朱文赫，張 巍，李 妍，徐俊杰，姜艷霞，羅 軍，蘆曉晶，呂士杰

（吉林醫(yī)藥學院生物化學與分子生物學教研室，吉林 吉林132013）

微波輻射對人宮頸癌HeLa細胞的增殖抑制作用及其機制

朱文赫，張 巍，李 妍，徐俊杰，姜艷霞，羅 軍，蘆曉晶，呂士杰

（吉林醫(yī)藥學院生物化學與分子生物學教研室，吉林 吉林132013）

目的 ：探討不同強度微波輻射對人宮頸癌HeLa細胞的增殖抑制作用及對氧化應激水平的影響，闡明微波輻射對人宮頸癌 HeLa細胞的增殖抑制作用機制。方法：分別以強度為2.5、5.0、10.0、15.0和20.0mW·cm－2的微波處理HeLa細胞20min作為不同劑量輻射組，同時設立假輻射組 （0mW·cm－2）作為對照組，采用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)改變；MTT法檢測微波輻射對細胞增殖的抑制情況；試劑盒測定輻射后細胞超氧化物歧化酶 （SOD）活性和丙二醛 （MDA）含量；Western blotting法檢測細胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子－κB（NF－κB）和熱休克蛋白70（HSP 70）表達水平。結(jié)果：各劑量微波輻射組HeLa細胞數(shù)量明顯減少，細胞皺縮變形，體積縮小，隨著輻射強度的增加變化愈明顯；2.5、5.0、10.0、15.0和20.0mW·cm－2強度的微波作用細胞24h，HeLa細胞的增殖抑制率均明顯高于對照組 （P＜0.05）；微波輻射后細胞內(nèi)MDA含量隨著輻射強度的增加，與對照組細胞比較呈上升趨勢，各劑量輻射組HeLa細胞SOD活性較對照組顯著下降 （P＜0.05）。Western blotting檢測，微波輻射后細胞內(nèi)HSP 70表達水平呈增加趨勢，而NF－κB蛋白的表達水平呈明顯的下降趨勢。結(jié)論：微波輻射對人宮頸癌HeLa細胞增殖具有抑制作用，其可能機制是改變細胞內(nèi)氧化及抗氧化平衡。

微波輻射；人宮頸癌細胞；增殖抑制作用；超氧化物歧化酶；丙二醛

微波是一種頻率為300MHz～300GHz的電磁波。隨著現(xiàn)代電磁技術(shù)的發(fā)展，微波被廣泛應用于醫(yī)藥衛(wèi)生、軍事、通訊、工業(yè)生產(chǎn)和日常生活等領(lǐng)域，對微波的生物學效應研究也日益受到重視［1］。早在 20 世 紀 70 年 代， Webb 等［2－3］對 人 正常細胞和癌細胞的微波頻譜進行研究發(fā)現(xiàn)：正常細胞和癌細胞的吸收頻譜有差異。微波能通過熱效應和非熱效應選擇性地殺傷腫瘤細胞，引起細胞形態(tài)學和功能學改變，導致細胞壞死或者誘導凋亡。由于微波所具有的特性使其作為一種輔助治療腫瘤的手段應用于臨床，微波技術(shù)結(jié)合放療、化療等手段，可明顯提高局部腫瘤的治療效果和患者的生存率，在許多惡性腫瘤的治療中有一定效果，但是目前就微波的生物學效應的機制研究仍有許多爭論［4］。本實驗以人宮頸癌HeLa細胞為研究對象，觀察不同強度微波輻射對細胞增殖抑制率及氧化應激水平的影響，初步探討微波對人宮頸癌細胞作用的機制，為微波在臨床治療上的應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑及儀器 人宮頸癌HeLa細胞由吉林醫(yī)藥學院生物化學教研室保存；小牛血清購于杭州四季青公司，RPMI－1640培養(yǎng)液購于美國Gibco公司，超氧化物歧化酶 （superoxide dismutase，SOD）、丙 二 醛 （malondialdehyde，MDA）購于南京建成生物工程研究所，HSP70抗體購于Sigma公司，NF－κB購于Epitomics公司，BCA （bicinchoninic acid）蛋白含量測定試劑盒購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所，其他試劑均為國產(chǎn)分析純；550酶標儀購于美國 Bio－rad公司，MY8C－1型微波功率源購自南京匯研微波系統(tǒng)工程有限公司 （頻率為2 450MHz）。

1.2 細胞培養(yǎng)和形態(tài)學觀察 將人宮頸癌HeLa細胞培養(yǎng)于含10%小牛血清、100U·mL－1青霉素和100μg鏈霉素的RPMI－1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2d更換培養(yǎng)液1次，待細胞長滿至培養(yǎng)瓶底，以0.25%胰酶消化傳代。取對數(shù)生長期細胞進行實驗，調(diào)整細胞密度為1×105mL－1，接種于60mm培養(yǎng)皿內(nèi)，24h后分別采用不同強度的2 450MHz微波輻射20min，繼續(xù)培養(yǎng)24h，顯微鏡下觀察，拍攝。

1.3 MTT法檢測HeLa細胞增殖抑制率 將培養(yǎng)的HeLa細胞按1×105mL－1接種于96孔板，細胞分成對照組和各劑量輻照組，每組設5個復孔。培養(yǎng)24h后，各劑量輻照組分別以2.5、5.0、10.0、15.0和20.0mW·cm－2強度的微波進行輻射，輻射時間為20min，繼續(xù)培養(yǎng)，輻照24h后，棄掉培養(yǎng)液，每孔加入200μL新配制的0.5g·mL－1MTT溶液，37℃孵育4h，小心吸棄孔內(nèi)液體，每孔再加入二甲基亞楓 （DMSO）150μL，振蕩10min，在酶標儀選擇490nm波長檢測各孔吸光度 （A）值，按公式計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率 ＝ （1－實驗組A值／對照組A值）×100%。

1.4 HeLa細胞內(nèi)MDA和SOD活性的測定 取對數(shù)生長期HeLa細胞接種于培養(yǎng)皿，培養(yǎng)24h，經(jīng)不同強度微波輻射后24h，消化離心收集細胞，用預冷的PBS洗滌，0.5mL PBS重懸細胞。立即在4℃超聲下破碎細胞，10 000r·min－1離心15min，取上清，采用BCA蛋白含量測定試劑盒測定蛋白含量，按照試劑盒說明操作，以550nm波長測定HeLa細胞SOD活性，在532nm波長處測HeLa細胞MDA水平，每個樣本均作3個平行管。

1.5 Western blotting法檢測HeLa細胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子－κB （NF－κB）和熱休克蛋白70 （HSP70）的表達量 微波輻射后，取各組HeLa細胞，0.25%胰酶消化，離心收集細胞，1 000r·min－1離心10min，以PBS洗2次，用PIPA細胞裂解液于冰浴裂解，12 000r·min－1離心5min，收集上清。經(jīng)BCA法進行蛋白定量后，取等量樣品以12%SDS－PAGE進行電泳。電泳后將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉1h后，加入兔抗人NF－κB和HSP70抗體 （1∶100）孵育過夜，再以辣根過氧化酶標記的二抗封閉液孵育1h，用ECL顯影，凝膠成像系統(tǒng)處理結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理。HeLa細胞增殖抑制率、MDA和SOD檢測結(jié)果均以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 微波輻射后HeLa細胞增殖抑制率和細胞形態(tài) 經(jīng)2.5、5.0、10.0、15.0和20.0mW·cm－2微波輻射HeLa細胞24h后，顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化。對照組HeLa細胞生長狀態(tài)良好，細胞鋪展貼壁生長，增殖較快，伸展透亮，細胞之間排列緊密，呈不規(guī)則對角形，細胞觸角較短，輪廓清晰。經(jīng)微波輻射后細胞生長緩慢，細胞數(shù)量明顯減少，細胞皺縮變形，體積縮小，隨著輻射強度的增加細胞形態(tài)變化也愈明顯。2.5mW·cm－2的微波輻射10min，HeLa細胞增殖即表現(xiàn)出抑制，微波輻射強度增加時，細胞增殖抑制顯著增加，呈劑量依賴性。見圖1（插頁四）和表1。

表1 不同強度微波輻射后HeLa細胞增殖抑制率Tab.1 The inhibitory rates of proliferation of HeLa cells after radiated with different intensities of microwave （n＝5，±s，η／%）

表1 不同強度微波輻射后HeLa細胞增殖抑制率Tab.1 The inhibitory rates of proliferation of HeLa cells after radiated with different intensities of microwave （n＝5，±s，η／%）

＊ P＜0.05compared with control group.

Group Inhibitoryrate Control 0.17±0.09 Radiation 2.5mW·cm－2 10.12±0.98＊5.0mW·cm－2 16.12±0.42＊10.0mW·cm－2 27.44±0.57＊15.0mW·cm－2 59.28±1.29＊20.0mW·cm－2 84.86±1.74＊

2.2 微波輻射后 HeLa細胞MDA水平和SOD活性 隨著微波輻射強度的增高，各輻射組HeLa細胞內(nèi)MDA水平較對照組呈上升趨勢，5.0mW·cm－2輻射組與對照組比較水平略升高；而10.0、15.0和20.0mW·cm－2輻射組的 MDA水平明顯升高，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05）。微波輻射組HeLa細胞中的SOD活性均下降，2.5、5.0、10.0、15.0和20.0mW·cm－2輻射組HeLa細胞的SOD活性下降，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05）。見表2。

2.3 HeLa細胞內(nèi)NF－κB和HSP70的表達水平Western blotting檢測，隨著微波輻射強度的增加，HSP70蛋白的表達水平逐漸升高，而NF－κB蛋白表達水平隨著微波輻射強度的增加呈下降趨勢。見圖2。

表2 不同強度微波輻射后HeLa細胞SOD活性和MDA水平Tab.2 The MDA levels and SOD activities of HeLa cells after radiated with different intensities of microwave ［±s，λB／（U·mL－1）］

表2 不同強度微波輻射后HeLa細胞SOD活性和MDA水平Tab.2 The MDA levels and SOD activities of HeLa cells after radiated with different intensities of microwave ［±s，λB／（U·mL－1）］

＊ P＜0.05compared with control group.

Group SOD MDA Control 68.00±0.20 1.28±0.03 Radiation 2.5mW·cm－2 65.98±0.89＊ 1.29±0.07 5.0mW·cm－2 50.96±0.20＊ 1.32±0.02 10.0mW·cm－2 41.73±1.43＊ 2.00±0.02＊15.0mW·cm－2 38.23±2.21＊ 2.23±0.04＊20.0mW·cm－2 31.00±4.68＊ 2.58±0.03＊

圖2 不同強度微波輻射后HeLa細胞內(nèi)HSP 70和NF－κB蛋白表達電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expressions of HSP 70and NF－κB protein after radiated with different intensities of microwaveLane 1：Control group；Lane 2－4：5.0，10.0，and 20.0mW·cm－2 radiation groups.

3 討 論

氧化應激是指外源或內(nèi)源性活性氧 （reactive oxygen species，ROS）超過細胞的抗氧化能力而對細胞信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)產(chǎn)生全面的影響［5］?；钚匝醮乇徽J為是多種調(diào)節(jié)細胞生存和細胞死亡途徑的信號分子。目前有研究［6］顯示：在癌變和抑癌過程中活性氧與自由基發(fā)揮著重要的作用。SOD是清除氧自由基最重要的酶之一，其活性反映了機體清除氧自由基的能力?；钚匝踝杂苫梢鹬|(zhì)過氧化反應，損傷細胞膜，進而導致細胞死亡，其終產(chǎn)物MDA的含量亦間接反映了機體細胞被自由基損傷的程度［7］。微波輻射能夠通過影響生物體的氧化應激水平導致氧化和抗氧化系統(tǒng)失調(diào)，使細胞受損［8－9］。微波對氧化應激的影響提示微波輻射可以進行合理的臨床應用。

本研究結(jié)果表明：微波輻射對HeLa細胞的增殖具有抑制作用，隨著微波輻射強度的增高，微波對HeLa細胞的增殖抑制率也愈大，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。輻射后HeLa細胞的形態(tài)也發(fā)生明顯的改變，表現(xiàn)細胞數(shù)量明顯減少，細胞皺縮變形，胞核和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)不清的形態(tài)。微波輻射HeLa細胞后，通過測定MDA和SOD的活性變化可以反映氧自由基的損失情況。本實驗結(jié)果表明：經(jīng)2.5、5.0、10.0、15.0和20.0mW·cm－2微波輻射后細胞內(nèi)SOD活性下降，而MDA水平明顯增高。說明經(jīng)微波輻射后，機體的脂質(zhì)過氧化反應也逐漸加重，SOD消耗過多。MDA活性升高則是由于細胞損傷促進了氧自由基的產(chǎn)生。

HSPs也稱應激蛋白，是一類結(jié)構(gòu)上高度保守的蛋白，對氧自由基引起的細胞損害具有保護自由作用。經(jīng)不同強度微波輻射后，細胞內(nèi)HSP70的表達量發(fā)生改變，隨著輻射強度的提高，HSP70蛋白表達明顯上調(diào)［10－11］。NF－κB是一種多效性的轉(zhuǎn)錄因子，與細胞增生、轉(zhuǎn)化和凋亡等重要的病理生理過程密切相關(guān)［12］。NF－κB是應激與炎癥反應的中樞調(diào)節(jié)，與抑制性蛋白 （IκB）結(jié)合呈非活性狀態(tài)。氧自由基可引起轉(zhuǎn)錄因子激活物NF－κB和IκB的解離，激活NF－κB。本實驗結(jié)果表明：隨著微波輻射強度的增加，細胞內(nèi)NF－κB的表達水平呈下降趨勢。

綜上所述，2 450MHz微波輻射對HeLa細胞增殖具有明顯的抑制作用，其機制可能是使細胞內(nèi)氧化及抗氧化的平衡失調(diào)。微波輻射可導致細胞內(nèi)MDA含量升高而SOD活性降低，同時使細胞內(nèi)應激蛋白HSP70及NF－κB的表達水平發(fā)生改變。

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Inhibitory effect of microwave radiation on proliferation of human cervical carcinoma HeLa cells and its mechanism

ZHU Wen－h(huán)e，ZHANG Wei，LI Yan，XU Jun－jie，JIANG Yan－xia，LUO Jun，LU Xiao－jing，LV Shi－jie
（Department of Biochemistry and Molecular Biology，Jilin Medical College，Jilin 132013，China）

ObjectiveTo investigate the inhibitory effect of microwave radiation on proliferation of human cervical carcinoma HeLa cells and to clarify the mechanism of inhibitory effect of microwave radiation on proliferation of HeLa cells.MethodsThe HeLa cells were radiated by different intensities （2.5，5.0，10.0，15.0and 20.0mW·cm－2）microwave for 20min，and control group （0mW·cm－2）was set up.The morphological changes of HeLa cells were observed by microscope；the proliferation capacity was measured by MTT assay；the MDA levels and SOD activities were detected；the expression levels of HSP70and NF－κB protein after radiated with microwave were detected by Western blotting method.ResultsIn different doses of microwave radiation groups，the number of HeLa cells was decreased significantly，the cells shrank and were abnormal in shape，the cell volume was reduced.After 2.5，5.0，10.0，15.0，and 20.0mW·cm－2radiation for 24h，the inhibitory rates of proliferation of HeLa cells were significantly higher than that in control group（P＜0.05）；the MDA levels were increased with the increasing of the radiation dose compared with control group，and the SOD activities were decreased compared with control group （P＜0.05）.The results of Western blotting showed that the expression of HSP70was increased and the expression of NF－κB was decreased significantly in different doses of radiation groups.ConclusionMicrowave radiation can inhibit the proliferation of HeLa cells，and the mechanism may be related to changing intracellular oxidation and antioxidant balance.

microwave radiation；human cervical carcinoma；superoxide dismutase；malondialdehyde

R737.33

A

1671－587Ⅹ（2012）06－1156－04

2012－06－13

吉林省科技廳科技發(fā)展計劃項目資助課題 （20120941）；吉林醫(yī)藥學院大學生科研基金資助課題 （吉醫(yī)科字［2011］12號）

朱文赫 （1984－），男，黑龍江省哈爾濱市人，講師，醫(yī)學博士，主要從事生物技術(shù)制藥的研究。

呂士杰 （Tel：0432－64560460，E－mail：lvshijie－qr＠163.com）