王鵬舉，王天云，王亞峰

核基質(zhì)結(jié)合區(qū)(matrix attachment region, MAR)或核骨架結(jié)合區(qū)(scaffold attachment region, SAR)是富含AT堿基對的非編碼序列，作為一種邊界元件對染色體組裝有重要的作用，能將DNA環(huán)錨定到核基質(zhì)上，而且將MAR構(gòu)建到外源基因表達(dá)盒兩側(cè)時，能提高外源基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平[1-2]，但目前關(guān)于MAR的調(diào)控機(jī)制還不清楚。MAR作為一種順式DNA調(diào)控元件，必需與反式作用因子結(jié)合才能發(fā)揮其調(diào)控作用。因此，研究MAR結(jié)合蛋白(MAR binding protein, MBP)對研究MAR在基因表達(dá)中的調(diào)控作用有重要的意義。目前，MBP的研究主要集中在高等綠色植物和脊椎動物中。高等生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)復(fù)雜，存在器官組織分化問題，不同的分化組織中細(xì)胞基因表達(dá)的方式和種類不同，MAR序列及其結(jié)合蛋白也可能存在差別。真核生物中只有缺乏組蛋白和核小體的單細(xì)胞甲藻類與高等植物及脊椎動物相似，含有核基質(zhì)[3]。杜氏鹽藻是一種單細(xì)胞真核藻類，是研究MAR及其調(diào)控機(jī)制的良好材料。前期的研究中，我們從鹽藻分離出了3個能顯著提高外源基因表達(dá)的MAR序列[4]和MBP基因，并發(fā)現(xiàn)MBP和C端片段蛋白能定位于CHO的細(xì)胞核[5]。為了研究MBP體外結(jié)合MAR序列的能力及其在鹽藻內(nèi)的功能，需要了解MBP的表達(dá)情況和獲得真核表達(dá)的MBP及其有活性的部分。本研究在前期研究基礎(chǔ)上，根據(jù)鹽藻的生長情況，實(shí)時熒光定量PCR檢測MBP基因的表達(dá)變化，構(gòu)建MBP的cDNA全長序列及N端和C端序列的含有組氨酸標(biāo)簽的真核表達(dá)載體，western blotting檢測基因表達(dá)情況，為下一步分離真核表達(dá)的鹽藻MBP，研究其與MAR相互作用的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料杜氏鹽藻(UTEX 1644)購自美國德州大學(xué)，大腸桿菌 JM109、pcDNA3.1(+)質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存，CHO購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.2試劑胎牛血清購自天津TBD公司，F(xiàn)12/DMEM培養(yǎng)基和胰酶購自HyClone公司，Premix Ex Taq(Perfect Real Time)，cDNA第一鏈合成試劑盒購自TaKaRa公司，RNA提取試劑TRIZOL和Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司，各種抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，DNA Marker、蛋白Marker 購自Fermentas公司。引物合成及測序由上海基康生物技術(shù)公司完成。

1.3方法

1.3.1鹽藻細(xì)胞的培養(yǎng)鹽藻細(xì)胞接種于Ben-Amotz培養(yǎng)基中，在26℃條件下光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為4 500 Lux，光暗周期各12 h。將對數(shù)生長期的鹽藻涂到含0.8%瓊脂糖的固體培養(yǎng)板上，3周后挑取單克隆，轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。以5×105/mL的接種量接種于液體培養(yǎng)基中，每天用血球計數(shù)器統(tǒng)計鹽藻的生長，持續(xù)18 d，制作生長曲線。

1.3.2鹽藻細(xì)胞總RNA的提取和實(shí)時熒光定量PCR引物的設(shè)計連續(xù)18 d選取1×107個狀態(tài)良好的鹽藻，4 000 r/min離心收集藻體，TRIZOL試劑提取杜氏鹽藻總RNA，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈，備用。根據(jù)我們在GenBank上登錄杜氏鹽藻MBP cDNA和DNA全長序列，由上?；瞪锛夹g(shù)公司設(shè)計并合成產(chǎn)物長度為124 bp的實(shí)時熒光定量PCR引物和Taqman探針，其中Taqman跨兩個外顯子，上游引物FP：5′-AGTTCCAGGACACGACGGAG-3′，下游引物RP：5′-TTATCGAGGATGGCCAGCTC-3′，Taqman探針：5′-ACAGCAAGCTCAGCAAGCC CATGAAG-3′。

1.3.3實(shí)時熒光定量PCR測定杜氏鹽藻MBP的mRNA表達(dá)量變化紫外分光光度計測定標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pcDNA-MBPN的吸光度值(OD)，按梯度稀釋制作標(biāo)準(zhǔn)品，按照1 μg 1 000 bp 的DNA為9.1×1011拷貝數(shù)計算各標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)[6]。分別以不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品為模板，進(jìn)行擴(kuò)增，以模板濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以Ct值(PCR擴(kuò)增達(dá)到閾值需要的循環(huán)數(shù))為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。將所有反轉(zhuǎn)錄的cDNA第一鏈通過測定OD值將初始濃度調(diào)至基本相同，同時以蒸餾水為模板做陰性對照，進(jìn)行實(shí)時定量PCR，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線推算在相同濃度cDNA中的MBP基因拷貝數(shù)，檢測MBP在不同生長時期轉(zhuǎn)錄水平上的差異。

1.3.4 MBP基因的全長及片段的真核表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)GenBank上登錄杜氏鹽藻MBP cDNA序列設(shè)計4條引物，全長上游引物L(fēng)F：5′-CGG GGT ACC ATG GTT CTC GTC TTG TTC GAG AC-3′，下游引物L(fēng)R：5′-CGG GAA TTC TTA ATG ATG ATG ATG ATG ATG GGA TCC ACG CTC AGC GGC CTT CTT CTT CTT-3′，C端上游引物：CF：5′CGG GGT ACC ATG CCC TAC GAC AAG ACC AAG C-3′，N端下游引物：NR：5′-CGG GAA TTC TTA ATG ATG ATG ATG ATG ATG GGA TCC ACG CGC GGG CTG CTC CTT GC-3′。劃線部分分別為引入的KpnⅠ、EcoRⅠ酶切位點(diǎn)及6個組氨酸(His)標(biāo)簽，其中KpnⅠ酶切位點(diǎn)符合Kozak序列，能增強(qiáng)外源基因表達(dá)，LF和LR，LF和NR，CF和LR分別構(gòu)成MBP，MBPN，MBPC的上下游引物。以已有的pEGFP-MBP質(zhì)粒為模版，進(jìn)行基因擴(kuò)增。將擴(kuò)增出的片段回收、純化，連接pMD18-T載體并獲得測序正確的克隆載體。以KpnⅠ、EcoRⅠ雙酶切目的基因片段，T4連接酶連接到用相同雙酶切的pcDNA3.1(+)載體上。構(gòu)建pcDNA-MBP、pcDNA-MBPN和pcDNA-MBPC載體，轉(zhuǎn)化JM109，提取質(zhì)粒酶切鑒定。

1.3.5篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株將2×105/mL CHO 細(xì)胞接種于6孔板中，含10%胎牛血清的F12/DMEM新鮮培養(yǎng)基，37℃、5% CO2過夜培養(yǎng)。按脂質(zhì)體Lipofectamine 2000說明書分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1、pcDNA-MBP、pcDNA-MBPN和pcDNA-MBPC載體，并篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株。先用終濃度為0. 8 g/ L G418進(jìn)行穩(wěn)定克隆的篩選，待陰性對照組細(xì)胞全部死亡后，細(xì)胞繼續(xù)加壓培養(yǎng)2 d，隨后將G418減少至0.4 g/ L，待細(xì)胞鋪滿達(dá)瓶底的50%時，將細(xì)胞進(jìn)行傳代，凍存，提取蛋白。

1.3.6 Western blotting檢測提取轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的細(xì)胞蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳之后，蛋白通過半干轉(zhuǎn)的方式轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，一抗為鼠抗組氨酸標(biāo)簽的抗體，山羊抗小鼠IgG為二抗進(jìn)行western blotting分析，并用β-actin作對照。

2 結(jié)果

2.1鹽藻細(xì)胞的生長曲線每天相同時間對鹽藻細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，當(dāng)細(xì)胞數(shù)不增加時停止計數(shù)，取3次計數(shù)平均值制作生長曲線(見圖1)。

圖1 杜氏鹽藻生長曲線

2.2實(shí)時熒光定量PCR測定杜氏鹽藻MBP的mRNA表達(dá)量變化分別以不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品為模板，擴(kuò)增后根據(jù)Ct值與拷貝數(shù)的對數(shù)作標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-2.172x+32.022 (R2=0.9958)。將所有反轉(zhuǎn)錄的cDNA第1鏈每組3個重復(fù)進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢測，最后得到不同Ct值由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程推導(dǎo)出的x值和拷貝數(shù)。結(jié)果表明杜氏鹽藻MBP的mRNA表達(dá)量在鹽藻生長初期表達(dá)量較低；鹽藻進(jìn)入對數(shù)生長期，MBP的mRNA表達(dá)量能迅速升高(約60倍)；到鹽藻生長平臺期時，表達(dá)量迅速降低(約8倍)。其中第7～12 天 MBP的mRNA的表達(dá)量與第1～6 、17及18天的mRNA表達(dá)量存在顯著性差異(P<0.01)(圖2)。

圖2 杜氏鹽藻MBP基因的表達(dá)

2.3 MBP基因的全長及片段的真核表達(dá)載體的鑒定PCR結(jié)果顯示，擴(kuò)增出的DNA特異條帶片段大小在1 600 bp、1 200 bp、400 bp，與預(yù)期結(jié)果相符(圖3)。雙酶切克隆載體上的目的片段和真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)，連接。對構(gòu)建的陽性表達(dá)載體用雙酶切及測序進(jìn)行鑒定(圖4)。

圖3 PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖4 雙酶切鑒定結(jié)果

2.4重組蛋白的Western blotting分析提取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的總蛋白，一抗為鼠抗組氨酸標(biāo)簽抗體，山羊抗小鼠IgG為二抗進(jìn)行western blotting分析，同時用β-actin作陽性對照。結(jié)果顯示含有6個組氨酸標(biāo)簽的融合蛋白已經(jīng)表達(dá)(圖5)。

圖5 Western blotting 結(jié)果

3 討論

在本研究中，鹽藻MBP的mRNA表達(dá)在靜止期表達(dá)較少，在隨后的對數(shù)生長期表達(dá)最高，生長停滯期又有所降低。這可能與MBP在細(xì)胞周期中參與染色體包裝和RNA的加工有關(guān)。而且這只是鹽藻MBP的mRNA的表達(dá)情況，其蛋白質(zhì)的表達(dá)情況還要在制備抗體后進(jìn)一步研究。通過比對發(fā)現(xiàn)杜氏鹽藻MBP同Nop5/Sik家族中其他成員一樣C端含有多個KKX基序，且其中有很多長于10個氨基酸殘基的共有模體。有研究表明，Nop家族中的組分如Nop1p和Nop5p(Nop58p)是小核仁核糖蛋白復(fù)合體(snoRNP)的組分[7]與RNA的剪切相關(guān)[8]。煙草中NtMARBP61屬于Nop58p類蛋白，在不同生長期蛋白積累也有變化[9]。

為了研究MBP體外結(jié)合能力以及進(jìn)一步研究其在鹽藻內(nèi)的功能作用機(jī)制，獲得真核表達(dá)的MBP及其有活性的部分是非常必要的。真核表達(dá)體系CHO細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞，在其細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的蛋白能被正確地折疊和修飾，易于獲得有活性的外源重組蛋白。在重組蛋白的C末端引入6個組氨酸的標(biāo)簽，除了因?yàn)镸BP沒有商品化的抗體，不利于在蛋白水平的檢測外，還有一個重要原因是為了方便下游目的蛋白的純化。本研究中構(gòu)建鹽藻MBP及其N端和C端部分的真核表達(dá)載體，并篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)化株，為隨后的蛋白純化和結(jié)合實(shí)驗(yàn)做好了準(zhǔn)備。

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