劉春靜， 王昌祿， 李風(fēng)娟， 陳勉華， 王玉榮， 李貞景， 王志芳

(1.天津科技大學(xué)理學(xué)院，天津 300457;2.天津科技大學(xué)食品營養(yǎng)與安全教育部重點實驗室/食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457)

鏈霉菌TD-1代謝產(chǎn)物對飼料中污染霉菌的抑制作用及穩(wěn)定性

劉春靜1， 王昌祿2， 李風(fēng)娟2， 陳勉華2， 王玉榮2， 李貞景2， 王志芳2

(1.天津科技大學(xué)理學(xué)院，天津 300457;2.天津科技大學(xué)食品營養(yǎng)與安全教育部重點實驗室/食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457)

采用對峙培養(yǎng)法，檢測分離于土壤中的鏈霉菌TD-1代謝產(chǎn)物對飼料中污染霉菌構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)、純綠青霉(Penicillium verrucosum)、赭曲霉(Aspergillus ochraceus)、黃曲霉(Aspergillus flavus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、茄腐鐮刀菌(Fusarium solani)、桔青霉(Penicillum citrinum)、串珠鐮刀菌(Fusarium moniliforme)的抑菌活性，結(jié)果表明:TD-1菌株代謝產(chǎn)物對以上霉菌具有較強(qiáng)的抑制作用，抑菌帶寬度為10 mm左右．通過TD-1菌株的代謝過程曲線發(fā)現(xiàn)，該菌株發(fā)酵至第6 d抑菌率達(dá)90%左右．穩(wěn)定性試驗結(jié)果顯示:該菌株所產(chǎn)生的活性物質(zhì)具有較好的耐熱性、耐酸堿性、抗紫外輻射能力．

鏈霉菌;抑菌;污染霉菌;穩(wěn)定性

隨著我國飼料工業(yè)的迅猛發(fā)展，霉菌對飼料行業(yè)造成的損失已引起人們的高度重視．根據(jù)聯(lián)合國糧食組織估算，目前世界上至少有25%的谷物被霉菌毒素污染，每年所造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)千億美元［1］．我國霉菌毒素的污染狀況更是不容樂觀，平均每年損失的飼料占總產(chǎn)量的20%，其中一半以上是由于飼料霉變所致［2］．霉菌毒素的污染及其危害和所造成的經(jīng)濟(jì)損失已是不容忽視的問題．

近年來，國內(nèi)外學(xué)者針對飼料中產(chǎn)毒霉菌的防治做了大量的研究［3－9］，各種防霉措施、脫毒方法不斷出現(xiàn)，已取得了一定的成效，但無論哪一種方法或產(chǎn)品，都存在脫毒不徹底，添加量較大，費用較高，破壞或吸附飼料營養(yǎng)，影響飼料適口性等某方面的局限性，所以，新方法的研究仍是一個重要的研究內(nèi)容［10－11］．

微生物源天然防霉劑因其資源豐富，防治效果好，生產(chǎn)工藝簡單而受到各國的青睞［12－15］．目前，市場上出現(xiàn)的防霉劑難以對飼料中所有的污染霉菌起到抑制作用，采用單一措施很難取得良好的防治效果．因此，開發(fā)復(fù)合型天然防霉劑，提高防霉劑的使用效果，研制無毒副作用、無殘留的綠色環(huán)保型飼料防霉劑將成為今后研究和開發(fā)的熱點．本研究擬對從土壤中分離得到的TD-1菌株抑制9種污染霉菌的作用及其發(fā)酵液中活性物質(zhì)的穩(wěn)定性進(jìn)行研究，希望為新型防霉劑的開發(fā)提供實驗依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

拮抗菌TD-1，分離篩選自天津市寶坻區(qū)某飼料廠附近土壤中，經(jīng)中國科學(xué)院微生物研究所鑒定，TD-1菌株為鏈霉菌(Streptomyces sp．)．

污染霉菌:構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)、純綠青霉(Penicillium verrucosum)、赭曲霉(Aspergillus ochraceus)、黃曲霉(Aspergillus flavus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、茄腐鐮刀菌(Fusarium solani)、桔青霉(Penicillum citrinum)、串珠鐮刀菌(Fusarium moniliforme)，由天津市畜牧獸醫(yī)研究所提供．

1.1.2 培養(yǎng)基

高氏一號合成培養(yǎng)基:可溶性淀粉，20.0 g;NaCl，0.5 g;FeSO4·7H2O，0.01 g;MgSO4·7H2O，0.5 g;KNO3，1 g;K2HPO4，0.5 g;瓊脂，200 g;蒸餾水，1 000 mL;調(diào)節(jié)pH值為7.2～7.4．

TD-1液體發(fā)酵培養(yǎng)基:可溶性淀粉，20.0 g;黃豆粉，10.0 g;KNO3，1.0 g;K2HPO4，0.5 g;NaCl，0.5 g;MgSO4·7H2O，0.5 g;FeSO4·7H2O，0.01 g;蒸餾水1 000 mL;pH 值為 7.2 ～7.4［16］．

馬鈴薯浸汁瓊脂(PDA)培養(yǎng)基:稱取去皮馬鈴薯200.0 g，切成小塊，加入1 000.0 mL水煮沸30 min，用雙層紗布濾成清液．加自來水至1 000.0 mL，加入20.0 g葡萄糖完全溶解，pH值自然．

以上培養(yǎng)基滅菌條件為121℃，20 min．

1.2 方法

1.2.1 TD-1菌株對9種污染霉菌的抑菌活性測定

污染霉菌菌餅的制備:將污染霉菌接種于PDA培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)4 d，待菌落長滿整個平板后用打孔器打成直徑為0.8 cm的菌餅備用．

抑菌活性的測定:制備PDA培養(yǎng)基平板，采用對峙培養(yǎng)法［16－17］，在平板上以原點為中心劃十字線，在中心處點接TD-1菌株，28℃培養(yǎng)3 d，在兩條直線兩端距中心相同距離接種污染霉菌菌餅，勿與TD-1相連，28℃培養(yǎng)4 d，用直尺測量抑菌帶寬度．

1.2.2 TD-1菌株的生長及代謝特性的測定

將TD-1菌株在高氏一號斜面上活化，加入無菌生理鹽水制成菌懸液，備用．

1.2.2.1 菌株生長曲線的繪制

按體積分?jǐn)?shù)為10%接種量，將制備的TD-1菌懸液接種至裝有50 mL TD-1液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28℃，180 r/min搖床中培養(yǎng)3 d，在不同時間取樣，測定菌絲體質(zhì)量，重復(fù)3次．以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，菌絲體質(zhì)量為縱坐標(biāo)，繪制TD-1菌株生長曲線．

1.2.2.2 菌株代謝產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)特性的測定

按體積分?jǐn)?shù)為10%接種量，將制備的TD-1菌懸液接種至裝有100 mL TD-1液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28℃，180 r/min搖床中培養(yǎng)，每隔24 h取樣，以串珠鐮刀菌為指示菌，測定抑菌率變化［18］．

采用生長速率法測定抑菌率［19－20］．按體積分?jǐn)?shù)為10%接種量，將制備的TD-1菌懸液加到裝有100 mL TD-1液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28℃搖床(180 r/min)培養(yǎng)5～6 d，10 000 r/min離心15 min，取上清液，過0.22 μm無菌濾膜，濾液備用．取無菌濾液5 mL加入培養(yǎng)皿中，將20 mL冷卻至50℃左右的PDA培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中與濾液混合均勻，冷卻后接入串珠鐮刀菌菌餅，28℃培養(yǎng)，以不加TD-1無菌濾液平板接種的串珠鐮刀菌菌落作對照．24 h后測量串珠鐮刀菌的菌落直徑，計算串珠鐮刀菌菌絲生長抑制率．

式(1)中，D1為對照菌落生長直徑，mm;D2為處理菌落生長直徑，mm;D3為串珠鐮刀菌菌餅直徑，mm．

1.2.3 TD-1菌株產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性測定

1.2.3.1 活性物質(zhì)粗提液的制備

將TD-1菌株在高氏一號斜面上活化，制成菌懸液，按10%接種量加入裝有100 mL TD-1液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28℃搖床培養(yǎng)(180 r/min)5 ～6 d，10 000 r/min離心15 min，取上清液過0.22 μm無菌濾膜，濾液備用．

1.2.3.2 熱、酸、堿及紫外線處理

取30 mL TD-1菌株發(fā)酵上清液18份進(jìn)行處理［21－22］，結(jié)果見表 1．

表1 熱、酸堿、紫外線、保存時間處理條件Tab．1 Treatment conditions of heat，acid and alkali，UV，storage time

以 3 mol·L－1HCl和 3 mol·L－1NaOH 調(diào)節(jié) pH值至最初數(shù)據(jù)為8.1，以串珠鐮刀菌為指示菌，采用生長速率法檢測各種處理條件下TD-1菌株抑菌活性，測定生長直徑大小，計算抑菌率．60，80，100℃加熱在水浴鍋中進(jìn)行，121℃處理在高壓滅菌鍋中進(jìn)行．紫外照射處理在紫外誘變箱中進(jìn)行，將發(fā)酵上清液倒入培養(yǎng)皿中，打開皿蓋照射，照射高度為20 cm．各實驗重復(fù)3次．

2 結(jié)果與討論

2.1 TD-1菌株對9種污染霉菌的抑制效果

按1.2.1方法，分別以黃曲霉(Aspergillus flavus)、桔青霉(Penicillum citrinum)、茄腐鐮刀菌(Fusarium solani)、赭曲霉(Aspergillus ochraceus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidu-lans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、純綠青霉(Penicillium verrucosum)、串珠鐮刀菌(Fusrium moniliforme)作為指示菌，檢測TD-1菌株對9種供試菌的抑菌效果，結(jié)果見表2．

從表2中可以看出，TD-1菌株發(fā)酵液對9種污染霉菌均有很強(qiáng)的抑制作用，抑菌帶寬度為10 mm左右．其抑菌效果見圖1．

2.2 TD-1菌株的生長及代謝規(guī)律

2.2.1 TD-1菌株生長曲線繪制

按1.2.2.1方法研究TD-1菌株生長規(guī)律，結(jié)果如圖2．

表2 TD-1菌株對9種污染霉菌的抑菌效果Tab．2 Inhibition effects of TD-1 on 9 strains of toxic molds mm

圖1 TD-1菌株對9種供試霉菌的抑制效果Fig．1 Inhibition effects of TD-1 on 9 kinds of molds

從圖2中可以看出，TD-1菌株在發(fā)酵第6 d菌質(zhì)量達(dá)到最大值，隨后逐漸降低，最后穩(wěn)定在0.65 g左右，說明TD-1菌株在第6 d生長達(dá)到峰值．

2.2.2 TD-1菌株代謝過程中抑菌率變化

按1.2.2.2方法研究TD-1菌株在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)變化，結(jié)果見圖3．

從圖3中可以看出，TD-1菌株在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)前2 d對串珠鐮刀菌沒有抑制活性，表明未產(chǎn)生抑菌物質(zhì)，2 d后菌株開始產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，并且迅速增多，到6 d時抑制率達(dá)到最大值，隨后抑制率又開始下降，最后抑菌率維持在90%左右．

2.3 菌株產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性分析

2.3.1 溫度對TD-1發(fā)酵液抑菌活性的影響

按1.2.3.2方法研究溫度對TD-1發(fā)酵液抑菌活性的影響，結(jié)果見圖4．

從圖4中可以看出，經(jīng) 60，80，100，121℃處理30 min，以及121℃處理60 min后，TD-1菌株發(fā)酵液抑菌活性與未處理相比明顯提高，說明發(fā)酵液中的抗菌物質(zhì)具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性．

圖2 TD-1菌株的生長曲線Fig．2 Growth curve of strain TD-1

圖3 TD-1菌株代謝產(chǎn)物對串珠鐮刀菌的抑制作用Fig．3 Inhibition effects of fermentation metabolite of TD-1 on Fusarium moniliforme

圖4 溫度對TD-1菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig．4 Effects of temperature on antibacterial activity of TD-1 fermented broth

2.3.2 酸堿對TD-1發(fā)酵液抑菌活性的影響

按1.2.3.2方法，將TD-1發(fā)酵濾液調(diào)節(jié)至pH值為3和pH值為10，并分別經(jīng)121℃處理30 min，除在pH值為10未加熱處理條件下抑菌活性無明顯變化外，其他條件下的抑菌活性與未處理相比顯著提高，見圖5，說明TD-1菌株產(chǎn)生的活性物質(zhì)具有較強(qiáng)的耐酸、堿性，其原因有待進(jìn)一步研究．

圖5 pH值對TD-1發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig．5 Effects of pH on antibacterial activity of TD-1 fermented broth

2.3.3 紫外線對TD-1發(fā)酵液抑菌活性的影響

按1.2.3.2方法，研究紫外線照射對TD-1發(fā)酵液抑菌活性的影響，結(jié)果見圖6．圖6表明，經(jīng)2，6，12，24 h紫外燈照射后，TD-1菌株發(fā)酵液的抑菌能力沒有減弱卻有提高，說明TD-1菌株發(fā)酵液對紫外線照射的穩(wěn)定性較好．

圖6 紫外線對TD-1發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig．6 Effects of ultraviolet on antibacterial activity of TD-1 fermented broth

2.3.4 保存時間對TD-1發(fā)酵液抑菌活性的影響

將TD-1菌株發(fā)酵液濾液放置于30℃，保存0～50 d發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液濾液抑菌率在20 d以后才略有下降，見圖7．

3 結(jié)論

從土壤中分離篩選到的TD-1菌株抑菌譜廣，對污染飼料的串珠鐮刀菌、黃曲霉、桔青霉、茄腐鐮刀菌、赭曲霉、米曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、純綠青霉均具有較強(qiáng)的抑制作用．在目前產(chǎn)毒霉菌的防治研究中，能同時抑制9種污染霉菌生長的拮抗菌株較少，因此，TD-1菌株及產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)具有一定的研究意義和潛在的應(yīng)用價值．

圖7 保存時間對TD-1發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig．7 Effects of storage time on antibacterial activity of TD-1 fermented broth

通過測定TD-1菌株生長規(guī)律和抑菌活性物質(zhì)的變化情況，可以確定TD-1菌株在發(fā)酵第2～3 d開始產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)，第6 d達(dá)到最大值，為該菌株代謝產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)的提取提供了依據(jù)．

對TD-1菌株所產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性初步研究結(jié)果顯示，經(jīng)加熱、酸堿及紫外燈照射處理后，其抑菌活性無明顯變化，表明該抑菌活性物質(zhì)具有較好的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性和較強(qiáng)的抗紫外線輻射特性．這些特性為微生物源天然防霉劑的開發(fā)提供了實驗依據(jù)．

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(責(zé)任編輯:葉紅波)

Inhibition and Stability of Metabolic Products by Streptomyces sp．TD-1 to Mold of Feed Contamination

LIU Chun-jing1， WANG Chang-lu2， LI Feng-juan2， CHEN Mian-hua2，WANG Yu-rong2， LI Zhen-jing2， WANG Zhi-fang2
(1.College of Science，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China;2.Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education/School of Food Engineering and Biological Technology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China)

Metabolites of Streptomyces sp．TD-1 were reported with obvious inhibiting effects to Fusarium moniliforme，Aspergillus nidulans，Penicillium verrucosum，Aspergillus ochraceus，Aspergillus flavus，Aspergillus niger，Aspergillus oryzae，F(xiàn)usarium solani and Penicillum citrinum with the size of inhibition zone of about 10 mm．The metabolic chart of growth process of TD-1 strain showed that the growth amounted to the maximum，and the inhibition rates reached to 90%at the 6th day．Stability test showed that the antimicrobial compounds produced by TD-1 strain had good thermo and pH stability，and strong anti-UV ability．

Streptomyces sp．;inhibition effects;contaminated mold;stability

TS201.2

A

1671-1513(2012)04-0054-05

2012-03-07

劉春靜，女，助理實驗師，碩士，主要從事儀器分析方面的工作;

王昌祿，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事食品生物技術(shù)方面的研究．通訊作者．