黃微薇

雞腸道中植物乳桿菌JX98所產(chǎn)細菌素的理化特性研究

黃微薇

從雞腸道內(nèi)容物中分離篩選出1株產(chǎn)細菌素的菌株，通過生理生化法和16S rRNA測序分析進行鑒定。采用牛津杯法對抗菌肽的抗菌譜進行研究，利用N－羥甲基甲基甘氨酸－SDS－PAGE電泳確定細菌素的相對分子質(zhì)量。

植物乳桿菌素;細菌素;理化特性

乳酸菌素是某些乳酸菌在代謝過程中通過核糖體合成機制產(chǎn)生的一類具有生物活性的蛋白質(zhì)、多肽或前體多肽，可以抑制食品中的致病菌和腐敗菌，包括蠟狀芽孢桿菌、肉毒梭狀芽孢桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、單核細胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌等，不僅可以改善腸道生態(tài)，而且是一類具有潛在開發(fā)能力的天然食品防腐劑和飼料添加劑。［1－2］而且與抗生素相比，細菌素是由安全的食品級微生物產(chǎn)生的，而且作為蛋白或多肽類物質(zhì)可以被腸道系統(tǒng)的水解蛋白酶分解，對腸道微生物菌群沒有不利影響。［3］

本文從雞腸道中分離篩選出1株產(chǎn)細菌素菌株，經(jīng)生理生化實驗和16S rRNA鑒定，該菌株為植物乳桿菌JX98，并研究該菌株所產(chǎn)植物乳桿菌素JX98－1的理化特性，為開發(fā)安全高效食品生物防腐劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料。

供試菌株:從雞腸道內(nèi)容物中分離產(chǎn)細菌素菌株1株，經(jīng)生理生化實驗和16S rRNA進行鑒定該菌株為植物乳桿菌JX98。將該菌株于MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

主要藥品:胰蛋白酶(Sigma)、胃蛋白酶(Sigma)、過氧化氫酶(Sigma)、淀粉酶(Sigma)、蛋白酶K(Sigma)

1.2 方法。

1.2.1 抑菌實驗。將待測植物乳桿菌JX98在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h，以2%的接種量接入MRS培養(yǎng)基中37℃恒溫培養(yǎng)24h，將發(fā)酵液在10000r/min離心5min，取上清液，將上清液的pH調(diào)為6，備用。

制作10mL含瓊脂2%的營養(yǎng)瓊脂平板。指示菌培養(yǎng)過夜，制備含0.8%瓊脂指示菌培養(yǎng)基，接種1mL指示菌，將10mL含有指示菌的軟瓊脂培養(yǎng)基傾倒在事先倒好的瓊脂培養(yǎng)基上，將預先滅菌的牛津杯放上，在牛津杯的空中加入100μL發(fā)酵上清液，在無菌操作臺中靜止1h，讓后放入恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)48h，測抑菌直徑(mm)。［4－6］

1.2.2 酶敏感實驗。在胰蛋白酶(Sigma)、胃蛋白酶(Sigma)、過氧化氫酶(Sigma)、淀粉酶(Sigma)、蛋白酶K(Sigma)的最適pH值下處理發(fā)酵上清液，各酶的終質(zhì)量濃度是1mg/mL，37℃水浴2h后，調(diào)回pH值6.0，采用打孔法做抑菌試驗。對照為未做處理的pH6.0的發(fā)酵上清液。［5，6］

1.2.3 穩(wěn)定性實驗。將植物乳桿菌JX在30℃、37℃和43℃添加下培養(yǎng)，并分別取上清液，將發(fā)酵上清液pH值分別調(diào)至 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 抑菌實驗，分別檢測菌活性AU/mL，指示菌為大腸桿菌。［7］

1.2.4 電泳法確定細菌素的相對分子量。采用硫酸銨沉淀法初步純化發(fā)酵上清液中的細菌素.將沉淀的細菌素重懸于10 mmol/L磷酸鹽緩沖液中。蛋白電泳采用兩層膠，即濃縮膠4%，分離膠16.5%。電泳結(jié)束后.將膠切成兩半，將帶有Marker的一半膠染色脫色，另一半用雙蒸水漂洗干凈后，小心地鋪在接有單核細胞增生李斯特菌的TSBYE固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12h，與染色的半塊膠對比，確定其相對分子質(zhì)量。［8］

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌素JX98－1的抑菌活性。

由表1可以看出，植物乳桿菌素JX98－1對大腸桿菌(Escherichia coli)、厭氧性鏈球菌(Streptococcus agalactiae)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)有很強的抑菌效果抑菌直徑在16～20mm。對干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)有一定的抑菌效果，抑菌直徑在6～9mm，對糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)和嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)抑菌效果不明顯。

表1 植物乳桿菌素JX98－1的抑菌譜和指示菌的培養(yǎng)條件Table1 Growth media and incubation temperatures of indicator strains，and inhibitory spectrum of plantaricin JX98－1

注:“+”表示抑菌直徑為6～9mm;“++”表示抑菌直徑為10～15mm;“+++”表示抑菌直徑為16～20mm;“－”表示抑菌直徑小于6mm。

2.2 酶敏感性實驗。

由圖1可知，發(fā)酵上清液用胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K處理后抑菌圈小于2mm，而用過氧化氫酶處理的發(fā)酵上清液和未做處理的發(fā)酵上清液做抑菌實驗，其抑菌圈直接為12mm，說明發(fā)酵上清液中存的抑菌物質(zhì)為蛋白類物質(zhì)細菌素，而非過氧化氫酶。發(fā)酵上清液用淀粉酶處理后抑菌圈直徑為8mm，抑菌直徑有所縮小，說明此細菌素的抑菌活性由糖基化修飾。

圖1 植物乳桿菌素JX－1對酶的敏感性實驗Fig.1 Effects of enzyme treatments on the antimicrobial activities of plantaricin JX98－1

2.3 細菌素相對分子質(zhì)量。

將初步純化的細菌素樣品，通過N－羥甲基甲基甘氨酸－SDS－PAGE電泳后，與Marker條帶對比，如圖3可知此細菌素的相對分子質(zhì)量約3.7ku。

圖3 植物乳桿菌素JX98－1的N－羥甲基甲基甘氨酸－SDS－PAGE電泳圖Fig.3 Tricine－SDS－PAGE of plantaricin JX98－1

3 結(jié)論

從雞腸道內(nèi)容物中分離并經(jīng)篩選、鑒定、抑菌試驗得到具有抑菌活性的植物乳桿菌1株，命名為JX98。對該菌株所產(chǎn)細菌素進行抑菌譜、酶敏感、溫度、pH實驗，發(fā)現(xiàn)該細菌素對大腸桿菌(Escherichia coli)、厭氧性鏈球菌(Streptococcus agalactiae)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)有很強的抑菌效果抑菌直徑在16～20mm。對干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)有一定的抑菌效果，抑菌直徑在6～9mm，對糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)和嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)抑菌效果不明顯。植物乳桿菌素JX98－1對胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K敏感，說明該細菌素有很強的蛋白質(zhì)性質(zhì)。植物乳桿菌素JX98－1在pH5～6，溫度37℃下有較高的活性，其活性范圍在8800－7800 AU/mL之間。植物乳桿菌素JX98－1的分子量為3.7ku。

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［3］周偉，李平蘭，周康，呂燕妮.溫度、pH及鹽對植物乳桿菌素L－1作用單核細胞增生李斯特氏菌的影響［J］.食品科學，2006，27(2):100－104.

［4］劉書亮，張艾青，田剛，蒲彪，胡欣潔.植物乳桿菌P158的生長曲線及其細菌素的特性［J］.核農(nóng)學報，2009，23(6):85－92.

［5］楊雪海，趙娜，魏金濤，李紹章.植物乳桿菌對致病性大腸桿菌的抑制效果研究［J］.飼料研究，2011(1):70－74.

［6］李景良，宋達峰.顧青植物乳桿菌ZJ316生產(chǎn)細菌素［J］.微生物學報，2008，48(6):187－192.

［7］李想，王然，程建軍，李琦，王鵬.植物乳桿菌培養(yǎng)基的優(yōu)化［J］.東北農(nóng)業(yè)大學學報，2008，39(9):201－204.

A Study on Characteristics of Lactobacillus Bacteriocin JX98 from Chicken Cecal

Huang Weiwei

One bacterial strains were isolated from chicken cecal contents and identified basing on physiological and biochemeical characteristics determination，and 16s rRNA sequencing analysis.Oxford cup test was applied to assay the antimicrobial spectrum.

lactobacillus;bacteriocin;physical and chemical properties

Q939.11+7

A

1672－6758(2012)02－0048－2

黃微薇，碩士，助教，雞西大學，黑龍江·雞西。郵政編碼:158100

Class No.:Q939.11+7Document Mark:A

(責任編輯:鄭英玲)