葉寶東 邵科釘 陳丹 張宇 吳迪炯 周郁鴻 沈一平 俞慶宏 沈建平

重癥肌無力(myasthenia gravis，MG)是一種影響神經(jīng)－肌肉傳遞的獲得性自身免疫病，表現(xiàn)為局部或全身肌肉的無力及疲勞癥。多數(shù)患者使用免疫抑制、胸腺切除、抗膽堿酯酶藥、免疫球蛋白、血漿置換等治療后可獲得長期緩解［1］。然而仍有少數(shù)難治性MG患者對常規(guī)治療無效，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，極易出現(xiàn)MG危象而危及生命。自體造血干細(xì)胞移植(autologous hematopoietic stem cell transplantation，auto-HSCT)是治療難治性MG的有效方法之一，其遠(yuǎn)期療效報道較少。我們觀察了浙江省中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院2005年2月至2010年2月期間采用非清髓預(yù)處理方案行純化的CD34+細(xì)胞auto-HSCT治療5例難治性MG患者的遠(yuǎn)期療效，報道如下。

1 對象與方法

1．1 對 象

5例MG患者符合以下難治性MG定義［2］:(1)免疫抑制劑依賴，減小劑量即復(fù)發(fā);(2)免疫抑制治療后臨床癥狀不能控制;(3)免疫抑制劑不良反應(yīng)較大，難以耐受。2005年2月至2010年2月期間采用FAC預(yù)處理方案行純化的自體外周血CD34+細(xì)胞移植的難治性MG患者5例，均為女性，中位年齡36(27～47)歲，中位病程3(1～22)年。5例患者移植前均使用抗膽堿酯酶藥和多種免疫抑制劑、大劑量靜脈用免疫球蛋白沖擊和血漿置換等治療，但不能控制癥狀，其中有4例已行胸腺瘤切除術(shù)。4例患者因多次MG危象出現(xiàn)嚴(yán)重呼吸衰竭而行氣管插管、呼吸機輔助通氣治療，其中1例因1年內(nèi)2次行氣管切開術(shù)，一直未封管至移植前。5例患者在行干細(xì)胞動員前均有肌力明顯下降表現(xiàn)，肌力為Ⅱ～Ⅲ級，有吞咽困難、進(jìn)食嗆咳、呼吸困難等癥狀，肌疲勞試驗陽性，肌電圖呈重頻刺激遞減現(xiàn)象。4例患者乙酰膽堿受體抗體和胸腺瘤相關(guān)抗體陽性。3例CMV抗原陽性者予以更昔洛韋治療后轉(zhuǎn)陰。

1．2 外周血造血干細(xì)胞動員、采集及CD34+細(xì)胞分選

采用環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，Cy)4 g/m2，分2 d 給藥;粒細(xì)胞集落刺激因子5 ～10 μg·kg－1·d－1，從白細(xì)胞數(shù)跌至最低日開始使用至干細(xì)胞采集結(jié)束當(dāng)天。當(dāng)外周血白細(xì)胞數(shù)達(dá)(2～4)×109/L以上，單核細(xì)胞占全部白細(xì)胞的21% ～30%時，用血細(xì)胞分離機(COBE SPECTRA，美國金寶公司)采集外周血造血干細(xì)胞，循環(huán)血量為自身全血容量的2倍左右，根據(jù)移植需要每例患者采集2～3次。外周血采集物在采集后24 h內(nèi)進(jìn)行CD34+細(xì)胞分選，將采集物與抗CD34抗體(人源，德國美天旎生物技術(shù)公司)充分混合后，應(yīng)用細(xì)胞分選儀(Clini MACS，德國美天旎生物技術(shù)公司)進(jìn)行CD34+細(xì)胞分選、計數(shù)，將純化后的CD34+細(xì)胞按比例加入干細(xì)胞低溫凍存保養(yǎng)液(5%二甲基亞砜，5%人血白蛋白，肝素10 U/mL)，CD34+細(xì)胞終濃度為(4～5)×109/L，按每袋50 mL分裝，－80℃冰箱冷凍保存。

1．3 預(yù)處理方案

使用非清髓預(yù)處理(改良FAC)方案:磷酸氟達(dá)拉濱(fludarabine)30 mg·m－2·d－1，共 4 d;抗胸腺細(xì) 胞 球 蛋 白 (antithymocyte globulin，ATG)2．5 mg·kg－1·d－1或抗淋巴細(xì)胞球蛋白(antilyphocyte globulin，ALG)30 mg·kg－1·d－1，共 4 d;Cy 50 ～60 mg·kg－1·d－1，共 2 d。移植均在干細(xì)胞動員后1～2個月進(jìn)行。

1．4 CD34+細(xì)胞的回輸及其他用藥

于預(yù)處理結(jié)束后48 h回輸自體外周血CD34+細(xì)胞。取出－80℃冰箱冷凍保存的CD34+細(xì)胞置于42℃水浴箱解凍，回輸前予地塞米松5 mg靜脈推注，CD34+細(xì)胞在解凍后10～15 min內(nèi)從靜脈輸注。留取標(biāo)本進(jìn)行臺盼藍(lán)染色計算活細(xì)胞數(shù)。移植后第2天開始予粒細(xì)胞集落刺激因子每天5μg/kg皮下注射，至中性粒細(xì)胞計數(shù)達(dá)0．5×109/L以上時停用。移植后所有患者繼續(xù)原潑尼松、溴吡斯的明治療。在造血功能恢復(fù)后，根據(jù)臨床癥狀緩解程度，再逐漸減少潑尼松、溴吡斯的明用量，直至停用。

1．5 動態(tài)監(jiān)測指標(biāo)

移植后動態(tài)監(jiān)測患者的血常規(guī)變化，觀察造血恢復(fù);于移植前及移植后第1、6、12個月時采集血標(biāo)本，進(jìn)行自身免疫抗體檢測，同時應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測外周血淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)，T淋巴細(xì)胞選擇CD3、CD4、CD8，B淋巴細(xì)胞選擇 CD19，NK細(xì)胞選擇CD16、CD56。

1．6 統(tǒng)計學(xué)分析

統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 15．0軟件。治療前后均數(shù)比較采用配對樣本t檢驗:對正態(tài)分布指標(biāo)用方差分析，并作兩兩比較;對非正態(tài)分布指標(biāo)用非參數(shù)檢驗，多組間比較用Kruskal-Wallis H檢驗，兩兩比較用Mann-Whitney U檢驗。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 外周血干細(xì)胞采集和CD34+細(xì)胞分選結(jié)果

5例患者均1次動員成功，均采集2次。獲得單個核細(xì)胞數(shù)為(6．07 ±0．94)×108/kg，其中CD34+細(xì)胞數(shù)為(3．46 ±1．23)×106/kg。經(jīng)分選CD34+細(xì)胞數(shù)為(2．06 ±0．69)×106/kg，細(xì)胞純度為(82．10 ±6．03)%，回收率為(60．59 ±5．74)%。

2．2 造血和免疫重建情況

5例患者中性粒細(xì)胞計數(shù)達(dá)0．5×109/L以上中位時間10(8～12)d;血小板計數(shù)達(dá)20×109/L以上中位時間11(8～12)d。

所有患者移植前T淋巴細(xì)胞亞群分布與正常人群的分布接近。但移植后1個月T淋巴細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞均較移植前下降(P＜0．01);移植后6個月上述指標(biāo)升高(P＜0．01或 P＜0．05)，并在移植后12個月達(dá)到移植前水平。CD4+細(xì)胞移植后恢復(fù)速度及程度均較CD8+細(xì)胞顯著，詳見表1。

2．3 療 效

5例患者在行干細(xì)胞動員后肌力均有不同程度恢復(fù)，表現(xiàn)為吞咽困難、進(jìn)食嗆咳和呼吸困難癥狀減輕，但是肌疲勞試驗仍陽性。

移植后1個月，4例患者無明顯肌無力癥狀出現(xiàn)，四肢肌力均達(dá)到V級，復(fù)查肌電圖明顯好轉(zhuǎn)，肌疲勞試驗為陰性。1例氣管切開患者于移植后3個月四肢肌力達(dá)到V級，肌疲勞試驗仍為陽性。4例乙酰膽堿受體抗體、胸腺瘤相關(guān)抗體陽性患者在移植后1個月抗體轉(zhuǎn)陰2例，另2例在移植后6個月抗體轉(zhuǎn)陰。所有患者在移植后3～6個月停用所有藥物治療。

全部患者均隨訪至2012年2月，中位隨訪時間44(24～84)個月，其中4例患者肌力正常，恢復(fù)正常生活、工作，脫離藥物治療，1例氣管切開患者移植后12個月因疾病復(fù)發(fā)而再次應(yīng)用小劑量潑尼松、溴吡斯的明維持治療，目前MG癥狀控制良好，生活自理。5例患者移植后疾病狀況見表2。

2．4 不良反應(yīng)

5例患者干細(xì)胞動員時無明顯不良反應(yīng)發(fā)生，嘔吐、輕微骨痛2例，經(jīng)對癥處理后緩解。預(yù)處理后有發(fā)生ATG或ALG所致的血清病樣反應(yīng)(包括高熱、皮疹、小關(guān)節(jié)疼痛)3例，加用甲潑尼龍或氫化考的松治療后緩解。移植前3例CMV抗原陽性患者予更昔洛韋治療后轉(zhuǎn)陰，移植后未發(fā)生CMV感染。移植后發(fā)生兩下肺輕度細(xì)菌感染2例，應(yīng)用抗感染藥物后均有效控制。未發(fā)生肝靜脈閉塞病及出血性膀胱炎。

3 討論

異基因造血干細(xì)胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)在理論上可完全或接近完全免疫重建，是治愈自身免疫病的理想方式，因此有的移植中心開始應(yīng)用allo-HSCT治療難治性自身免疫病［3］。但是由于allo-HSCT后移植物抗宿主病等移植相關(guān)并發(fā)癥較高，限制了其在難治性自身免疫病中的推廣應(yīng)用。Auto-HSCT的優(yōu)點在于無移植物抗宿主病發(fā)生的危險，移植相關(guān)病死率較低，患者生活質(zhì)量較好，是目前治療難治性自身免疫病的主要移植技術(shù)，但缺點是疾病復(fù)發(fā)率較高［4］。因此，如何減少疾病復(fù)發(fā)，提高遠(yuǎn)期療效是目前auto-HSCT治療難治性MG的難點。

表1 5例難治性重癥肌無力患者移植前后淋巴細(xì)胞亞群變化(ˉx±s)

表2 5例難治性重癥肌無力患者移植后疾病狀況

在難治性自身免疫病行auto-HSCT治療中，多數(shù)中心應(yīng)用Cy(1．5～4 g/m2)聯(lián)合粒細(xì)胞集落刺激因子動員造血干細(xì)胞，也可單用粒細(xì)胞集落刺激因子動員。有相當(dāng)一部分患者采用了CD34+細(xì)胞分選移植［5］。目前使用的預(yù)處理方案采用非清髓預(yù)處理方案，如單用白消安、單用 Cy(150 mg/kg或200 mg/kg)，聯(lián)合ATG，全身照射聯(lián)合化療，也有應(yīng)用卡莫司汀、阿糖胞苷、白消安和依托泊苷聯(lián)合預(yù)處理［4］。FAC方案屬非清髓預(yù)處理方案，相對于清髓預(yù)處理方案具有預(yù)處理劑量低、毒副作用小，細(xì)胞植入速度快，多數(shù)患者能形成完全嵌合的特點，其目的在于使供受者之間產(chǎn)生雙向免疫耐受，適合于非腫瘤性疾病，年齡較大，有心、肝、腎、腦功能異常的患者。Auto-HSCT治療難治性MG的主要機制在于摧毀原有的免疫系統(tǒng)，通過自體干細(xì)胞輸注重建免疫并形成新的免疫耐受，不需要大劑量預(yù)處理方案清除腫瘤細(xì)胞，故非清髓方案更為適合。FAC方案可避免預(yù)處理骨髓抑制期較長帶來的致死性出血、感染危險，減輕藥物及全身照射對重要器官的損害。目前只有3個前瞻性隨機臨床試驗在驗證造血干細(xì)胞移植對自身免疫病的影響，方案分別采用Cy 200 mg/kg、ATG(兔)7．5 mg/kg，CD34+分選;Cy 120 mg/kg，ATG(equine)90 mg/kg，全 身 照 射 800 cGY，CD34+分選;Cy 200 mg/kg，ATG 7．5 mg/kg，未行CD34+分選［6］。目前尚未見完整的療效分析結(jié)果。

為了提高auto-HSCT對難治性MG的療效，我們嘗試應(yīng)用純化的自體外周血CD34+細(xì)胞移植治療，經(jīng)分選得到 CD34+細(xì)胞數(shù)為(2．06±0．69)×106個/kg，細(xì)胞純度為(82．10 ±6．03)%。預(yù)處理方案則采用非清髓的Cy+氟達(dá)拉濱+ATG/ALG方案。目前已完成的5例難治性MG患者的移植過程均順利，一般在移植后30 d患者血象完全恢復(fù)正常，未出現(xiàn)相關(guān)嚴(yán)重并發(fā)癥。通過檢測自身免疫抗體、肌電圖等進(jìn)一步評估病情，所有患者臨床癥狀緩解。目前中位隨訪時間已44(24～84)個月，其中4例患者肌力正常，恢復(fù)正常生活和工作，脫離藥物治療;1例氣管切開患者移植后12個月出現(xiàn)活動后肌無力癥狀，肌電圖有重頻刺激遞減現(xiàn)象，提示疾病復(fù)發(fā)。但是復(fù)查患者乙酰膽堿受體抗體和胸腺瘤相關(guān)抗體均為陰性，且移植前已經(jīng)行胸腺瘤切除術(shù)，復(fù)發(fā)可能與患者移植前病程已達(dá)22年有關(guān)。再次應(yīng)用小劑量潑尼松(10 mg/d)、溴吡斯的明(60 mg/次，每天3～4次)維持治療后肌無力癥狀控制良好，目前生活自理。

值得注意的是，有資料顯示自身免疫病患者在auto-HSCT治療后有少部分出現(xiàn)了至少1個其他繼發(fā)性自身免疫病。多因素分析結(jié)果提示使用ATG和細(xì)胞分選移植是重要危險因素［7］，故這些患者仍需加強自身免疫病的隨訪以防止遠(yuǎn)期并發(fā)癥的發(fā)生。

1 Kim JY，Park KD，Richman DP．Treatment of myasthenia gravis based on its immunopathogenesis［J］．J Clin Neurol，2011，7(4):173-183．

2 Nowak RJ，Dicapua DB，Zebardast N，et al．Response of patients with refractory myasthenia gravis to rituximab:a retrospective study［J］．Ther Adv Neurol Disord，2011，4(5):259-266．

3 Strober J，Cowan MJ，Horn BN．Allogeneic hematopoietic cell transplantation for refractory myasthenia gravis［J］．Arch Neurol，2009，66(5):659-661．

4 Daikeler T，Tichelli A，Passweg J．Complications of autologous hematopoietic stem cell transplantation for patients with autoimmune diseases［J］．JPediatr Res，2012，71(4 Pt 2):439-444．

5 Farge D，Labopin M，Tyndall A，et al．Autologous hematopoietic stem cell transplantation for autoimmune diseases:an observational study on 12 years'experience from the European Group for Blood and Marrow Transplantation Working Party on Autoimmune Diseases［J］．Haematologica，2010，95(2):284-292．

6 Tyndall A．Successes and failures of stem cell transplantation in autoimmune diseases［J］．Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2011，2011:280-284．

7 Daikeler T，Labopin M，Di Gioia M，et al．Secondary autoimmune diseases occurring after HSCT for an autoimmune disease:a retrospective study of the EBMT Autoimmune Disease Working Party［J］．Blood，2011，118(6):1693-1698．