邵鄰相， 高海濤， 成文召， 李 美， 徐 麗， 陳瑩瑩

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華 321004)

近年來關(guān)于植物揮發(fā)油的抗腫瘤作用有不少報(bào)道，如歐當(dāng)歸［1］、髯花杜鵑［2］、百里香［3］、溫莪術(shù)［4］、葡萄柚［5］等植物的揮發(fā)油均能使體外培養(yǎng)的癌細(xì)胞凋亡，抑制癌細(xì)胞增殖;檸檬香茅［6］、巴豆［7］、薤白［8］、白術(shù)［9］等植物的揮發(fā)油也可抑制小鼠體內(nèi)移植瘤的增殖．佛手(Citrus medica L．var．sarcodactylis(Noot)Swingle)是蕓香科柑橘屬植物佛手柑的果實(shí)，具有理氣化痰、健胃止嘔、舒肝健脾等作用．已有佛手揮發(fā)油抗菌、抗炎癥及體外抑制癌細(xì)胞增殖的研究［10-14］報(bào)道，但佛手揮發(fā)油對體內(nèi)移植瘤作用的研究國內(nèi)外鮮見報(bào)道．本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)研究了佛手揮發(fā)油對小鼠移植性B16黑色素瘤生長的影響，為抗腫瘤藥物的研究開發(fā)提供依據(jù)．

1 材料和方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動物及細(xì)胞株

C57BL/6J小鼠，清潔級，購于上海斯萊克動物中心，合格證號:SCXK(滬)2007-0005．B16黑色素瘤細(xì)胞株購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所．

1．2 主要藥品和儀器

RPMI 1640培養(yǎng)基購于美國Gibcobrl公司;新生牛血清購于杭州四季青生物工程材料公司;青霉素和鏈霉素均為Sigma公司產(chǎn)品;環(huán)磷酰胺(CTX)購自江蘇恒瑞制藥有限公司;鄰苯三酚購自上海集團(tuán)公司;三羥甲基氨基甲烷、硫代巴比妥酸均購于杭州昊天生物技術(shù)有限公司．

3K18通用臺式冷凍離心機(jī)為德國Sigma公司產(chǎn)品;Ultrospec 4000紫外/可見光分光光度計(jì)為英國Biochrom公司產(chǎn)品．

1．3 佛手揮發(fā)油的提取及其乳劑的制備

以鮮金華佛手為原料，用水蒸汽蒸餾法提取揮發(fā)油，再用無水硫酸鈉干燥，即得到佛手揮發(fā)油．將2 g佛手揮發(fā)油加入到2 g吐溫-80中，混勻，再慢慢加入生理鹽水，定容到100 mL，濾過除菌，然后用含2%吐溫-80的生理鹽水稀釋成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10，50和90 mg/kg的乳劑．

1．4 小鼠移植瘤模型的建立

將B16黑色素瘤細(xì)胞用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞，用無菌生理鹽水配制成1×107mL-1的單細(xì)胞懸液，在C57BL/6J小鼠右側(cè)鼠蹊部皮下接種0．2 mL該細(xì)胞懸液．取 B16黑色素瘤細(xì)胞在C57BL/6J小鼠體內(nèi)穩(wěn)定傳代14 d的小鼠，引頸處死，75%乙醇溶液消毒后，在無菌條件下剝離腫瘤組織，在無菌培養(yǎng)皿中剪碎，加適量生理鹽水研磨，200目細(xì)胞篩網(wǎng)過濾，制成細(xì)胞懸液．以4 g/L臺盼藍(lán)溶液染色計(jì)數(shù)，保證細(xì)胞活力大于95%，以無菌生理鹽水調(diào)細(xì)胞濃度為5×106mL-1，立即將該細(xì)胞懸液0．2 mL接種于C57BL/6J小鼠右側(cè)鼠蹊部，制成移植性荷瘤小鼠模型．

1．5 實(shí)驗(yàn)動物分組及藥物處理

將雌雄荷瘤小鼠分別隨機(jī)分成5組，雌性小鼠每組10只，雄性小鼠每組9只．陰性對照組:小鼠腹腔注射0．2 mL 2%吐溫-80無菌生理鹽水，連續(xù)注射14 d．陽性對照組:小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺100 mg/(kg·d)，按常規(guī)藥理學(xué)的方法，僅第1天給藥．佛手揮發(fā)油低劑量組、中劑量組和高劑量組:分別按10，50和90 mg/(kg·d)劑量給小鼠腹腔注射佛手揮發(fā)油，連續(xù)注射14 d．同時設(shè)雌鼠、雄鼠正常對照組(雌性每組10只，雄性每組9只)．

1．6 抑瘤率測定

每日觀察各組小鼠的生長狀況，并記錄各組小鼠給藥期間的體質(zhì)量．給藥14 d后，引頸處死小鼠，完整剝離腫瘤組織，稱質(zhì)量;并取出荷瘤小鼠及正常對照組小鼠的心、肝、腎組織，稱質(zhì)量后將其液氮速凍，再放入-70℃冰箱中低溫保存?zhèn)溆茫?/p>

計(jì)算抑瘤率．

1．7 超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量測定

鄰苯三酚自氧化法［15］測定超氧化物歧化酶(SOD)活性．MDA-TBA 比色法［16］測定丙二醛(MDA)含量．

1．8 統(tǒng)計(jì)方法

運(yùn)用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果用x±s表示，以 P ＜0．05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．

2 結(jié)果

2．1 佛手揮發(fā)油對荷瘤小鼠腫瘤生長的影響

從圖1和圖2可以看出，藥物處理前3天腫瘤的生長速率相對較慢，之后生長速率加快，且陰性對照組小鼠移植瘤增長速率較其他組快．圖1顯示的是佛手揮發(fā)油對雌性荷瘤小鼠腫瘤生長的影響:陰性對照組和佛手揮發(fā)油90 mg/kg劑量組小鼠移植瘤的生長速率相對較快，陽性對照組小鼠的腫瘤生長速率最慢，佛手揮發(fā)油50 mg/kg劑量組小鼠移植瘤的生長速度顯著小于陰性對照組(P＜0．01)，說明50 mg/kg劑量的佛手揮發(fā)油對腫瘤有明顯的抑制作用．圖2顯示了佛手揮發(fā)油對雄性荷瘤小鼠腫瘤生長的影響:陽性對照組小鼠的腫瘤生長速率較慢，其他4組相比都無顯著差異(P ＞0．05)．

圖2 雄性荷瘤小鼠各處理組腫瘤生長曲線

圖1 雌性荷瘤小鼠各處理組腫瘤生長曲線

2．2 佛手揮發(fā)油對荷瘤小鼠黑色素實(shí)體瘤的影響

如表1所示，雌性荷瘤小鼠給藥各組實(shí)體瘤的質(zhì)量均小于陰性對照組，其中:陽性對照組的瘤質(zhì)量最小，與其他組相比差異均顯著(P＜0．05);佛手揮發(fā)油50 mg/kg劑量組小鼠的瘤體大小顯著小于陰性對照組(P＜0．01)，抑瘤率達(dá)47．2%．雄性荷瘤小鼠陽性對照組的瘤體最小，與其他各組相比，差異極顯著(P＜0．01);佛手揮發(fā)油各劑量組小鼠的瘤體較陰性對照組均減小，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)．這說明50 mg/kg劑量的佛手揮發(fā)油對雌性荷瘤小鼠有顯著的抑瘤作用，各劑量佛手揮發(fā)油對雄性荷瘤小鼠的抑瘤作用不明顯．

表1 佛手揮發(fā)油對雌雄性荷瘤小鼠B16黑色素實(shí)體瘤的影響

2．3 佛手揮發(fā)油對荷瘤小鼠心、肝和腎中SOD活性的影響

如表2所示，50 mg/kg劑量的佛手揮發(fā)油能極顯著地提高雌性荷瘤小鼠肝臟中超氧化物歧化酶(SOD)的活性(P＜0．01)，但不能提高雄性荷瘤小鼠肝臟中的超氧化物歧化酶活性;各劑量的佛手揮發(fā)油均能降低荷瘤小鼠心臟中超氧化物歧化酶的活性，且與正常對照組相比，差異均極顯著(P＜0．01);各劑量的佛手揮發(fā)油均不能提高荷瘤小鼠腎臟中超氧化物歧化酶的活性．這說明50 mg/kg劑量的佛手揮發(fā)油能提高雌性荷瘤小鼠肝臟的抗氧化能力．

表2 佛手揮發(fā)油對荷瘤小鼠心、肝和腎中SOD活性的影響 103U·g-1

2．4 佛手揮發(fā)油對荷瘤小鼠心、肝和腎中MDA含量的影響

如表3所示，與正常對照組相比，各組荷瘤小鼠心、肝、腎中的丙二醛(MDA)含量都有增加的趨勢．90 mg/kg劑量的佛手揮發(fā)油能使雌性荷瘤小鼠腎臟中的丙二醛含量增加，與正常對照組相比差異極其顯著(P＜0．01)．50 mg/kg劑量的佛手揮發(fā)油能降低雌性荷瘤小鼠臟器中的丙二醛含量，但與陰性對照組相比無顯著性差異(P＞0．05);它能使雄性荷瘤小鼠心臟和腎臟中丙二醛含量極顯著增加(P＜0．01)．這說明佛手揮發(fā)油不能降低荷瘤小鼠心、肝、腎中丙二醛的含量．

表3 佛手揮發(fā)油對荷瘤小鼠心、肝和腎中MDA含量的影響 μg·g-1

3 討論

近年來，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究表明，植物揮發(fā)油具有明顯的抗腫瘤活性．文獻(xiàn)［17］研究發(fā)現(xiàn)，百里香揮發(fā)油對體外培養(yǎng)的人卵巢癌細(xì)胞株IGR-OV1及小鼠肥大細(xì)胞癌P815實(shí)體瘤有抑制作用．張卿等［8］研究表明，薤白揮發(fā)油能顯著抑制體外培養(yǎng)的S180和H22細(xì)胞的增殖，對小鼠S180和H22實(shí)體瘤有顯著的抑制作用．本實(shí)驗(yàn)室已研究發(fā)現(xiàn)，佛手揮發(fā)油能使體外培養(yǎng)的B16黑色素瘤細(xì)胞和MAD-MB-435癌細(xì)胞凋亡，抑制其增殖［10-11］．本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，佛手揮發(fā)油能抑制小鼠B16黑色素實(shí)體瘤的生長，50 mg/kg劑量的佛手揮發(fā)油對雌性荷瘤小鼠的作用最明顯，抑瘤率達(dá)47．2%．

超氧化物歧化酶可以特異性地清除超氧陰離子自由基(O-2)，在機(jī)體的氧化和抗氧化水平上起著極其重要的作用．如果O-2等自由基不能被及時清除，它們就會攻擊生物膜脂質(zhì)中的多聚不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，生成丙二醛等脂質(zhì)過氧化物．王海霞等［18］研究認(rèn)為番茄紅素具有抑制腫瘤生長的作用，可能與提高超氧化物歧化酶活力、降低丙二醛含量及減輕DNA損傷有關(guān)．本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，50 mg/kg劑量的佛手揮發(fā)油能顯著提高雌性荷瘤小鼠肝臟中的超氧化物歧化酶活性，提高了機(jī)體的抗氧化能力，從而抑制了腫瘤的生長．

佛手揮發(fā)油對C57BL/6J荷瘤小鼠的抑瘤作用及抗氧化能力存在著性別差異性．胡小靜等［19］用昆明小鼠研究了曬青綠茶和普洱茶多糖的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)青綠茶多糖和普洱茶多糖均能提高雄性小鼠的總抗氧化能力，但對雌性小鼠作用不明顯．而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，佛手揮發(fā)油能提高雌性小鼠的抑瘤率和抗氧化能力，對雄性小鼠的作用不明顯．小鼠的抗氧化能力和抗腫瘤作用存在性別差異性的原因尚不明確，還有待于進(jìn)一步研究．

綜上所述，佛手揮發(fā)油具有體內(nèi)抗腫瘤作用，這可能與佛手揮發(fā)油能使腫瘤細(xì)胞凋亡、提高小鼠自身的抗氧化能力有關(guān)．

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