韓之波 （中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所血液病醫(yī)院實(shí)驗(yàn)血液學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津300020）

圍產(chǎn)期間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和規(guī)模制備與保存技術(shù)及應(yīng)用

韓之波 （中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所血液病醫(yī)院實(shí)驗(yàn)血液學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津300020）

間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）是來(lái)源于中胚層的、具有高度自我更新能力和多向分化潛能的多能干細(xì)胞。系統(tǒng)地研究了P-MSC與骨髓MSC生物學(xué)特性和功能的異同，建立的圍產(chǎn)期間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和規(guī)模制備與保存技術(shù)體系，為推動(dòng)我國(guó)乃至國(guó)際干細(xì)胞藥物的開(kāi)發(fā)以及干細(xì)胞產(chǎn)業(yè)的發(fā)展起到積極的作用。

圍產(chǎn) 間充質(zhì)干細(xì)胞 骨髓 生物學(xué)

間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）是來(lái)源于中胚層的、具有高度自我更新能力和多向分化潛能的多能干細(xì)胞。MSC能在特定條件下分化為包括神經(jīng)細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、脂肪細(xì)胞在內(nèi)的多組織系統(tǒng)的細(xì)胞。此外，MSC對(duì)造血、免疫炎癥反應(yīng)、血管新生等人體重要功能起重要調(diào)節(jié)作用。MSC是繼造血干細(xì)胞之后又一類已經(jīng)在世界范圍內(nèi)廣泛臨床試驗(yàn)的干細(xì)胞，是組織工程的種子細(xì)胞。MSC因具有廣闊的臨床應(yīng)用前景，其技術(shù)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)已經(jīng)成為全球生物醫(yī)藥領(lǐng)域的競(jìng)爭(zhēng)熱點(diǎn)。

截止至2012年2月，在美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（National Institutes ofHealth，NIH）注冊(cè)的關(guān)于間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床研究已經(jīng)超過(guò)200項(xiàng)。和其他干細(xì)胞相比，間充質(zhì)干細(xì)胞因其具有良好的擴(kuò)增能力、來(lái)源廣泛、可避免倫理學(xué)問(wèn)題等優(yōu)勢(shì)，已逐漸成為干細(xì)胞治療的重要組成部分。中國(guó)是干細(xì)胞治療臨床研究比較發(fā)達(dá)的國(guó)家之一。國(guó)內(nèi)的科研機(jī)構(gòu)或醫(yī)院在NIH注冊(cè)了48項(xiàng)關(guān)于間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床研究。目前美、英、法、韓、印等國(guó)家藥品監(jiān)督管理部門(mén)已批準(zhǔn)了20多個(gè)干細(xì)胞制品分別進(jìn)入I、II、III期臨床研究。2010年5月4日美國(guó)FDA授權(quán)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞Prochymal作為孤兒藥用于Ⅰ型糖尿病的臨床治療，韓國(guó)2011年7月1日批準(zhǔn)了自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞Hearticellgram-AMI上市，用于心梗和心衰治療。2012年1月19日韓國(guó)又批準(zhǔn)了全球首個(gè)的異基因干細(xì)胞藥物——臍帶血來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞CartiStem上市，用于植入治療關(guān)節(jié)軟骨缺損。

然而，從何種組織、用什么技術(shù)去分離培養(yǎng)出高純度、安全、有效、穩(wěn)定、可規(guī)?；苽?、質(zhì)量可控、數(shù)量足夠的MSC，這是干細(xì)胞領(lǐng)域的核心技術(shù)。骨髓是以前公認(rèn)的MSC主要來(lái)源，但實(shí)際上骨髓中MSC的含量極少，僅占成人骨髓單個(gè)核細(xì)胞的0.002%～0.005%。近年發(fā)現(xiàn)臍血、臍帶、胎盤(pán)、脂肪、肌肉、頭皮、牙周質(zhì)等多種組織中也可分離得到MSC。研究還發(fā)現(xiàn)，人體內(nèi)MSC的數(shù)量隨著年齡的增大而減少，在骨髓細(xì)胞中的含量分別是出生時(shí)為1/10 000，10歲為1/10萬(wàn)，30歲為1/25萬(wàn)，50歲為1/40萬(wàn)，80歲為1/200萬(wàn)。由于人體內(nèi)MSC是供人一生中組織修復(fù)和再生所必需的，從倫理學(xué)、醫(yī)學(xué)、細(xì)胞工程學(xué)的角度來(lái)看，成人體內(nèi)的MSC顯然不適合作為一種可以批量化生產(chǎn)用于常規(guī)治療的MSC來(lái)源，新的臨床適用型MSC亟待開(kāi)發(fā)。

韓忠朝教授領(lǐng)導(dǎo)的科研團(tuán)隊(duì)近十年來(lái)一直致力于臨床適用型間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒別、分離和培養(yǎng)擴(kuò)增，研究發(fā)現(xiàn)人臍帶、胎盤(pán)羊膜和絨毛膜、臍血和羊水等與出生相關(guān)的圍產(chǎn)期組織富含間充質(zhì)干細(xì)胞，現(xiàn)國(guó)際上統(tǒng)稱為圍產(chǎn)期間充質(zhì)干細(xì)胞。圍產(chǎn)期間充質(zhì)干細(xì)胞（Perinatal mesenchymal stem cells，P-MSC）是介于胚胎干細(xì)胞和成人干細(xì)胞之間的干細(xì)胞，其增殖和分化能力比胚胎干細(xì)胞低，但明顯高于成人干細(xì)胞（見(jiàn)圖1）。同時(shí)，韓忠朝教授領(lǐng)導(dǎo)的科研團(tuán)隊(duì)系統(tǒng)地研究了P-MSC與骨髓MSC生物學(xué)特性和功能的異同，發(fā)現(xiàn)P-MSC與骨髓MSC有類似特性，但增殖分化能力更強(qiáng)，免疫原性更低，具有很好的造血支持、免疫調(diào)節(jié)以及組織修復(fù)與再生功能，其機(jī)制與P-MSC分泌眾多因子和PGE2等有關(guān)。P-MSC不具致瘤性,也無(wú)明顯促瘤性,對(duì)白血病生長(zhǎng)有抑制等作用。由于胎盤(pán)臍帶取材方便并富含干細(xì)胞，P-MSC的提取和應(yīng)用系變廢為寶且不存在倫理問(wèn)題，特別易于規(guī)?；苽浜彤a(chǎn)業(yè)化操作。

韓忠朝教授領(lǐng)導(dǎo)的科研團(tuán)隊(duì)以圍產(chǎn)期間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)為主線，結(jié)合一些分析干細(xì)胞特性和基因穩(wěn)定性的新技術(shù)、種子干細(xì)胞庫(kù)技術(shù)、成品庫(kù)技術(shù)條件、拉曼光譜散射分析技術(shù)、干細(xì)胞活性精確分析技術(shù)等，形成了完整的P-MSC庫(kù)技術(shù)流程，包括供者篩選、組織（胎盤(pán)、臍帶、臍帶血）采集、P-MSC分離與培養(yǎng)鑒定、種子干細(xì)胞檢測(cè)保存、終產(chǎn)品規(guī)模制備與檢測(cè)、保存和發(fā)放使用的技術(shù)體系。

韓忠朝教授領(lǐng)導(dǎo)的科研團(tuán)隊(duì)組建了世界第一個(gè)圍產(chǎn)期間充質(zhì)干細(xì)胞庫(kù)，為公眾提供干細(xì)胞存儲(chǔ)服務(wù)，儲(chǔ)存量已突破10 000份。同時(shí)提供高純度P-MSC供研究用。干細(xì)胞庫(kù)工藝流程包括：①干細(xì)胞供者的篩查。②臍帶胎盤(pán)的無(wú)菌采集、運(yùn)輸、保存，既能保證P-MSC的生物學(xué)活性，又能減少污染。③種子P-MSC庫(kù)技術(shù)，P-MSC的分離、規(guī)?；苽浜捅４婕夹g(shù)是P-MSC庫(kù)建立的核心技術(shù)。通過(guò)對(duì)酶的種類、濃度、時(shí)間、溫度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，篩選出最佳組合，顯著提高了細(xì)胞的分離效率。通過(guò)對(duì)凍存保護(hù)劑的配方進(jìn)行優(yōu)化，顯著提高了細(xì)胞的活率。用氣相液氮罐保存細(xì)胞，大大降低了細(xì)胞間交叉污染的可能。④P-MSC的檢測(cè)，由于是新技術(shù)，國(guó)內(nèi)外缺乏檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。為了確保干細(xì)胞的安全性、有效性和質(zhì)量可控性，科研團(tuán)隊(duì)又建立了MSC庫(kù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，其中檢測(cè)參數(shù)二十幾項(xiàng)，藥典上沒(méi)有的參數(shù)科研團(tuán)隊(duì)都一一建立方法，并完成了工作量巨大的方法驗(yàn)證工作。此外，在國(guó)際上首次建立拉曼散射光譜傳感分析MSC的生物活力技術(shù)，測(cè)量不同狀態(tài)下干細(xì)胞的特征拉曼光譜，為干細(xì)胞生物活力的分析提供了無(wú)創(chuàng)性快速檢測(cè)技術(shù)。⑤質(zhì)量管理體系：建立了一套完善的質(zhì)量管理體系，對(duì)人、機(jī)、料、法、環(huán)等各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行質(zhì)量管理，實(shí)現(xiàn)對(duì)供者篩查、組織采集、運(yùn)輸、加工、檢測(cè)鑒定、凍存、放行等全過(guò)程的嚴(yán)格監(jiān)控，保證細(xì)胞庫(kù)的正常運(yùn)行。通過(guò)攻關(guān)，研究團(tuán)隊(duì)在國(guó)際上首次制定出《臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞庫(kù)公共庫(kù)技術(shù)條件》、《臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞庫(kù)自體儲(chǔ)存技術(shù)條件》和《臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制品技術(shù)條件》3種技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，獲政府頒發(fā)的產(chǎn)品執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)證書(shū)，通過(guò)ISO 9001國(guó)際認(rèn)證。這些標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范了干細(xì)胞的研究和產(chǎn)品制備，推動(dòng)了我國(guó)干細(xì)胞產(chǎn)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)程，制定的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)為國(guó)家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了依據(jù)。⑥一類新藥——注射用臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床前安全性的評(píng)價(jià)，包括對(duì)體外連續(xù)傳代培養(yǎng)的P-MSC選取不同代次進(jìn)行傳代穩(wěn)定性的研究，以觀察傳代過(guò)程是否會(huì)發(fā)生細(xì)胞的突變。檢測(cè)參數(shù)包括：染色體核型、癌基因、端粒酶、細(xì)胞表型、分化能力。結(jié)果表明，P-MSC經(jīng)過(guò)傳代后不會(huì)發(fā)生細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，傳代過(guò)程安全穩(wěn)定。同時(shí)，在注射用臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床前安全性評(píng)價(jià)中開(kāi)展了全方面的實(shí)驗(yàn)，包括：急性毒性試驗(yàn)、長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)、全身過(guò)敏反應(yīng)、溶血性試驗(yàn)、致瘤試驗(yàn)、對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響試驗(yàn)。

另外，韓忠朝教授領(lǐng)導(dǎo)的科研團(tuán)隊(duì)對(duì)注射用臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的制備工藝進(jìn)行了嚴(yán)格的規(guī)范，對(duì)原料、中間品、成品都采取了嚴(yán)格的質(zhì)量控制措施，制定了《注射用間充質(zhì)干細(xì)胞（臍帶）制造和檢定規(guī)程》，規(guī)定了供者原代傳代細(xì)胞庫(kù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、成品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，篩選出供者細(xì)胞作為安全種子的來(lái)源，對(duì)每批成品進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)，全部項(xiàng)目合格方可入庫(kù)供臨床使用，以此保證臨床供應(yīng)細(xì)胞的安全性。該質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)過(guò)中檢所專家審核，同時(shí)按該規(guī)程制備的樣品經(jīng)中檢所復(fù)核檢驗(yàn)全部合格。

采用自主創(chuàng)新技術(shù)形成的產(chǎn)品也產(chǎn)生了良好的經(jīng)濟(jì)效益，從2007年起投入市場(chǎng)到2011年12月底，累計(jì)收入達(dá)1.05億萬(wàn)元人民幣。同時(shí)，該技術(shù)體系的建立也受到國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注。2009年3月3日，韓忠朝應(yīng)邀在法蘭西國(guó)家醫(yī)學(xué)科學(xué)院（Academie Nationale de Medecine）院士會(huì)議上報(bào)告了圍產(chǎn)期間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床前和臨床實(shí)驗(yàn)性治療的成功結(jié)果，引起該院的高度重視。會(huì)后法蘭西國(guó)家醫(yī)學(xué)科學(xué)院專門(mén)成立了5個(gè)院士工作小組，調(diào)查分析圍產(chǎn)期間充質(zhì)干細(xì)胞的科學(xué)優(yōu)勢(shì)、潛在風(fēng)險(xiǎn)和倫理法律相關(guān)問(wèn)題，提出干細(xì)胞治療的建議，并在法蘭西國(guó)家醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊上發(fā)表研究報(bào)告。隨著研究的深入，法蘭西國(guó)家醫(yī)學(xué)科學(xué)院于2011年12月13日再次邀請(qǐng)韓忠朝于2012年1月在該院作一個(gè)《自體和異基因圍產(chǎn)期干細(xì)胞的應(yīng)用》的學(xué)術(shù)報(bào)告，獲得院士們的高度評(píng)價(jià)。

韓忠朝教授領(lǐng)導(dǎo)的科研團(tuán)隊(duì)建立的圍產(chǎn)期間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和規(guī)模制備與保存技術(shù)體系，為推動(dòng)我國(guó)乃至國(guó)際干細(xì)胞藥物的開(kāi)發(fā)以及干細(xì)胞產(chǎn)業(yè)的發(fā)展起到積極的作用。截至2011年11月22日，美國(guó)NIH的臨床試驗(yàn)網(wǎng)站（www.clinicaltrials.gov）已登記的P-MSC臨床試驗(yàn)已經(jīng)達(dá)58項(xiàng)（33項(xiàng)臍帶MSC，22項(xiàng)臍血MSC，3項(xiàng)胎盤(pán)MSC）。自從2007年韓忠朝教授領(lǐng)導(dǎo)的科研團(tuán)隊(duì)組建了世界第一個(gè)圍產(chǎn)期間充質(zhì)干細(xì)胞庫(kù)以來(lái)，目前國(guó)際和國(guó)內(nèi)已經(jīng)有多家干細(xì)胞庫(kù)開(kāi)展了圍產(chǎn)期間充質(zhì)干細(xì)胞的技術(shù)服務(wù)，還有多個(gè)圍產(chǎn)期間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞治療藥物正在進(jìn)行臨床前或臨床研究。國(guó)內(nèi)單位在國(guó)內(nèi)外學(xué)術(shù)刊物發(fā)表圍產(chǎn)期間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)的臨床試驗(yàn)結(jié)果論文有31篇，接受實(shí)驗(yàn)性治療的患者近400例，涉及GVHD、自身免疫疾病、再障、心臟病、腦血管病、肝硬化、糖尿病等，結(jié)果顯示出其具有良好的應(yīng)用前景，為許多難治性疾病提供了新的治療方案。■

2012-03-06