張 琴 彭 俊 沈 薇 (重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科，重慶 40000)

肝X受體(LXRs)可參與機(jī)體多種生理活動調(diào)節(jié)，包括脂肪代謝、膽固醇代謝等〔1，2〕。LXRs包括 LXRα 和 LXRβ 兩種亞型，其中前者主要表達(dá)于肝臟、脂肪組織等，后者廣泛表達(dá)于全身各組織〔3〕。在肝臟，LXRα是脂代謝的關(guān)鍵調(diào)控點(diǎn)，近年來研究顯示乙肝病毒X蛋白(HBx)可通過與LXRα相互作用調(diào)節(jié)參與脂肪酸和甘油三酯的酶如脂肪酸合酶(FAS)等的轉(zhuǎn)錄，從而引起脂代謝紊亂和肝細(xì)胞脂肪變性〔4〕。RNA干擾(RNAi)技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一項(xiàng)特異性抑制基因表達(dá)的新方法，具有特異性、轉(zhuǎn)染效率高、作用強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛用于抗病毒抗腫瘤等研究〔5〕。我們前期實(shí)驗(yàn)提示HBx可以上調(diào)LXRα的表達(dá)引起肝細(xì)胞脂肪變，為了進(jìn)一步研究HBx的作用機(jī)制，本研究擬構(gòu)建能產(chǎn)生針對LXRα基因的短發(fā)夾小干擾RNA(shRNA)真核表達(dá)質(zhì)粒，并用構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞，篩選出高效沉默LXRα基因的序列，將對研究乙肝合并肝脂肪變的發(fā)生機(jī)制提供有力的工具。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 載體pGenesil-1.1(含hU6啟動子、Kan/Neo抗性、EGFP熒光)及大腸桿菌 DH5α(武漢晶賽公司);HepG2.2.15細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存;T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶Eco31I和SacI(Takara公司);通用陰性對照質(zhì)粒(武漢晶賽公司);質(zhì)粒小抽提試劑盒(BioRad公司);凝膠DNA回收試劑盒(美國Promega公司);轉(zhuǎn)染試劑PolyJetTM(SignaGen公司);小鼠抗人LXRα單克隆抗體(Abcam公司);山羊抗小鼠β-actin抗體(北京天根公司);總RNA抽提及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Bioteke公司);核蛋白提取試劑盒(凱基生物)，胎牛血清(杭州四季青公司)。

1.2 方法

1.2.1 靶序列的選擇 在GenBank中找到LXRα mRNA基因序列(基因NM號:001130101)，通過www.genscript.com網(wǎng)站，根據(jù)RNA干擾設(shè)計原則設(shè)計三個siRNA作用的靶序列(表1)。

1.2.2 LXRα基因的shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 轉(zhuǎn)錄模板合成的引物結(jié)構(gòu)為CACC+Sense+Loop+Antisense+終止信號 +SacI，構(gòu)建質(zhì)粒載體插入的DNA模板序列見表2。模板中l(wèi)oop結(jié)構(gòu)選用了TTCAAGACG以避免形成終止信號，轉(zhuǎn)錄終止采用T6結(jié)構(gòu)(正義鏈和反義鏈由上海生工公司合成)。合成 DNA oligo 分別用 30 μl annealing buffer溶解，再各取 2 μl與16 μl annealing buffer混勻，94℃水浴退火自然冷卻至室溫，各取1 μl退火產(chǎn)物加入99 μl H2O做100倍稀釋。退火處理后的shRNA模板用于連接反應(yīng)。

表1 LXRα基因的shRNA序列

表2 LXRα基因shRNA表達(dá)載體的模板序列

1.2.3 酶切和連接反應(yīng) 質(zhì)粒載體pGenesil-1.1用Eco31Ⅰ酶切，1%瓊脂糖凝膠回收大片段。稀釋退火片段分別與線性化的pGenesil-1.1質(zhì)粒表達(dá)載體連接。連接反應(yīng)條件:取稀釋退火片段 1 μl，線性化質(zhì)粒載體 1 μl，10 × ligase buffer 1 μl，T4 DNA ligase 1 μl，H2O 6 μl，置于 37℃水浴過夜。

1.2.4 重組質(zhì)粒載體的轉(zhuǎn)化、篩選 各取5 μl過夜的鏈接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，分別涂布與含kana抗性(終濃度為30 μg/ml)的LB平板上，37℃恒溫箱培養(yǎng)過夜。從每個培養(yǎng)皿上各挑取3個單克隆菌落接種于3 ml含kana抗性卡那抗性(終濃度為30 μg/ml)的LB培養(yǎng)基中，37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)過夜。質(zhì)粒抽提試劑盒抽提重組質(zhì)粒，保存于-20℃冰箱備用，分別用SacI做酶切鑒定。酶切反應(yīng)條件:質(zhì)粒DNA8.5 μl，10×ligase buffer 1 μl，SacI 0.5 μl，37℃水浴反應(yīng) 3 h。

1.2.5 重組質(zhì)粒鑒定 ①酶切鑒定酶切后產(chǎn)物經(jīng)1%Agarose凝膠電泳，EB染液染色10 min，紫外燈觀察結(jié)果。②測序鑒定擴(kuò)增菌液送上海生工公司測序。

1.2.6 細(xì)胞培養(yǎng)和分組HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)于含15%胎牛血清、200 μg/mlG418的 RPMI-1640培養(yǎng)基，37℃、5%二氧化碳孵箱培養(yǎng)，每2～3天用25%胰酶消化傳代細(xì)胞分為5組，第1組為空白對照組;第2組為陰性對照組(HK組);第3、4、5組分別為 shRNA-LXRα1組、shRNA-LXRα2組、shRNA-LXRα3組。

1.2.7 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 待細(xì)胞長至80%～90%融合時接種于6孔板，次日按轉(zhuǎn)染試劑說明書操作步驟轉(zhuǎn)染細(xì)胞。第1組未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒;第2 組以轉(zhuǎn)染試劑 PolyJetTM 4 μl∶1.5 μg HK 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞;第 3、4、5 組分別以 PolyJetTM 4 μl∶1.5 μg LXRα1、LXRα2、LXRα3質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后10～18 h細(xì)胞換液。48 h后在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光的表達(dá)。并計算轉(zhuǎn)染效率。EGFP為綠色熒光標(biāo)志物，故根據(jù)細(xì)胞內(nèi)綠色熒光的數(shù)量可以判斷轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞的數(shù)量〔6〕。白光下固定一視野，細(xì)胞總數(shù)計數(shù)，再轉(zhuǎn)換熒光光源計數(shù)攜帶綠色熒光的細(xì)胞數(shù)，則轉(zhuǎn)染效率(%)=有熒光表達(dá)的細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%，每孔細(xì)胞隨機(jī)選取5個視野，重復(fù)3次，取其平均值。

1.2.8 RT-PCR檢測LXRα mRNA的表達(dá) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后抽提各組細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，再以5 μl cDNA為模板，擴(kuò)增 LXRα基因片段。LXRα基因引物為:上游:5'-GGAACAACTGGGCATGATCG-3'，下 游:5'-ATAGCAATGAGCAAGGCAAACT-3'。產(chǎn)物長度:462 bp。β-actin引物為:上游:5'-TGACGGTCAGGTCATCACTATCGGCAATGA-3'，下 游:5'-TTGATCTTCATGGTGATAG GAGCGAGGGCA-3'。 產(chǎn) 物 長 度:259 bp。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)，最后72℃終延伸2 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，相對表達(dá)量用LXRα與β-actin灰度值的比值表示，采用Quantity-one軟件進(jìn)行半定量分析。

1.2.9 Western印跡檢測LXRα蛋白的表達(dá) 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后，細(xì)胞用胰酶消化，4℃離心，5 min收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗3次，根據(jù)核蛋白提取試劑盒操作步驟提取各組細(xì)胞核蛋白。BCA法測定蛋白濃度，-70℃保存。上樣前蛋白樣品與等量2×蛋白處理液混勻，煮沸5 min，上樣到12%SDS-PAGE中，每孔按100 μg上樣，電泳分離后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，用5%脫脂奶粉搖床上封閉1 h，加入LXRα抗體(1∶2 000)，4℃孵育過夜，次日PBST漂洗三次后加入二抗(1∶5 000)，室溫孵育2 h，ECL顯色。用LXRα與內(nèi)參灰度比值表示LXRα蛋白的相對表達(dá)量，Quantity-one軟件比較后進(jìn)行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用s表示。多樣本均數(shù)比較用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的酶切及測序 質(zhì)粒pGenesil-1.1的多克隆位點(diǎn)(MCS)如下:-MluI-hU6 promoter-Insert DNA-SacI-，在插入的目的基因片段里，我們分別設(shè)計了一個SacI的酶切位點(diǎn)，而質(zhì)粒載體pGenesil-1.1本身有一個SacI的酶切位點(diǎn)，若插入正確，質(zhì)粒就能被SacI酶切出一條約916 bp的DNA小帶。經(jīng)酶切鑒定分析三條重組質(zhì)粒均符合設(shè)計要求(圖1)，送轉(zhuǎn)化菌液測序插入的片段堿基序列完全符合設(shè)計要求。

圖1 重組質(zhì)粒酶切圖譜

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率 陰性對照組和轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的三組細(xì)胞內(nèi)均可見綠色熒光，未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的空白對照組細(xì)胞內(nèi)未見熒光(圖2);HK轉(zhuǎn)染組及 shRNA-LXRα1組、shRNA-LXRα2組、shRNA-LXRα3組平均轉(zhuǎn)染效率分別為:79.21% ±0.06%、79.19±0.0798%、79.24% ±0.08%、79.10% ±0.13%，各組細(xì)胞間轉(zhuǎn)染效率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

2.3 RT-PCR檢測結(jié)果 空白對照組、HK組、shRNA-LXRα1組、shRNA-LXRα2組和 shRNA-LXRα3組 LXRα/β-actin比值分別為:0.83±0.02、0.84±0.03、0.28±0.03、0.52±0.04、0.53±0.03。與空白對照組和 HK 組比較，LXRα1、LXRα2和 LXRα3組中 LXRα mRNA表達(dá)較低，且 LXRα1組表達(dá)量明顯低于LXRα2和LXRα3組(P＜0.05)(圖3)。

圖2 熒光顯微鏡觀察各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率(×100)

2.4 Western印跡檢測結(jié)果 空白對照組、HK組、shRNALXRα1組、shRNA-LXRα2組和 shRNA-LXRα3組電泳條帶灰度值 LXRα/β-actin比值分別為:0.78±0.02、0.77±0.03、0.30±0.03、0.54 ±0.02、0.53±0.02。其中 LXRα1、LXRα2 和 LXRα3組LXRα蛋白表達(dá)低于空白對照組和HK組，且LXRα1組表達(dá)量明顯低于LXRα2和LXRα3組(P＜0.05)(圖4)。

圖3 各組細(xì)胞LXRα mRNA的表達(dá)

圖4 各組細(xì)胞內(nèi)LXRα蛋白的表達(dá)

3 討論

LXRs是一種可以通過結(jié)合配體而激活的轉(zhuǎn)錄因子，屬于核受體家族成員，其主要包括LXRα和LXRβ兩個亞型，二者具有相同的核受體結(jié)構(gòu)〔7，8〕，LXRβ 表達(dá)廣泛，而 LXRα 僅在與脂代謝密切的肝臟、小腸、脂肪和巨噬細(xì)胞中高表達(dá)。LXRs與脂肪代謝有密切關(guān)系，被認(rèn)為是全身脂質(zhì)代謝的感受器之一，它可以上調(diào)SREBP1c的表達(dá)從而調(diào)節(jié)多種參與脂肪酸和甘油三酯合成的酶的轉(zhuǎn)錄，包括FAS、ACC等，從而導(dǎo)致宿主細(xì)胞脂代謝紊亂和脂肪變性〔9〕。研究顯示LXRs激動劑可導(dǎo)致肝臟內(nèi)的脂肪沉積和血漿中甘油三酯水平升高，甚至發(fā)生肝脂肪變性，說明LXRs在肝脂肪變中起重要作用。近年來研究證實(shí)病毒性肝炎常合并不同程度的肝脂肪變，我們前期實(shí)驗(yàn)提示乙肝病毒X蛋白(HBx)是乙肝合并肝脂肪變的主要病毒因素，且可能通過上調(diào)LXAα起作用，但其作用機(jī)制尚不明了。RNAi技術(shù)，是近幾年來出現(xiàn)的一種轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默技術(shù)，許多研究表明RNAi有很強(qiáng)的抑制目的基因的作用，具有穩(wěn)定性高、特異性強(qiáng)、效果顯著等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是PCR技術(shù)之后又一劃時代的基因工程方法。目前RNAi已經(jīng)廣泛用于抗病毒、抗腫瘤及疾病的基因治療的研究，并取得了良好的應(yīng)用前景〔10〕。HepG2.2.15細(xì)胞系是將克隆的HBV DNA及含有新霉素抗性基因的質(zhì)粒導(dǎo)入人肝癌細(xì)胞建立的細(xì)胞株，它可以持續(xù)表達(dá)HBx。為了進(jìn)一步研究HBx參與肝脂肪變性的作用機(jī)制，本研究擬用HepG2.2.15細(xì)胞為研究對象，構(gòu)建靶向LXAα的shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒，為下一步研究提供基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)中的質(zhì)粒載體是帶有EGFP綠色熒光蛋白的，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后直接在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光即可判斷轉(zhuǎn)染效率。高效的靶基因RNAi序列和通過有效的方法將質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞是RNAi成功的關(guān)鍵〔11〕，本研究設(shè)計的RNA干擾序列是根據(jù)通過計算機(jī)網(wǎng)絡(luò)和Tuschl新算法的設(shè)計原則設(shè)計的，通過酶切和測序鑒定提示序列的設(shè)計是完全符合要求的。以適宜比例的PolyJetTM和質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h綠色熒光蛋白的表達(dá)最高，且轉(zhuǎn)染效率都在78%以上，說明質(zhì)粒成功導(dǎo)入細(xì)胞，且我們設(shè)計合成的三條質(zhì)粒均能有效抑制LXRα mRNA及蛋白的表達(dá)，以shRNA-LXRα1沉默效果最好，我們的研究為進(jìn)一步探索HBx對肝細(xì)胞脂肪變性的作用機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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