cè)［15］。雖然在豬的研究上，尚未見(jiàn)類(lèi)似的“印記效應(yīng)”，但根據(jù)豬和人的腸道菌群模式發(fā)育特點(diǎn)的相似性［1，12］，仍可假設(shè)豬腸道菌群亦存在這種效應(yīng)。因此有必要就此作深入的探究。

3.2 哺乳期雙歧桿菌和乳酸菌抑制病原菌作用

許多乳酸菌和雙歧桿菌可產(chǎn)生殺菌素，這些殺菌素多數(shù)具有殺滅包括致病性大腸桿菌在內(nèi)的病原菌的效應(yīng)(表1)。因此，新生動(dòng)物腸道需要乳酸菌和雙歧桿菌快速定植，以抑制病原菌繁殖而保護(hù)新生動(dòng)物［5，13］。斷奶顯著減少了仔豬腸道乳酸菌等有益菌群，而增加大腸桿菌等致病性細(xì)菌數(shù)量［3，6，8］，其中一個(gè)重要原因可能是仔豬從飼糧獲得的寡糖比乳汁少［5］。然而，關(guān)于乳酸菌和雙歧桿菌產(chǎn)生的殺菌素為動(dòng)物提供保護(hù)這一機(jī)制說(shuō)法多為推測(cè)，尚缺乏直接的體內(nèi)研究證據(jù)。最近，F(xiàn)ukuda等［29］報(bào)道，雙歧桿菌 B.longum 保護(hù)無(wú)菌鼠免受感染大腸桿菌O157(E.coli O157)攻擊致死的作用至少部分是由B.longum本身產(chǎn)生乙酸而發(fā)揮的，因?yàn)橐宜嵊薪档虴.coli O157的毒力作用，如敲除B.longum的ABC型碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)載體(ABC-type carbohydrate transporters)基因，菌體則失去保護(hù)作用，表明此轉(zhuǎn)運(yùn)載體在合成乙酸中的作用?？梢?jiàn)，益生菌或共生菌產(chǎn)生的保護(hù)作用至少包括殺菌素和短鏈脂肪酸。除產(chǎn)生殺菌物質(zhì)外，乳酸菌和雙歧桿菌亦可通過(guò)對(duì)病原菌的黏附抑制、對(duì)黏附位點(diǎn)置換和競(jìng)爭(zhēng)等作用，維持腸道菌群正常生理功能。

3.3 哺乳期雙歧桿菌和乳酸菌在介導(dǎo)腸道黏膜免疫發(fā)育的作用

3.3.1 豬腸道黏膜免疫發(fā)育

豬腸道黏膜是自身免疫系統(tǒng)與外界環(huán)境的一個(gè)復(fù)雜界面，其免疫系統(tǒng)包括腸道物理屏障、先天性免疫系統(tǒng)、獲得性免疫系統(tǒng)和被動(dòng)免疫(哺乳期由母乳提供免疫球蛋白而獲得)。在此，主要討論豬先天性免疫系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng)的發(fā)育。

表1 乳酸菌和雙歧桿菌產(chǎn)生的殺菌素的一些重要特性Table 1 Important characteristics of the purified bacteriocins produced by Lactobacillus and Bifidobacterium

3.3.1.1 先天性免疫系統(tǒng)的發(fā)育

先天性免疫系統(tǒng)參與的免疫細(xì)胞有自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等粒細(xì)胞，這些粒細(xì)胞大部分由骨髓造血干細(xì)胞的骨髓淋巴細(xì)胞分化而來(lái)。其中，中性粒細(xì)胞約占粒細(xì)胞的50%。仔豬出生后，腸道一旦出現(xiàn)菌群的定植，首先引起單核細(xì)胞(巨噬細(xì)胞)的反應(yīng)，隨后依次為樹(shù)突細(xì)胞和T細(xì)胞［38］，可見(jiàn)先天性免疫在新生動(dòng)物有“維護(hù)自我”的作用。研究報(bào)道，嗜酸乳酸桿菌可增加無(wú)菌仔豬和正常飼養(yǎng)仔豬血液中白細(xì)胞數(shù)量，且以增加中性粒細(xì)胞為主［30］。擬干酪乳桿菌(L.paracasei)也可增加10日齡仔豬和健康斷奶仔豬白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)量，增強(qiáng)它們的吞噬活性，且在配合使用果寡聚糖時(shí)亦有相同的效果［31］。然而，植物乳桿菌(L.plantarum)卻抑制感染致病性大腸桿菌導(dǎo)致的中性粒細(xì)胞的遷移，這可能與動(dòng)物的健康狀態(tài)相關(guān)，目的是抑制炎癥的發(fā)生［32］。Zhang等［16］分別以輪狀病毒、嗜酸乳酸菌 +羅伊氏乳桿菌(L.reuteri)、輪狀病毒+乳酸菌處理新生無(wú)菌豬，觀(guān)察腸道和脾臟中樹(shù)突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的分布和募集情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳酸菌增加了腸道樹(shù)突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)量，而輪狀病毒比乳酸菌更容易募集巨噬細(xì)胞至腸道固有層處，但乳酸菌減少了輪狀病毒募集巨噬細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞至脾臟和腸道的能力，顯示出乳酸菌本身可激活新生仔豬腸道免疫機(jī)能，亦能在整體免疫層面上降低仔豬感染輪狀病毒導(dǎo)致炎癥的嚴(yán)重程度。此外，嗜酸乳酸桿菌可依賴(lài)樹(shù)突細(xì)胞增強(qiáng)殺傷性細(xì)胞的殺菌活性［33］，而干酪乳桿菌(L.casei)亦有相同的作用［34］。

鮮有研究證實(shí)雙歧桿菌在仔豬腸道黏膜中性粒細(xì)胞的作用。兩歧雙歧桿菌(B.bifidum)能增強(qiáng)樹(shù)突細(xì)胞(腸道免疫信息的主要采集細(xì)胞)分泌趨化因子 CXC1、CXC2、CXC5的基因表達(dá)，這些細(xì)胞因子可有效募集中性粒細(xì)胞［35］。同時(shí)，B.bifidum也能以依賴(lài)樹(shù)突細(xì)胞方式誘導(dǎo)和增強(qiáng)殺傷性細(xì)胞的活性［33］。動(dòng)物雙歧桿菌(B.animalis)能遷移至腸系膜淋巴結(jié)處，并激活巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞Toll受體-2和-4基因的表達(dá)，但卻下調(diào)仔豬腸系膜淋巴結(jié)致腫瘤壞死因子-α(TNF-α)基因表達(dá)，提示此菌種可調(diào)節(jié)先天免疫反應(yīng)，但限制炎癥發(fā)生［36］。

3.3.1.2 獲得性免疫系統(tǒng)的發(fā)育

腸道獲得性免疫包括體液免疫和細(xì)胞免疫，發(fā)揮這2種免疫功能的細(xì)胞巢穴為腸道淋巴結(jié)組織，因此，了解腸道淋巴結(jié)組織發(fā)育具有重要意義。哺乳動(dòng)物腸道淋巴結(jié)系統(tǒng)包括Peyer’s結(jié)(位于小腸)、大腸結(jié)(位于大腸)、孤立淋巴濾泡、腸系膜淋巴結(jié)。最近報(bào)道，隱窩處的補(bǔ)丁細(xì)胞(crypopatch)是由動(dòng)物出生前腸道的淋巴組織誘導(dǎo)細(xì)胞(lymphoid-tissue inducer cells，LTi)演化而來(lái)，其在腸道淋巴結(jié)系統(tǒng)發(fā)生和成熟有關(guān)鍵作用［37］。在胎兒期，間葉細(xì)胞膜表達(dá)趨化因子CXCl5、CXC13及相應(yīng)配體CXCL，作用于LTi細(xì)胞膜上的整合因子(integrin)，將其引至淋巴結(jié)發(fā)生。同時(shí)，LTi表達(dá)淋巴毒素(lymphotoxin)α1β2，作用于間葉細(xì)胞，促使其表達(dá)更多的趨化因子，進(jìn)一步誘使LTi位移和促使淋巴結(jié)發(fā)育，此為第1步“正反饋”調(diào)節(jié);動(dòng)物出生后，樹(shù)突細(xì)胞替代胎兒期間葉細(xì)胞的作用，形成第2次“正反饋”調(diào)節(jié)，進(jìn)一步誘導(dǎo)Payer’s結(jié)和大腸結(jié)發(fā)育。基因芯片結(jié)果顯示，嗜酸乳酸桿菌NCFM(L.acidophilus NCFM)可選擇性地誘導(dǎo)樹(shù)突細(xì)胞表達(dá)趨化因子CXC9、CXC10、CXC11及配體 CXCL3、CXCL4、CXCL7、CXCL12 的基因表達(dá)，而兩歧雙歧桿菌卻可提高趨化因子如CXC1、CXC2、CXC5 的基因表達(dá)［35］。這提示，乳酸菌和雙歧桿菌在新生動(dòng)物腸道淋巴結(jié)發(fā)育有不同促進(jìn)作用。尚需更多研究證實(shí)這2種益生菌介導(dǎo)趨化因子在腸道淋巴結(jié)發(fā)育的精確機(jī)制。

在無(wú)菌狀態(tài)下，小腸絨毛和隱窩固有層缺少樹(shù)突細(xì)胞和T細(xì)胞，表明腸道微生物在介導(dǎo)黏膜免疫的作用［38］。如有菌群定植，腸道黏膜淋巴細(xì)胞則體現(xiàn)出明顯的發(fā)育特征，至4周齡時(shí)，固有層T細(xì)胞增加1倍［39］;至5周齡時(shí)，遷移至上皮細(xì)胞間的T細(xì)胞占腸道黏膜 T細(xì)胞總數(shù)的50%［40］。在出生后第5天，固有層未成熟的CD2+T細(xì)胞開(kāi)始分化為CD4+和CD8+T細(xì)胞亞型，至第12天時(shí)它們占CD2+T細(xì)胞的1/2［41］。但 CD8+和 CD4+并不以相同的規(guī)律發(fā)育。據(jù)報(bào)道，CD4+亞型增殖速度很快，尤其是在CD2+T細(xì)胞開(kāi)始分化之后，而CD8+則是在出生后第5～7周齡期間才以較快速度增殖［39］。在24周齡時(shí)，豬腸道上皮間CD8+T細(xì)胞占總T細(xì)胞的1/2，此比例為成年豬水平。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CD4+/CD8+比值亦反映出，在幼齡豬腸道此比值約為 2，而在成年豬，此比值小于 1［39，42］。這說(shuō)明豬在幼年期體液免疫力較強(qiáng)，而在成年期細(xì)胞免疫較強(qiáng)，這可能是幼年期豬容易感染輪狀病毒的一個(gè)重要原因。

CD8+進(jìn)一步分化為輔助性Th1(細(xì)胞毒性T細(xì)胞)，參與細(xì)胞免疫，主要針對(duì)病毒抗原，而CD4+T細(xì)胞(輔助性Th2)分化為B細(xì)胞，分泌免疫球蛋白，故CD4+反映體液免疫水平。Th1/Th2平衡是傳統(tǒng)的經(jīng)典免疫模型，反映體液免疫和細(xì)胞免疫的相對(duì)活性，盡管這個(gè)模型受到越來(lái)越多的挑戰(zhàn)。研究報(bào)道，給哺乳仔豬或斷奶仔豬口服擬干酪乳桿菌或擬干酪乳桿菌+果寡糖，血液中CD2+和CD4+T細(xì)胞，以及B細(xì)胞數(shù)量顯著增加，表明此乳酸菌調(diào)節(jié)了機(jī)體的獲得性免疫機(jī)能［31］。唾液乳酸桿菌(L.salivarius)能增加十二指腸上皮細(xì)胞間淋巴細(xì)胞的數(shù)量，且能增加分泌免疫球蛋白A(IgA)細(xì)胞數(shù)量［17］。與此類(lèi)似，兩歧雙歧桿菌可增加腸系膜淋巴結(jié)和Peyer’s結(jié)中分泌免疫球蛋白的B細(xì)胞數(shù)量，并誘導(dǎo)其合成IgA和免疫球蛋白M(IgM)，但這些免疫球蛋白并不針對(duì)兩歧雙歧桿菌本身，表明此菌并不引起對(duì)自身不利的免疫反應(yīng);進(jìn)一步研究表明，發(fā)揮以上作用的成分存在于菌體本身，而不是其分泌的活性成分［43］。

Th1分泌干擾素(INF)-γ、致腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-2等細(xì)胞因子，而Th2則傾向于表達(dá) IL-4、IL-5、IL-6、IL-10 等細(xì)胞因子，因此，測(cè)量這些細(xì)胞因子的表達(dá)水平可間接反映細(xì)胞免疫和體液免疫的相對(duì)狀態(tài)。研究報(bào)道，發(fā)酵乳桿菌(L.fermentum)可增加無(wú)菌仔豬腸道前段上皮細(xì)胞間淋巴細(xì)胞數(shù)量［18］，增加普通仔豬血液中CD4+細(xì)胞數(shù)量，刺激腸道INF-γ、TNF-α的基因表達(dá)［42］。對(duì)人［44-45］、鼠［46］的研究也表明，乳酸菌可顯著增加 INF-γ、TNF-α、IL-12等與 Th1相關(guān)的細(xì)胞因子生成，但抑制Th2相關(guān)細(xì)胞因子的生成［44］。INF-γ、TNF-α、IL-12 等細(xì)胞因子是多功能的致炎性因子，參與先天免疫和細(xì)胞免疫［42］。Weiss等［35］最近報(bào)道，嗜酸乳酸桿菌上調(diào)樹(shù)突細(xì)胞 INF-β、TNF-α、IL-12、IL-12α/β、IL-15、IL-18 等細(xì)胞因子，這些作用可被雙歧桿菌B.bifidum減弱，且后者還可上調(diào)IL-6和IL-10等細(xì)胞因子。給仔豬口服雙歧桿菌B.animalis雖然使Toll樣受體-2和Toll樣受體-4基因表達(dá)增加，但卻使腸系膜淋巴結(jié)TNF-α基因表達(dá)下降，表明雙歧桿菌或可限制先天免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)［36］。這些結(jié)果似乎暗示，乳酸菌雖然對(duì)體液免疫有一定的作用，但它們更傾向于調(diào)節(jié)先天免疫和細(xì)胞免疫，而雙歧桿菌在調(diào)節(jié)體液免疫方面可能有更大作用。

3.3.2 免疫耐受

免疫耐受的介導(dǎo)是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，目前尚不清楚新生動(dòng)物建立免疫耐受的生化機(jī)制。許多研究證實(shí)，在健康情況下，乳酸菌［16，32］和雙歧桿菌［36，42-43］可刺激腸道黏膜免疫的發(fā)育;但在感染疾病的情況下，它們卻抑制致炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，但刺激免疫抑制性細(xì)胞因子產(chǎn)生，如IL-10、表皮生長(zhǎng)因子(TGF)等，隨后促使T細(xì)胞向調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)轉(zhuǎn)化，從而誘導(dǎo)免疫耐受［35］。在免疫耐受的介導(dǎo)過(guò)程中，腸道中郎格漢斯細(xì)胞(Langerhans cells，樹(shù)突細(xì)胞的一種分型細(xì)胞)的作用不可或缺。新近的研究發(fā)現(xiàn)，抗原提呈狀態(tài)的、激活的郎格漢斯細(xì)胞起初會(huì)進(jìn)行自身增殖，但隨后卻未能成功促使CD4+T細(xì)胞分化為效應(yīng)T細(xì)胞或記憶細(xì)胞，或使效應(yīng)T細(xì)胞或記憶細(xì)胞長(zhǎng)久存活而引起免疫反應(yīng)，這是因?yàn)樵诩せ盍说睦筛駶h斯細(xì)胞中，核因子(NF)-κB亞基RelB未能從胞質(zhì)中遷移至胞核，從而不能引發(fā)CD4+T細(xì)胞分化而引起的免疫反應(yīng)［47］。這表明，腸道益生菌或共生菌與有害菌可被不同類(lèi)型的樹(shù)突細(xì)胞識(shí)別，從而決定腸道黏膜是否引起免疫耐受或免疫反應(yīng)。López等［48］報(bào)道，雙歧桿菌 B.animalis、B.bifidum、B.longum 和短雙歧桿菌(B.breve)均能介導(dǎo)外周血單核細(xì)胞表達(dá)高水平的IL-17和低水平的 TNF-α和 INF-γ，能促使樹(shù)突細(xì)胞表達(dá)較多的IL-10，提示它們能誘導(dǎo)Treg(亦稱(chēng)為T(mén)h17細(xì)胞)分化增殖。乳酸菌中植物乳桿菌、嗜酸乳酸桿菌和羅伊氏乳桿菌能抑制感染病原微生物仔豬的免疫反應(yīng)，提示它們應(yīng)在介導(dǎo)免疫耐受方面有重要作用［16，32］。

4 母豬乳腺合成寡糖的生化機(jī)理

根據(jù)對(duì)人［5］和家畜［4］乳汁寡糖的結(jié)構(gòu)鑒定可知，乳腺合成寡糖均是在乳糖的基礎(chǔ)上通過(guò)糖苷鍵連接而成。乳糖是由半乳糖和葡萄糖以β-1，4糖苷鍵組成。因此，有必要首先弄清楚乳腺合成乳糖的生化機(jī)制。

4.1 乳糖的合成

乳腺合成乳糖的機(jī)制發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)70年代。乳腺上皮細(xì)胞的高爾基體存在乳糖合成酶，此酶由β-1，4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶及調(diào)控其活性的α-乳白蛋白組成［49］。具體來(lái)說(shuō)，當(dāng)無(wú)α-乳白蛋白存在時(shí)，乳糖合成酶不能催化半乳糖與葡糖糖以β-1，4糖苷鍵形成乳糖，但可催化半乳糖與乙酰氨基葡萄糖以β-1，4糖苷鍵與蛋白質(zhì)結(jié)合而形成糖蛋白;但當(dāng)α-乳白蛋白存在時(shí)，乳糖合成酶的酶活性位點(diǎn)被調(diào)控，具備合成乳糖的活性。合成乳糖的所需原料為葡萄糖和磷酸尿苷-半乳糖，它們分別由高爾基體膜上葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體-1(GLUT1)和二磷酸尿苷(UDP)-半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體從細(xì)胞質(zhì)攝取。GLUT1為乳腺上皮細(xì)胞中高爾基體膜所特有，在其他細(xì)胞高爾基體膜上并不存在［49］。α-乳白蛋白的調(diào)控活性與GLUT1轉(zhuǎn)運(yùn)活性受泌乳生理相關(guān)激素如催乳素調(diào)節(jié)［49-50］?？梢?jiàn)，乳腺合成乳糖受胞質(zhì)中葡萄糖、UDP-半乳糖豐度及其轉(zhuǎn)運(yùn)載體活性、α-乳白蛋白表達(dá)量等因素的調(diào)控。

4.2 乳寡糖的合成

采用質(zhì)譜和高效液相色譜法檢測(cè)獲知，豬乳中含有29種寡糖，主要種類(lèi)有4種，包括3單元組成的寡糖 NeuNAc(α2-6)Gal(β1-4)Glc［簡(jiǎn)稱(chēng):NeuNAc(α2-6)lac］，4 單元的 Gal(β1-3)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Glc(簡(jiǎn)稱(chēng):LNT)，6單元的［Glc(β1-4)GlcNAc］2(β1-3/6)Gal(β1-4)Glc(簡(jiǎn)稱(chēng):LNH)，7單元的 NeuNAc(α2-3)［Glc(β1-4)Glc-NAc］2(β1-3/6)Gal(β1-4)Glc(簡(jiǎn)稱(chēng):NeuNAc-LNH)。在整個(gè)泌乳期，常乳的 NeuNAc(α2-6)lac、LNH、NeuNAc-LNH均比初乳低，但LNT則隨泌乳期而增加。總的來(lái)說(shuō)，NeuNAc(α2-6)lac所占乳寡糖的比例最高(＞50%)，其他各占5% ～35% 不等［4］。

在乳腺上皮細(xì)胞的高爾基體中，唾液酸轉(zhuǎn)移酶(sialyltransferase)催化 NeuNAc以 α2-3/6糖苷鍵連接到乳糖或寡聚糖的非還原性末端上，形成酸性乳寡糖［51］。豬乳的酸性寡聚糖為 NeuNAc(α2-6)lac 和 NeuNAc-LNH［4］，豬乳腺上皮細(xì)胞合成它們可能受唾液酸豐度和及其轉(zhuǎn)移酶酶活的影響。NeuNAc是唾液酸的最主要形式，由胞質(zhì)利用N-乙?；腄-甘露糖胺(ManNAc)和D-葡糖糖胺(GlcNAc)經(jīng)由5步反應(yīng)合成而來(lái)，即UDP-Glc→UDP-GlcNAc→ManNAc→6-磷酸 NeuNAc→9- 磷酸 NeuNAc→CMP-NeuNAc，隨后CMP-NeuNAc進(jìn)入高爾基體而用于寡糖合成。

豬乳中性寡糖的主要形式是四聚寡糖LNT和六聚寡糖LNH［4］。LNT被認(rèn)為是乳汁中性寡聚糖重要的核心寡糖之一，在其非還原性末端可被其他單糖連接而形成更為復(fù)雜的寡聚糖，如LNH［5］。LNT合成的第1步是在 β1-3-N-乙?；咸擒辙D(zhuǎn)移酶(β1-3-N-acetylglucosaminyltransferase)的作用下，UDP-GlcNAc以β1-3糖苷鍵連接至乳糖非還原性末端上，然后再在β-D-半乳糖苷酶的作用下，生成LNT［52］。

5 小結(jié)

綜上所述，母乳中寡糖是促進(jìn)新生仔豬腸道乳酸菌和雙歧桿菌快速定植的重要活性成分，其主要功能是抑制病原菌，調(diào)節(jié)后期腸道菌群模式和黏膜免疫發(fā)育，從而有利于新生仔豬的健康生長(zhǎng)。腸道健康是當(dāng)前動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)領(lǐng)域研究的一個(gè)重要熱點(diǎn)，而腸道菌群是影響腸道健康的最為重要因素之一。腸道菌群的先天建立可影響后天菌群，因而，影響后期動(dòng)物生長(zhǎng)、繁殖、健康等與生產(chǎn)相關(guān)指標(biāo)。為此，結(jié)合質(zhì)譜、色譜分析法，分離純化并探討特定種類(lèi)寡糖是否具有促進(jìn)特定菌群生長(zhǎng)的作用。其次，利用現(xiàn)代分子生物學(xué)方法如高通量DNA測(cè)序法動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)不同品種、不同生理狀態(tài)條件下豬胃腸道菌群在時(shí)間、空間的發(fā)育性變化，以及寡糖在其中的調(diào)節(jié)作用。此外，需進(jìn)一步弄清楚益生菌調(diào)節(jié)腸道黏膜免疫反應(yīng)與有害菌的差別的分子機(jī)制。再者，有必要探討乳腺合成寡糖的調(diào)控方法和研究寡糖對(duì)新生仔豬的早期營(yíng)養(yǎng)。

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