王世軍 于華蕓 季旭明 吳智春 韓冰冰 (山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355)

陽(yáng)虛是引起衰老的主要原因〔1〕，如《素問(wèn)》云：“陽(yáng)氣者，若天與日，失其所則折壽而不彰，故天運(yùn)當(dāng)以日光明”，治當(dāng)補(bǔ)火助陽(yáng)之法。附子為毛莨科植物烏頭(Aconitum carmichaeli Debx.)的子根加工品。臨床常取其辛甘大熱之性，補(bǔ)火助陽(yáng)用治腎陽(yáng)不足，命門火衰所致陽(yáng)痿滑精、宮寒不孕以及眩暈耳鳴，須發(fā)早白等癥?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究也證實(shí)附子有一定的抗氧化、抗衰老作用〔2〕，并能興奮下丘腦-垂體-性腺軸。但尚未有從基因水平研究其發(fā)揮“溫陽(yáng)補(bǔ)火”功效用治陽(yáng)虛衰老病證機(jī)制的相關(guān)報(bào)道。本項(xiàng)研究應(yīng)用全基因組基因芯片技術(shù)，研究大鼠灌胃附子水煎液后肝組織基因表達(dá)譜的變化，為附子溫?zé)嵝?yīng)及產(chǎn)生機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性Wistar大鼠20只，體重180～200 g，魯抗醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK(魯)20080002。

1.2 實(shí)驗(yàn)用藥 附子，水煎濃縮，濃度為0.675 g生藥/ml，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑與儀器 大鼠全基因組表達(dá)譜基因芯片，芯片類型：RatRef-12-V1，芯片條形碼編號(hào)：4562019003(美國(guó)Illumina公司);Unizol試劑和cRNA擴(kuò)增與標(biāo)記試劑盒(上海博星基因芯片有限責(zé)任公司);DEPC(美國(guó)Sigma公司);定量PCR試劑盒(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司);微珠芯片掃描儀和微珠芯片分析軟件(美國(guó) Illumina公司);核酸分析儀(美國(guó) Infinigen公司);FR-200型凝膠成像儀(上海復(fù)日科技);AB 7900熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組與給藥方法 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為附子組和對(duì)照組，每組10只。附子組灌胃附子水煎濃縮液1 ml(含生藥)/100 g，對(duì)照組灌胃等容量生理鹽水，1次/d，連續(xù)20 d。

1.5 肝組織總RNA提取與質(zhì)量檢測(cè) 給藥結(jié)束后處理動(dòng)物，迅速剝?nèi)〈笫蟾谓M織，Unizol試劑提取肝組織總RNA，核酸分析儀定量，1%瓊脂糖凝膠電泳質(zhì)檢。

1.6 RNA擴(kuò)增和芯片制作 按照Illumina Total Prep RNA擴(kuò)增試劑盒操作程序進(jìn)行RNA擴(kuò)增。RNA反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈cDNA，合成第2鏈 cDNA，cDNA純化，體外轉(zhuǎn)錄合成 cRNA，cRNA純化，雜交，洗滌，染色，干燥后進(jìn)行芯片掃描。

1.7 基因芯片數(shù)據(jù)處理與分析 應(yīng)用微珠芯片掃描儀掃描芯片，應(yīng)用微珠芯片圖像分析軟件對(duì)芯片灰度掃描圖進(jìn)行分析處理。應(yīng)用立方樣條函數(shù)(Cubic Spline)方法對(duì)原始數(shù)據(jù)歸一化處理。差異基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)為附子組與對(duì)照組為有效基因，且實(shí)驗(yàn)組差異分值(Diffscore值)＜-20或者大于＞+20。利用Agilent Genespring GX 11分析軟件對(duì)差異基因按照Gene Ontology(GO)分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行基因功能分類注釋，Log10P值＜-1.3的基因功能為顯著性基因功能。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證 選取附子組與對(duì)照組比較差異表達(dá)的基因 Gclc為目的基因，β-actin為管家基因，采用SYBR GreenⅠ法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)以驗(yàn)證芯片數(shù)據(jù)的可靠性。引物由primer-5.0設(shè)計(jì)，基因Gclc的引物序列：上游：ACCTCTGCTGAGAACAGTCGTC，下游：ATCTGGAATGAAATGAATGGCT。實(shí)時(shí)PCR分析由AB 7900熒光定量PCR儀完成。每個(gè)樣本重復(fù)測(cè)定3次。

2 結(jié)果

2.1 總RNA抽提結(jié)果 兩組總RNA的Ratio比值(OD260nm/OD280nm)均在2.0左右，電泳檢查有清晰的RNA條帶，28 S和18 S比值在2∶1以上，符合基因芯片質(zhì)量檢測(cè)要求。見圖1。

圖1 各組RNA的電泳圖

2.2 基因芯片Cy3熒光掃描圖像 見圖2。

2.3 基因表達(dá)譜結(jié)果與生物信息學(xué)分析 附子組與對(duì)照組比較有592條基因差異表達(dá)，應(yīng)用Agilent Genespring GX 11分析軟件對(duì)差異基因進(jìn)行基因功能顯著性分析，催化活性基因功能為較顯著性基因功能(Log10P值為-11.534 6)，42條差異基因與氧化還原酶活性相關(guān)(上調(diào)26條，下調(diào)16條)，其中7條與氧自由基的生成和清除相關(guān)，3條涉及性激素代謝。見表1。

圖2 各組芯片熒光掃描圖

表1 附子組與對(duì)照組比較部分差異表達(dá)基因列表

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證 Gclc基因在附子組與對(duì)照組2-△△Ct數(shù)值比是2.120 4，說(shuō)明附子可以上調(diào)Gclc基因表達(dá)，與芯片結(jié)果一致。

3 討論

附子可顯著增強(qiáng)老齡大鼠抗氧化酶活性，降低自由基代謝產(chǎn)物含量，起到延緩衰老的作用〔2〕;所含附子多糖能夠清除運(yùn)動(dòng)過(guò)程中產(chǎn)生的自由基，具有一定的抗氧化作用〔3〕。提示抗氧化、抗衰老可能是附子發(fā)揮溫?zé)嵝?yīng)的途徑之一。

超氧陰離子是活性氧自由基的重要代表。NADPH氧化酶是機(jī)體內(nèi)超氧陰離子生成的重要催化酶〔4，5〕，由膜亞基細(xì)胞色素b558(p22phox和 gp91phox蛋白)、多個(gè)細(xì)胞質(zhì)亞基(p47phox、p67phox和 p40phox蛋白)和小 G 蛋白 Rac-1 組成〔6，7〕，其中 p22phox和p47phox分子分別由Cyba(NM_024160)和Ncf1(NM_053734)基因編碼。研究結(jié)果顯示，附子組Cyba和Ncf1表達(dá)下調(diào)，提示附子可能通過(guò)下調(diào)Cyba和Ncf1表達(dá)水平，導(dǎo)致NADPH氧化酶水平或活性降低，減少超氧陰離子的生成〔8〕。

研究發(fā)現(xiàn)，與自由基清除有關(guān)的 Gpx1、Gsr、Gclc、Dhcr2等基因表達(dá)上調(diào)。谷胱甘肽(GSH)是細(xì)胞內(nèi)重要的水溶性抗氧化劑，是羥自由基、H2O2和單線態(tài)氧的清除劑。谷氨酸半胱氨酸連接酶(GCL)是生物體內(nèi)GSH合成的限速酶。Gclc(NM_012815)編碼其催化亞單位，含有GCL所有底物的結(jié)合位點(diǎn)和所有的催化亞基，具有全酶活性〔9〕，其表達(dá)上調(diào)可增加GSH合成。Gpx1(NM_030826)和Gsr(NM_053906)則分別編碼谷胱甘肽過(guò)氧化物酶-1(GPx-1)和谷胱甘肽還原酶(GSR)。GPx-1是生物機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶之一，利用谷胱甘肽作為還原劑，將生物體內(nèi)的H2O2或脂質(zhì)過(guò)氧化物轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O或較穩(wěn)定的脂類烴基化合物，從而阻斷活性氧對(duì)機(jī)體的損傷。GSR利用NADPH+H+作為供氫體，將上述反應(yīng)生成的氧化型的谷胱甘肽(GSSG)轉(zhuǎn)變?yōu)?GSH，以保證生理?xiàng)l件下細(xì)胞內(nèi) GSH和GSSG的高比值〔10〕。Dhcr24(XM_216452)編碼的24-脫氫膽固醇還原酶也被證實(shí)具有清除H2O2，抗氧化作用〔11〕。

此外，研究結(jié)果顯示，附子可調(diào)控性激素代謝相關(guān)基因的表達(dá)，上調(diào)雄激素代謝相關(guān)Srd5a1、Cyp3a18基因表達(dá)，下調(diào)性激素滅活相關(guān)基因Hsd17b2表達(dá)。Srd5a1(NM_017070)編碼類固醇-5α-還原酶-1，能催化睪酮轉(zhuǎn)化為生物活性不盡相同的另一種雄激素二氫睪酮;Cyp3a18(NM_145782)編碼CYP3A18蛋白，具有睪酮羥化酶活性，在雄激素代謝中發(fā)揮重要作用。Hsd17b2(NM_024391)編碼的17β-羥類固醇脫氫酶-2可催化雄激素和雌激素轉(zhuǎn)變?yōu)榈突钚缘男问?，參與雌二醇、睪酮和DHT的滅活和排泄過(guò)程〔12〕。附子調(diào)控參與性激素代謝的氧化還原酶基因表達(dá)，可促進(jìn)性激素轉(zhuǎn)化，減少其滅活和排泄。

由上可知，附子可調(diào)控氧自由基代謝相關(guān)基因的表達(dá)，即下調(diào)超氧陰離子生成催化酶基因水平，上調(diào)自由基清除相關(guān)基因表達(dá)水平，而減少自由基的生成，促進(jìn)自由基的清除，發(fā)揮抗氧化作用;調(diào)控與性激素代謝相關(guān)的基因表達(dá)以促進(jìn)性激素轉(zhuǎn)化，減少性激素滅活，發(fā)揮一定抗氧化、抗衰老作用，這可能是附子“助陽(yáng)補(bǔ)火”臨床用治陽(yáng)虛衰老的重要途徑，也是其溫?zé)嵝?yīng)發(fā)揮的分子機(jī)制之一。

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