李悅瑋，張文琪，孫景輝，張科強(qiáng)

（1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院兒內(nèi)五科，吉林 長(zhǎng)春130021；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院心內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春130033；3.吉林大學(xué)第二醫(yī)院醫(yī)務(wù)部，吉林 長(zhǎng)春130041）

尼可地爾后處理對(duì)心肌缺血－再灌注損傷大鼠心肌的保護(hù)作用

李悅瑋1，張文琪2，孫景輝1，張科強(qiáng)3

（1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院兒內(nèi)五科，吉林 長(zhǎng)春130021；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院心內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春130033；3.吉林大學(xué)第二醫(yī)院醫(yī)務(wù)部，吉林 長(zhǎng)春130041）

目的：觀察尼可地爾后處理對(duì)心肌缺血－再灌注損傷 （MIRI）大鼠心肌的保護(hù)作用，并探討其作用機(jī)制。方法：26只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組 （8只）、鹽酸異丙腎上腺素 （ISO）組 （8只）和尼可地爾后處理組（10只）。對(duì)照組大鼠腹腔注射等量生理鹽水，ISO組大鼠腹腔注射ISO 5mg·kg－1，每隔24h重復(fù)注射1次，連續(xù)注射3d；尼可地爾后處理組于注射ISO 1h后尾靜脈注射尼可地爾 （1mg·kg－1），每日1次，連續(xù)3d。于第3次注射ISO后24h斷尾取血后處死，檢測(cè)各組大鼠血清中乳酸脫氫酶 （LDH）、磷酸激酸 （CK）活性；常規(guī)HE染色觀察各組大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)；免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)Caspase－3蛋白的表達(dá)；TUNEL法檢測(cè)各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果：尼可地爾后處理組與對(duì)照組比較血清LDH和CK活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05），但2組均低于ISO組 （P＜0.05）。HE染色，ISO組大鼠局部心肌組織變性壞死，伴有炎細(xì)胞浸潤(rùn)；尼可地爾后處理組大鼠壞死心肌細(xì)胞明顯減少，炎癥反應(yīng)輕微；對(duì)照組大鼠心肌無(wú)異常表現(xiàn)。免疫組織化學(xué)染色，ISO組大鼠大量心肌細(xì)胞胞漿表達(dá)Caspase－3，對(duì)照組和尼可地爾后處理組大鼠Caspase－3無(wú)表達(dá)。尼可地爾后處理組細(xì)胞凋亡指數(shù) （AI）較ISO組明顯降低 （P＜0.01）。結(jié)論：尼可地爾可減輕大鼠MIRI，其作用機(jī)制可能與抑制Caspase－3激活、減少細(xì)胞凋亡有關(guān)。

心肌缺血－再灌注損傷；尼可地爾；缺血后處理；藥物后處理；細(xì)胞凋亡

缺血性心臟病一直是引起患者心力衰竭和死亡的主要原因［1］。冠心病無(wú)論在發(fā)達(dá)國(guó)家還是發(fā)展中國(guó)家，已經(jīng)成為嚴(yán)重危害人類健康和致死的主要疾病之一［2］。盡管近年來(lái)血運(yùn)重建技術(shù) （溶栓、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)和冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)）已經(jīng)取得了很大進(jìn)展，但在缺血性心臟病再灌注治療中，如何保護(hù)缺血心肌免于心肌缺血－再灌注損傷（myocardial ischemia－reperfusion injury， MIRI）一直是研究熱點(diǎn)。缺血后處理 （ischemic postconditioning，IPO）和藥物后處理因適于臨床操作成為研究熱點(diǎn)。已有研究［3－4］表明：尼可地爾在臨床上作為治療心絞痛的藥物，對(duì)缺血－再灌注心肌有保護(hù)作用。但目前關(guān)于尼可地爾心肌MIRI的保護(hù)作用機(jī)制的研究較少。本研究利用大鼠心肌缺血模型，在分子和細(xì)胞水平上觀察尼可地爾藥物后處理對(duì)缺血－再灌注大鼠心肌的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、主要試劑及儀器 SD大鼠26只，雄性，體質(zhì)量180～200g，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng) （許可證號(hào)：SCXK－吉2008－0005）；尼可地爾購(gòu)自Sigma公司，鹽酸異丙腎上腺素 （ISO）購(gòu)自上海禾豐制藥廠，乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒、磷酸激酸 （CK）試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，Caspase－3購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司，TUNEL法檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Roche公司；GF－D 200型半自動(dòng)生化分析儀為山東高密彩虹分析儀器公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及模型制備 將26只SD大鼠隨機(jī)分為3組：對(duì)照組8只，鹽酸異丙腎上腺素（ISO）組8只，尼可地爾后處理組10只。對(duì)照組大鼠腹腔注射等量生理鹽水；ISO組大鼠給予腹腔注射ISO 5mg·kg－1，每隔24h重復(fù)注射1次，連續(xù)注射3d。尼可地爾后處理組大鼠于注射ISO 1h后尾靜脈注射 （1mg·kg－1），每日1次，連續(xù)3d。ISO組和尼可地爾后處理組于第3次注射ISO后24h處死，同時(shí)處死對(duì)照組大鼠。

1.3 大鼠血清樣本的制備 分別于處死大鼠前穿刺尾靜脈或斷尾獲取外周血1mL，3 000r·min－1離心5min，取上清，再于高速低溫離心機(jī)13 000r·min－1離心15min，取上清，－20℃凍存?zhèn)溆?。LDH 和CK活性檢測(cè)按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.4 大鼠心臟病理組織學(xué)檢測(cè)標(biāo)本的制備 第3次注射后24h處死各組大鼠，消毒后取出大鼠心臟，放入PBS中沖洗，10%甲醛溶液固定；常規(guī)石蠟包埋，4μm連續(xù)切片，行HE和免疫組織化學(xué)染色 （SP法）。TUNEL法具體步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。標(biāo)記前用DNA酶處理切片作為陽(yáng)性對(duì)照，用標(biāo)記液代替TUNEL反應(yīng)液作為陰性對(duì)照。在400倍光鏡下觀察心肌細(xì)胞凋亡情況，隨機(jī)選取10個(gè)視野，以心肌細(xì)胞凋亡數(shù)占總心肌細(xì)胞數(shù)的百分比計(jì)算心肌細(xì)胞凋亡指數(shù) （AI）。

1.5 AI結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) Caspase－3以心肌細(xì)胞胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒，其著色強(qiáng)度高于背景染色者判定為陽(yáng)性，否則為陰性。TUNEL法以胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性，否則為陰性。結(jié)果判定由2名觀察者獨(dú)立完成，若判定結(jié)果不一致，則2人在共覽顯微鏡下共同觀察判定。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 11.0軟件處理數(shù)據(jù)。各組大鼠血清CK和LDH活性以±s表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清CK和LDH活性 LDH檢測(cè)，ISO組大鼠血清LDH活性高于對(duì)照組 （P＜0.05），尼可地爾后處理組血清LDH活性明顯低于ISO組 （P＜0.05）；CK檢測(cè)，ISO組大鼠血清CK活性高于對(duì)照組 （P＜0.05），尼可地爾后處理組明顯低于ISO組 （P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清CK和LDH活性Tab.1 The activities of serum CK and LDH of rats in various groups （±s）

表1 各組大鼠血清CK和LDH活性Tab.1 The activities of serum CK and LDH of rats in various groups （±s）

＊P＜0.05compared with control group；△P＜0.05compared with ISO group.

Group n CK［λB／（mU·L－1）］LDH［λB／（U·L－1）］Control 8 44.71±3.83 4 297.70±599.95 ISO 8 61.26±7.69＊ 6 992.37±828.58＊Nicorandil postconditioning 10 47.12±5.09△ 4 700.23±812.67△

2.2 各組大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn) HE染色，ISO組大鼠心內(nèi)膜內(nèi)皮不完整，在心肌細(xì)胞間可見(jiàn)小血管擴(kuò)張及少量紅細(xì)胞滲出，部分心肌細(xì)胞腫脹、變性壞死，心肌組織內(nèi)血管擴(kuò)張、炎細(xì)胞滲出、浸潤(rùn)和其包繞血管形成的血管周圍炎；尼可地爾后處理組大鼠心肌橫紋清晰，核居中，無(wú)明顯組織壞死、血管擴(kuò)張和炎細(xì)胞浸潤(rùn)輕微。見(jiàn)圖1（插頁(yè)四）。

2.3 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況 TUNEL法檢測(cè)，ISO組大鼠可見(jiàn)大量的凋亡細(xì)胞，凋亡陽(yáng)性的細(xì)胞核呈棕黃色。尼可地爾后處理組大鼠凋亡細(xì)胞明顯減少。對(duì)照組、ISO組、尼可地爾后處理組大鼠的AI分別為 （0.66±0.35）%、（22.38±3.65）%和 （7.57±1.84）%。尼可地爾后處理組的 AI明顯低于ISO組 （P＜0.01）。見(jiàn)圖2 （插頁(yè)四）。

2.4 各組大鼠心肌組織中Caspase－3的表達(dá) 對(duì)照組和尼可地爾后處理組大鼠心肌細(xì)胞中無(wú)陽(yáng)性物質(zhì)；ISO組注射ISO后3d大鼠心肌細(xì)胞胞漿可見(jiàn)大量棕黃色顆粒。見(jiàn)圖3（插頁(yè)四）。

3 討 論

2003年，Zhao等［5］首先提出IPO的概念，即于缺血后持續(xù)再灌注前給予多次短暫重復(fù)缺血－再灌注，能提高心肌對(duì)缺血－再灌注損傷的耐受性。為缺血性心臟病的治療開(kāi)辟了新途徑。通常情況下，心肌細(xì)胞線粒體鉀通道處于關(guān)閉狀態(tài)，但能被鉀離子開(kāi)放劑激活，參與保護(hù)缺血后的心?。?］。鉀離子通道開(kāi)放劑通過(guò)促進(jìn)線粒體基質(zhì)中鉀的攝入，形成穩(wěn)定的鉀離子流，從而抑制鈣超載［7］。鈣超載可引起線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放 ，許多大分子非選擇性地由胞漿向線粒體擴(kuò)散，導(dǎo)致線粒體電位破壞和功能障礙，使能量代謝發(fā)生障礙，引起心肌細(xì)胞死亡。在缺血預(yù)處理的研究［8－10］中，鉀離子通道開(kāi)放劑尼可地爾能夠保護(hù)缺血性損傷的心肌。尼可地爾通過(guò)開(kāi)放心肌細(xì)胞線粒體鉀離子通道，保護(hù)線粒體，減輕MIRI，減少心肌細(xì)胞壞死或凋亡，從而保護(hù)心肌。本研究以保護(hù)線粒體為切入點(diǎn)，旨在為臨床心肌缺血缺氧的對(duì)癥治療提供新思路。

本實(shí)驗(yàn)利用ISO腹腔注射制作心肌缺血性損傷模型，并觀察尼可地爾后處理對(duì)缺血心肌的保護(hù)作用。大劑量ISO導(dǎo)致心臟β1受體過(guò)度興奮，心率加快，心肌收縮力增加，心肌耗氧增加；β2受體興奮，擴(kuò)張外周血管，降低外周血管阻力，血壓降低，特別是舒張壓降低，減少冠狀動(dòng)脈供血，結(jié)果使心肌缺血缺氧［10－12］。血清酶學(xué)變化是心肌損害程度的主要標(biāo)志，本研究結(jié)果顯示：連續(xù)大劑量給予ISO后大鼠血清CK、LDH活性增高，表明該方法能夠完全模擬心肌損傷的病理生理過(guò)程，復(fù)制心肌損傷的模型。尼可地爾后處理能夠減輕ISO對(duì)心肌的缺血性損傷。心肌病理學(xué)檢查是心肌缺血損害程度的直接證據(jù)。大劑量ISO注射后，HE染色顯示：心肌細(xì)胞發(fā)生變性壞死，伴有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)；免疫組織化學(xué)染色見(jiàn)大量心肌細(xì)胞表達(dá)Caspase－3；TUNEL染色見(jiàn)大量心肌細(xì)胞凋亡。尼可地爾后處理組大鼠HE染色示心肌細(xì)胞無(wú)明顯變性、壞死，炎細(xì)胞浸潤(rùn)輕微；Caspase－3免疫組織化學(xué)染色顯示：少量大鼠心肌細(xì)胞表達(dá)Caspase－3；并見(jiàn)少量凋亡的心肌細(xì)胞。這些結(jié)果說(shuō)明心肌缺血影響線粒體功能，導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝障礙，激活Caspase－3細(xì)胞凋亡途徑，引起心肌細(xì)胞發(fā)生不可逆性損傷甚至壞死。

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Protective effect of nicorandil postconditioning on myocardium of rats with myocardial ischemia－reperfusion injury

LI Yue－wei1，ZHANG Wen－qi2，SUN Jing－h(huán)ui1，ZHANG Ke－qiang3
（1.Department of Pediatrics，F(xiàn)irst Hospital，Jilin University，Changchun 130021，China；2.Department of Cardiology，China－Japan Union Hospital，Jilin University，Changchun 130033，China；3.Department of Medical Adminisitration，Second Hospital，Jilin University，Changchun 130041，China）

ObjectiveTo explore the protective effect of nicorandil postconditioning on myocardium of rats with myocardial ischemia－reperfusion injury （MIRI）in rats and to discuss its mechanism.Methods26SD rats were divided into control group （n＝8），isoproterenol（ISO）group （n＝8）and nicorandil postconditioning group （n＝10）.The rats in ISO group were injected intraperitoneally with isoproterenol（5mg·kg－1）at an interval of 24h for 3d；the rats in control group only

an injection of same amount of saline；the rats in nicorandil postconditioning group were injected intravenously with nicorandil（1mg·kg－1）1hafter ISO injection once a day，lasting for 3d.The rats were killed 24hafter the third injection of ISO.The activities of serum creatine kinase（CK）and lactate dehydrogenase（LDH）of rats in various groups were detected；the histopathological changes of myocardium of rats in various groups were observed by routine HE staining；the expressions of Caspase－3protein were determined by immunohistochemistry；the apoptosis of cardiocytes of rats in various groups was analyzed by TUNEL staining.ResultsThere were no significant differences in the activites of serum CK and LDH between nicorandil postconditioning group and control group （P＞0.05），but the activities of CK and LDH in control and nicorandil postconditioning groups were lower than those in ISO group（P＜0.05）.The HE staining results showed local degeneration，necrosis and inflammation in ISO group，but slightly necrosis and inflammation in nicorandil postconditioning group and no pathological changes in control group.Immunohistochemistry staining showed that Caspase－3was positive in cardiocyte plasma in ISO group；however，there were no Caspase－3expression in control and nicorandil postconditioning groups.The apoptosis index （AI）in nicorandil postconditioning group was significantly decreased compared with ISO group （P＜0.01）.ConclusionNicorandil can attenuate MIRI of rats，and its mechanism may be related to inhibiting Caspase－3pathway and decreasing the cardiocyte apoptosis.

myocardial ischemia－reperfusion injury；nicorandil；postconditioning；pharmacological conditioning；apoptosis

R542.2

A

1671－587Ⅹ（2012）06－1160－04

2012－06－13

吉林省衛(wèi)生廳科研基金資助課題 （2009z004）

李悅瑋 （1975－），女，吉林省長(zhǎng)春市人，講師，在讀醫(yī)學(xué)博士，主要從事心血管疾病的基礎(chǔ)和臨床研究。

張科強(qiáng) （Tel：0431－88796754，E－mail：zhangkeqiang＠yahoo.com.cn）