柳 東，高丙利，朱 振，李興林

(1. 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2. 中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院湖州現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新中心，湖州 313000)；3. 浙江東奇生物科技有限公司，湖州 313000)

傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥具有高殘留、易產(chǎn)生抗藥性、不易分解等特點(diǎn)，給人類(lèi)、社會(huì)、環(huán)境等帶來(lái)了嚴(yán)重危害．生物農(nóng)藥將成為解決這些問(wèn)題的主要途徑之一，其開(kāi)發(fā)和應(yīng)用的前景已逐步受到重視．

自從 l879年梅契尼柯夫最先從奧地利金龜子上分離到金龜子綠僵菌以來(lái)，該菌已有100多年的研究歷史．綠僵菌是一類(lèi)重要的生防真菌，可寄生于多種昆蟲(chóng)，在生產(chǎn)中已得到廣泛的應(yīng)用．據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全世界約有 200多種昆蟲(chóng)能被這種真菌感染致死[1]，該菌致病力強(qiáng)、效果好，對(duì)人、畜和農(nóng)作物無(wú)毒害，是當(dāng)前世界上研究應(yīng)用最多的蟲(chóng)生真菌之一．但另一方面，同細(xì)菌、病毒殺蟲(chóng)劑相似，金龜子綠僵菌也存在殺蟲(chóng)效果慢、受環(huán)境影響較大和效果不穩(wěn)定等缺點(diǎn)，因而在一定程度上限制了真菌殺蟲(chóng)劑的大規(guī)模應(yīng)用．

Kodaira[2]在1961年首次報(bào)道從綠僵菌中發(fā)現(xiàn)毒素 A、B．其后，一些結(jié)構(gòu)類(lèi)似物被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，但主要毒素還是DtxA、DtxB與DtxE，占培養(yǎng)物濾液毒素總量的 70%以上[3-5]．Wang Chengshu等[6]證明綠僵菌發(fā)酵液中毒素 DtxA、DtxB與 DtxE的含量與發(fā)酵液中碳氮比有關(guān)，各種毒素之間的含量也呈現(xiàn)出不同的相關(guān)性．本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保藏的 4株綠僵菌進(jìn)行殺蟲(chóng)效果的測(cè)試，發(fā)現(xiàn)其中1株在發(fā)酵液除去菌絲和孢子后仍具有較高的殺粘蟲(chóng)活性．本文對(duì)此株菌株的發(fā)酵液進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)試和高效液相色譜(HPLC)分析，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用該菌株及其代謝產(chǎn)物提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

綠僵菌(Metarhizium anisopliae)，由中國(guó)科學(xué)院上海植物生理生態(tài)研究所提供，中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院湖州現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新中心保藏．

1.1.2 供試蟲(chóng)源

東方粘蟲(chóng)(Mythimna separata)，由浙江化工研究院有限公司提供，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)用玉米葉連續(xù)飼養(yǎng)和傳代，飼養(yǎng)室溫為(25±1)℃，空氣濕度為70%～80%．

1.1.3 培養(yǎng)基(g/L)

培養(yǎng)基Ⅰ：蛋白胨 30，K2HPO41，MgSO40.5，KCl 0.5，F(xiàn)eSO40.01，pH 6.7，121,℃滅菌 20,min．

培養(yǎng)基Ⅱ：蛋白胨 30，K2HPO41，MgSO40.5，KCl 0.5，F(xiàn)eSO40.01，β–丙氨酸 0.1，pH 6.7，121,℃滅菌 20,min．

培養(yǎng)基Ⅲ：蔗糖30，蛋白胨5，NaNO32，K2HPO41，MgSO40.5，KCl 0.5，F(xiàn)eSO40.01，pH 6.7，121,℃滅菌 20,min．

培養(yǎng)基Ⅳ：蔗糖30，蛋白胨5，NaNO32，K2HPO41，MgSO40.5，KCl 0.5，F(xiàn)eSO40.01，β–丙氨酸 0.1，pH 6.7，121,℃滅菌 20,min．

1.1.4 主要試劑

高效氯氰菊酯(有效成分含量為 4.5%)，南京紅太陽(yáng)股份有限公司．

綠僵菌4種毒素標(biāo)樣，由中國(guó)科學(xué)院上海植物生理生態(tài)研究所提供．

1.2 培養(yǎng)方法

挑取 1環(huán)平板保存的菌種，接種于 50,mL發(fā)酵培養(yǎng)基中(250,mL三角瓶)，24,℃、110,r/min培養(yǎng)7,d．

1.3 發(fā)酵濾液的制備

將初篩的菌株Ma977在24,℃、pH 6.7的條件下發(fā)酵培養(yǎng) 7,d后，先用墊有 9,cm定性濾紙的布氏漏斗抽濾，去除培養(yǎng)基和凝結(jié)的菌絲體，再將發(fā)酵濾液收集，24,℃、10,000,r/min離心 10,min，取上清液，再過(guò) 0.22,μm 的濾膜，獲得不含有菌株 Ma977菌絲或孢子的發(fā)酵濾液．分別從菌株 Ma977固體平板上挑取菌絲，在顯微鏡下觀察形態(tài)；從處理后的發(fā)酵液中吸取樣品，在顯微鏡下檢測(cè)有無(wú)菌絲或孢子存在．

1.4 室內(nèi)毒力測(cè)定

采用“浸葉法”[7]測(cè)定微生物發(fā)酵液對(duì)粘蟲(chóng)的胃毒活性．根據(jù)初篩和復(fù)篩的不同要求，將經(jīng)過(guò)處理的發(fā)酵液配成一系列的濃度工作液，用于浸漬苗期玉米葉；每次浸漬 1片，3～5,s，每藥樣浸漬 9片，待藥液干后，放入直徑 10,cm 墊有濾紙的培養(yǎng)皿中，接入 3齡幼蟲(chóng) 10頭；陽(yáng)性對(duì)照用高效氯氰菊酯溶液浸漬的玉米葉飼喂幼蟲(chóng)，陰性對(duì)照用蒸餾水浸漬的玉米葉飼喂幼蟲(chóng)．在96,h檢查結(jié)果，以粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)絕對(duì)死亡為計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)，即觸之不動(dòng)者為死亡．初篩重復(fù) 3次，復(fù)篩重復(fù) 30次．同時(shí)設(shè)有陽(yáng)性對(duì)照(高效氯氰菊酯溶液)、陰性對(duì)照(蒸餾水)．

1.5 HPLC分析

HPLC 分析條件：色譜分離柱為 Agilent C18(5,μm，150,mm×4.6,mm)，流動(dòng)相為 V乙腈﹕V水＝60﹕40，流量 1.0,mL/min，柱溫 30,℃，進(jìn)樣量 10,μL，檢測(cè)波長(zhǎng)214,nm．

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：見(jiàn)參考文獻(xiàn)[8]．

樣品處理：取 1.0,mL發(fā)酵液 10,000,r/min離心5,min，取上清液，然后用 0.22,μm 微孔濾膜過(guò)濾，所得濾液取5,μL直接進(jìn)樣測(cè)定.

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵液滅殺粘蟲(chóng)活性的初步篩選

以實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的東方粘蟲(chóng)為靶標(biāo)，進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定．96,h后，“浸葉法”的測(cè)定結(jié)果表明，其中 1株綠僵菌的發(fā)酵液對(duì)粘蟲(chóng)致死率為 100%，而其余 3株綠僵菌的發(fā)酵液對(duì)粘蟲(chóng)的致死率為0%．

培養(yǎng) 96,h后的蟲(chóng)體形態(tài)如圖所示，圖 1(a)為陽(yáng)性對(duì)照的結(jié)果，試蟲(chóng)死亡(48,h內(nèi))，蟲(chóng)體干癟；圖1(b)為發(fā)酵原液的結(jié)果，試蟲(chóng)死亡(96,h內(nèi))，卷曲；圖1(c)為陰性對(duì)照的結(jié)果，試蟲(chóng)存活，個(gè)體肥大．

圖1 3種處理的粘蟲(chóng)形態(tài)Fig.1 Three kinds of the armyworm pattern tested

2.2 發(fā)酵濾液的分析

為進(jìn)一步驗(yàn)證此株綠僵菌對(duì)粘蟲(chóng)的致死效果，從發(fā)酵濾液、稀釋倍數(shù)、樣本數(shù)量等因素開(kāi)展復(fù)篩實(shí)驗(yàn)．分別在顯微鏡下觀察綠僵菌Ma977和其發(fā)酵濾液．菌株Ma977孢子和菌絲的鏡檢結(jié)果如圖2所示．

圖2 菌株Ma977孢子和菌絲Fig.2 Spores and mycelium of Ma977

圖2(a)為平板上培養(yǎng)的菌株Ma977直接制片在顯微鏡下觀察到的孢子形態(tài)，其大小一般為(4～6)μm×(2～3)μm；圖 2(b)為菌株 Ma977的菌絲形態(tài)．處理后的發(fā)酵液濾液在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)所制備的發(fā)酵液濾液不含有菌絲和孢子．

2.3 發(fā)酵濾液室內(nèi)毒力測(cè)試

制備菌株 Ma977發(fā)酵濾液的 1、2、4、8倍的稀釋液，設(shè)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，每個(gè)樣品設(shè)有 30個(gè)重復(fù)．

按照上述濃度梯度的工作液，挑選大小一致的 3齡幼蟲(chóng)進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定，以高效氯氰菊酯溶液為陽(yáng)性對(duì)照，蒸餾水為陰性對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)表1．

在96,h后，陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照對(duì)粘蟲(chóng)的致死率分別為 100%和 0.67%．發(fā)酵濾液原液對(duì)粘蟲(chóng)的致死率為100%，稀釋2倍后對(duì)粘蟲(chóng)的致死率為85.9%，表明該菌株除去菌絲和孢子的高濃度發(fā)酵濾液對(duì)粘蟲(chóng)具有明顯的殺蟲(chóng)效果，其發(fā)酵濾液原液的殺蟲(chóng)效果與陽(yáng)性對(duì)照一致；發(fā)酵濾液稀釋4倍后，對(duì)粘蟲(chóng)的致死率降至10%以下，殺蟲(chóng)效果明顯下降，表明發(fā)酵濾液有效成分的濃度與滅殺粘蟲(chóng)的效果有顯著的相關(guān)性．

表1 不同稀釋濃度的發(fā)酵濾液對(duì)粘蟲(chóng)的致死效果Tab.1 Lethal effect of different dilutions from the filtrate of the fermentation broth on Armyworm

2.4 發(fā)酵濾液殺蟲(chóng)活性成分分析

依據(jù)毒素 DtxE、DtxA、DtxB2和 DtxB的相關(guān)報(bào)道[6]，在 190～1,000,nm 范圍對(duì)其標(biāo)樣進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果表明，在214,nm處，這4種毒素均有較高的吸收峰．因此，HPLC分析發(fā)酵液濾液毒素成分將選用214,nm為其掃描波長(zhǎng)．

標(biāo)準(zhǔn)品的 HPLC 分析表明，在 4.082、8.111、11.857、17.178,min處出現(xiàn)相應(yīng)峰值(圖 3(a))，它們分別是毒素 DtxE、DtxA、DtxB2和 DtxB．Ma977菌株發(fā)酵濾液中的 HPLC結(jié)果見(jiàn)圖 3(b)．同標(biāo)準(zhǔn)樣相比，毒素DtxE、DtxA、DtxB2和DtxB均有出現(xiàn)，其峰的保留時(shí)間稍有降低，分別為3.987、7.842、11.423和16.484,min，與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間基本一致．由此表明，綠僵菌 Ma977的發(fā)酵液中存在毒素 DtxE、DtxA、DtxB2和DtxB．

經(jīng)過(guò)多次搖瓶發(fā)酵，將濾液測(cè)試分析后，發(fā)現(xiàn)毒素 B2的產(chǎn)生非常不穩(wěn)定，其有無(wú)和含量的高低對(duì)粘蟲(chóng)的致死沒(méi)有影響，產(chǎn)生作用效果的主要是毒素DtxE、DtxA、DtxB．

圖3 4種毒素標(biāo)準(zhǔn)品和發(fā)酵液的高效液相色譜圖Fig.3 HPLC results of 4 toxin standard samples and the filtrate of fermentation broth

2.5 菌株Ma977發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.5.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)毒素產(chǎn)生的影響

培養(yǎng)時(shí)間與菌株 Ma977毒素的產(chǎn)生有著直接的關(guān)系．隨著接入培養(yǎng)基中孢子的萌發(fā)、菌絲的正常生長(zhǎng)，毒素也隨著時(shí)間而逐漸產(chǎn)生與積累．

為了進(jìn)一步確定最佳發(fā)酵時(shí)間，進(jìn)行了時(shí)間對(duì)毒素產(chǎn)生的影響實(shí)驗(yàn)．等體積接種孢子懸液于 50,mL發(fā)酵培養(yǎng)基Ⅰ中(250,mL三角瓶)，于 24,℃、110,r/min振蕩培養(yǎng)，每天取樣進(jìn)行HPLC分析，其結(jié)果如圖4所示．

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)毒素產(chǎn)生的影響Fig.4 Effect of fermentation time on toxin production

由圖 4可知，發(fā)酵的前 5,d，毒素 DtxE、DtxA、DtxB均沒(méi)有產(chǎn)生，到第7天時(shí)，三種毒素的含量達(dá)到最大，所以發(fā)酵時(shí)間定7,d比較合適．

2.5.2 溫度對(duì)發(fā)酵液中毒素含量的影響

菌株Ma977的最適生長(zhǎng)溫度在24～26,℃之間，為了進(jìn)一步確定最佳發(fā)酵溫度，進(jìn)行了溫度對(duì)毒素產(chǎn)生的影響實(shí)驗(yàn)．在 21、24、27、30,℃時(shí)用培養(yǎng)基Ⅰ，110,r/min振蕩培養(yǎng)7,d，考察溫度對(duì)菌株Ma977產(chǎn)毒素的影響，其HPLC分析結(jié)果如圖5所示．

圖5 發(fā)酵溫度對(duì)毒素產(chǎn)生的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on toxin production

由圖 5可以看出，較低溫度時(shí)，毒素的產(chǎn)生明顯受到抑制，過(guò)高溫度對(duì)毒素的產(chǎn)生也有不利影響，菌株Ma977發(fā)酵溫度為27,℃時(shí)比較合適．

2.5.3 初始pH對(duì)發(fā)酵液中毒素含量的影響

為了進(jìn)一步確定最佳初始 pH，進(jìn)行了 pH對(duì)毒素產(chǎn)生的影響實(shí)驗(yàn)，用培養(yǎng)基Ⅰ，27,℃、110,r/min條件下振蕩培養(yǎng)7,d，其結(jié)果如圖6所示．

圖6 初始pH對(duì)發(fā)酵液中毒素含量的影響Fig.6 Effect of initial pH value on toxin content of fermentation broth

由圖6可知，當(dāng)pH為3和10時(shí)，發(fā)酵7,d后，菌株Ma977沒(méi)有任何毒素產(chǎn)生．當(dāng)pH為4時(shí)，發(fā)酵液中的毒素 DtxE、DtxA、DtxB產(chǎn)量達(dá)到最大．總體而言，酸性條件更有利于菌株Ma977產(chǎn)生毒素，最適初始pH定為4．

2.5.4 培養(yǎng)基組分對(duì)發(fā)酵液中毒素含量的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基不僅是供給菌體生長(zhǎng)繁殖所需的能源，而且也是構(gòu)成尿苷的物質(zhì)來(lái)源．要積累大量的毒素，就必須要有足夠的碳源和能源．β–丙氨酸是毒素合成的必需組分，且綠僵菌自身代謝不能合成，必須依靠外界攝?。诔跏?pH 為 4、27,℃、110,r/min條件下，分別在 4種培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，7,d后HPLC分析結(jié)果如圖7所示．

由圖 7可知，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基選為培養(yǎng)基Ⅳ時(shí)，即察氏培養(yǎng)基中添加β–丙氨酸，可以顯著提高毒素E和A的產(chǎn)量，并且毒素B的含量較高．因此，發(fā)酵培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基Ⅳ．此時(shí)，毒素DtxE、DtxA、DtxB的產(chǎn)量達(dá)到最大，分別為 244.08,mg/L、257.18,mg/L和38.51,mg/L．

圖7 培養(yǎng)基組分對(duì)發(fā)酵液中毒素含量的影響Fig.7 Effect of medium components on toxin content of fermentation broth

3 討 論

從實(shí)驗(yàn)室保藏的 4株綠僵菌中初步篩選出 1株具有殺粘蟲(chóng)活性的綠僵菌菌株 Ma977，除去其菌絲和孢子后，發(fā)酵濾液的原液對(duì)粘蟲(chóng)致死率可以達(dá)到100%，稀釋 2倍后，仍具有較強(qiáng)的殺蟲(chóng)活性．此項(xiàng)結(jié)果具有重要的應(yīng)用價(jià)值．

在國(guó)外，Wekesa 等[9]、Chandler 等[10]、Brooks等[11]、Kirkland等[12]進(jìn)行了綠僵菌和白僵菌的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果均顯示綠僵菌對(duì)葉螨的防治效果較好．Pirali-Kheirabadi等[13]、Alonso-Diaz 等[14]分別進(jìn)行了綠僵菌的感染實(shí)驗(yàn)，其對(duì)微小牛蜱(Boophilus microplus)和具環(huán)牛蜱(Rhipicephalusannulatus)的致死率均在90%以上．在國(guó)內(nèi)，許多學(xué)者對(duì)綠僵菌防治常見(jiàn)農(nóng)林害蟲(chóng)進(jìn)行研究，李增智等[15]、宋漳等[16]、葉斌等[17]進(jìn)行了綠僵菌對(duì)馬尾松毛蟲(chóng)的感染實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示綠僵菌的一些菌株對(duì)馬尾松毛蟲(chóng)具有毒力，且有一定的耐高溫和耐旱性．陳祝安等[18]、單樂(lè)天等[19]測(cè)定了不同來(lái)源綠僵菌對(duì)稻水象甲、云斑金龜蠐螬和桃蚜的毒力，篩選出了相應(yīng)的高致病力菌株．真菌殺蟲(chóng)劑劑型和相關(guān)應(yīng)用技術(shù)伴隨著蟲(chóng)生真菌的逐步深入研究而得到了很大的發(fā)展[20]．目前，已研制出的真菌殺蟲(chóng)劑的劑型主要有：顆粒劑、乳懸液、混合劑、油劑、粉劑、干菌絲、可濕性粉劑、微膠囊和無(wú)紡布菌條等劑型．國(guó)內(nèi)外研究開(kāi)發(fā)的綠僵菌制劑約 10余種，其中，影響最大且最成功的范例是英國(guó)CABI Bioscience蝗蟲(chóng)生物防治國(guó)際合作項(xiàng)目(LUBILOSA)研制的殺蝗綠僵菌生物農(nóng)藥，已在非洲注冊(cè)登記、投產(chǎn)，大面積用于沙漠蝗的防治，成為有效的蝗蟲(chóng)生防制劑．

借助接觸傳染和創(chuàng)傷傳染兩種方式，綠僵菌的孢子通過(guò)空氣、桑葉等媒體附著于蠶體表面后鉆入蠶體內(nèi)寄生，形成綠僵病，如不及時(shí)防治傳染很快，死亡率較高．因此，在中國(guó)養(yǎng)蠶業(yè)較為發(fā)達(dá)的長(zhǎng)江三角洲不適合使用傳統(tǒng)的綠僵菌產(chǎn)品．菌株 Ma977發(fā)酵液因不含有菌絲和孢子，對(duì)粘蟲(chóng)致死效果較好，可以用于養(yǎng)蠶地區(qū)的蟲(chóng)害防治，具有較好的應(yīng)用開(kāi)發(fā)前景．

本研究的后續(xù)工作將采用廉價(jià)的培養(yǎng)基原料，優(yōu)化此菌株的培養(yǎng)基及擴(kuò)大培養(yǎng)，以顯著提高有效毒素的含量，為該菌的商業(yè)化開(kāi)發(fā)提供基本參數(shù)．

［1］ 劉愛(ài)英. 中國(guó)蟲(chóng)生真菌研究與應(yīng)用[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科技出版社，l991：159–164.

［2］ Kodaira Y. Biochemical studies on the muscardine fungi in the silkworms，Bombyx mori[J]. Faculty of Textile Science and Technology，1961，5：1–68.

［3］ Loutelier C，Cherton J C，Lange C，et al. Studies on the dynamics of the production of destruxins by Metarhizium anisopliae：Direct high-performance liquid chromatographic and fast atom bombardment mass spectrometric analysis correlated with biological activity tests[J]. Journal of Chromatography A，1996，738(3)：181–189.

［4］ Pedras M S，Irina Z L，Ward D E. The destruxins：Synthesis，biosynthesis，biotransformation，and biological activity[J]. Phytochemistry，2002，59(6)：579–596.

［5］ Strasser H，Vey A，Butt T M. Are there any risks in using entomopathogenic fungi for pest control，with particular reference to the bioactive metabolites of Metarhizium，Tolypocladium and Beauveria species ? [J]. Biocontrol Science and Technology，2000，10(6)：717–735.

［6］ Wang Chengshu，Skrobek A，Butt T M. Investigations on the destruxin production of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae[J]. Journal of Invertebrate Pathology，2004，85(3)：168–174.

［7］ 張宗炳. 殺蟲(chóng)藥劑的毒力測(cè)定[M]. 北京：科學(xué)出版社，1988：18-19.

［8］ 陳立仁，蔣生祥. 高效液相色譜基礎(chǔ)與實(shí)踐[M]. 北京：科學(xué)出版社，2001：114–120.

［9］ Wekesa V W，Maniania N K，Knapp M，et al. Pathogenicity of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae to the tobacco spider Mite Tetranychus evansi[J]. Experimental & Applied Acarology，2005，36(1/2)：41–50.

［10］ Chandler D，Davidson G，Jacobson R J. Laboratory and glasshouse evaluation of entomopathogenic fengi against the two-spotted spider mite，Tetranychus urticae(Acari：Tetranychidae)，on tomato，Lycopersicon esculentum[J].Biocontrol Science and Technology，2005，15(1)：37–54.

［11］ Brooks A，Wall R. Horizontal transmission of fungal infection by Metarhizium anisopliae in parasitic Psoroptesmites(Acari：Psoroptidae)[J]. Biological Control，2005，34(1)：58–65.

［12］ Kirkland B H，Cho E M，Keyhani N O. Differential susceptibility of Amblyomma maculatum and Amblyomma americanum(Acari：Ixodidea)to the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae[J]. Biological Control，2004，31(3)：414–421.

［13］ Pirali-Kheirabadi K，Haddadzadeh H，Razzaghi-Abyaneh M，et al. Biological control of Rhipicephalus(Boophilus)annulatus by different strains of Metarhizium anisopliae，Beauveria bassiana and Lecanicillium psalliotae fungi[J]. Parasitology Research，2007，100(6)：1297–1302.

［14］ Alonso-Diaz M A，Garcia L，Galindo-Velasco E，et a1.Evaluation of Metarhizium anisopliae (Hyphomycetes)for the control of Boophilus microplus(Acari：Ixodidae)on naturally infested cattle in the Mexican tropics[J].Veterinary Parasitology，2007，147(3/4)：336–340.

［15］ 李增智，程雙龍，魯緒祥. 綠僵菌、黃僵菌對(duì)松毛蟲(chóng)的室內(nèi)殺蟲(chóng)及固體生產(chǎn)試驗(yàn)初報(bào)[J]. 安徽農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，1985(2)：85-90.

［16］ 宋漳，景云，蔡和謙，等. 應(yīng)用綠僵菌防治馬尾松毛蟲(chóng)初探[J]. 福建林學(xué)院學(xué)報(bào)，1997，17(2)：107–109.

［17］ 葉斌，江英成，林文清，等. 金龜子綠僵菌對(duì)馬尾松林節(jié)肢動(dòng)物群落多樣性的影響[J]. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，34(2)：239–243.

［18］ 陳祝安，黃基榮. 不同來(lái)源綠僵菌對(duì)云斑金龜蠐螬致病力評(píng)價(jià)[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，1997，24(2)：81–83.

［19］ 單樂(lè)天，馮明光. 不同寄主及地理來(lái)源的 16株綠僵菌對(duì)桃蚜的毒力比較[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，2006，46(4)：602–607.

［20］ 王濱，樊美珍，李增智. 真菌殺蟲(chóng)劑劑型的研究與應(yīng)用[J]. 農(nóng)藥快訊，2003，30(2)：19-20.