沈國(guó)平 邢建明 毛水瑩 費(fèi)月平 沈玲瓏

同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)是一種含硫氨基酸，是蛋氨酸代謝過程中的中間產(chǎn)物。近年來它的檢測(cè)技術(shù)不斷發(fā)展，臨床應(yīng)用范圍更加廣泛，已經(jīng)成為許多疾病的相關(guān)診斷指標(biāo)。目前，同型半胱氨酸(Hcy)的測(cè)定方法有很多種，有高效液相色譜法(HPLC)、離子色譜法、毛細(xì)管電泳法、酶聯(lián)免疫分析法(EIA)、熒光偏振免疫法和循環(huán)酶法［1］。由于以上方法有的操作復(fù)雜，有的儀器或試劑昂貴，影響了在國(guó)內(nèi)常規(guī)檢驗(yàn)及進(jìn)一步推廣普及?，F(xiàn)上海復(fù)星長(zhǎng)征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司生產(chǎn)了一種適用于自動(dòng)生化分析儀的酶轉(zhuǎn)換法測(cè)定Hcy試劑盒，本實(shí)驗(yàn)對(duì)酶轉(zhuǎn)換法測(cè)定血清Hcy試劑盒進(jìn)行了方法學(xué)評(píng)價(jià)，同時(shí)與循環(huán)酶法測(cè)定血清Hcy試劑盒進(jìn)行了相關(guān)性比較，以確定其分析性能是否符合臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用的要求，現(xiàn)總結(jié)報(bào)告如下。

材料與方法

1．材料:(1)儀器:美國(guó)雅培公司Abbott Aeroset全自動(dòng)生化儀。(2)Hcy試劑盒:評(píng)價(jià)試劑由上海復(fù)星長(zhǎng)征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司提供，含定標(biāo)液和質(zhì)控品(低值和高值)。試劑主要成分:Tris緩沖液50mmol/L，F(xiàn)eCl350mmol/L，同型半胱氨酸酶500U/L，5－磷酸吡哆醛5mmol/L，二硫蘇糖醇5mmol/L，二乙基對(duì)苯二胺硫酸鹽2mmol/L。對(duì)照試劑由北京九強(qiáng)生物技術(shù)有限公司提供，含定標(biāo)液和質(zhì)控品(低值和高值)。試劑主要成分:S － 腺苷甲硫氨酸0．1mmol/L，還原型輔酶0．2mmol/L，3(2－羧乙基)膦氯化氫0．5mmol/L，α－酮戊二酸5mmol/L，Hcy甲基轉(zhuǎn)移酶5．0kU/L，谷氨酸脫氫酶10kU/L，S－腺苷同型半胱氨酸水解酶3．0kU/L，腺苷脫氨酶5．0kU/L。(3)測(cè)定樣本:①定值質(zhì)控血清，低值質(zhì)控血清Hcy=10．0μmol/L，高值質(zhì)控血清Hcy=20．0μmol/L;由上海復(fù)星長(zhǎng)征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司提供;②臨床標(biāo)本，為來筆者醫(yī)院健康查體者60例，標(biāo)本均無黃疸、溶血及脂血，年齡22～55歲，男、女性各30例，所有標(biāo)本均采取空腹靜脈血4ml，在1h內(nèi)以3000r/min離心10min后分離血清待檢，健康查體者均無心、肝、腎及血液系統(tǒng)等疾病。

2．干擾物質(zhì):由于實(shí)驗(yàn)條件限制，我們選了4種臨床常見的干擾物質(zhì)，制備如下:①血紅蛋白干擾物:取新鮮乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血用生理鹽水反復(fù)洗滌數(shù)次后，離心棄去生理鹽水，加蒸餾水使紅細(xì)胞完全溶解(鏡下瑞氏染色檢查)，使用Sysmex－XE－2100D血球儀進(jìn)行血紅蛋白檢測(cè)，加生理鹽水配制，血紅蛋白(Hb)濃度分別為 32、16、8、4、2g/L;②甘油三酯(TG)干擾物:取高血脂患者樣本，使用Abbott Aeroset自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行甘油三酯檢測(cè)，加生理鹽水配制，TG濃度分別為 72、36、18、9、4．5、2．25mmol/L;③膽紅素干擾物:取黃疸患者樣本，使用Abbott Aeroset自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行膽紅素檢測(cè)，加生理鹽水配制，總膽紅素(TBil)濃度分別為340、170、85、42．5、21．25μmol/L;④維生素 C 干擾液:臨床用 100g/L的維生素C注射液加生理鹽水配制，維生素C濃度分別為10、7．5、5．0、2.5、1．0g/L。

3．方法:(1)操作方法:試劑盒測(cè)定參數(shù)設(shè)置和操作嚴(yán)格按照試劑盒廠家規(guī)定進(jìn)行。(2)評(píng)價(jià)方法:按照NCCLS評(píng)價(jià)方案和已建立的方法對(duì)試劑的精密度、線性、抗干擾性、回收率等進(jìn)行評(píng)價(jià)，并與北京九強(qiáng)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的Hcy試劑盒進(jìn)行相關(guān)性比較［2］;通過間隔時(shí)間測(cè)定評(píng)價(jià)新配工作試劑的貯存穩(wěn)定性。

4．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用 Microsoft Excel 2003及SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

結(jié) 果

1．精密度評(píng)估:依據(jù)NCCLS文件，取低值、高值質(zhì)控血清，每天測(cè)定2次，兩次測(cè)定間隔不少于2h，每次測(cè)定對(duì)樣本均做雙份檢測(cè)，共測(cè)定20天，計(jì)算低值、高值質(zhì)控血清樣本的精密度，結(jié)果見表1。

表1 Abbott Aeroset測(cè)定HCY的精密度評(píng)價(jià)結(jié)果

2．線性試驗(yàn):依據(jù)NCCLS文件，采用試劑盒中濃度為40．0μmol/L標(biāo)準(zhǔn)液，配制成其濃度水平分別為2、5、10、20、30、40μmol/L 的標(biāo)本進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)標(biāo)本測(cè)定4次，將所得數(shù)據(jù)平均值作散點(diǎn)圖并進(jìn)行多項(xiàng)式回歸統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果(圖1)表明在測(cè)定范圍內(nèi)呈線性，回歸方程為:y=1．005x+0．388，r2=1．000［3］。

圖1 HCY試劑的線性實(shí)驗(yàn)

3．對(duì)比試驗(yàn):依據(jù)NCCLS文件，我們以復(fù)星長(zhǎng)征試劑為實(shí)驗(yàn)方法，北京九強(qiáng)試劑為比較方法，每天測(cè)定10個(gè)樣本，測(cè)定時(shí)第1次按1→10順序，第2次按10→1順序，用Abbott Aeroset生化儀對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行測(cè)定，在6個(gè)工作日內(nèi)完成，將所得數(shù)據(jù)作散點(diǎn)圖并進(jìn)行回歸統(tǒng)計(jì)分析;結(jié)果表明兩者測(cè)定結(jié)果具有良好的相關(guān)性(y=0．901x+1．170，r2=0．924，n=60，圖2);酶轉(zhuǎn)換法測(cè)定結(jié)果均值:12．77 ±6．37μmol/L，循環(huán)酶法測(cè)定結(jié)果均值:12．87 ±6．80μmol/L，兩者測(cè)定結(jié)果均值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.08，P＞0.05)，由此可見兩者測(cè)定結(jié)果基本一致。

圖2 兩種方法測(cè)定HCY相關(guān)性比較

4．干擾試驗(yàn):依據(jù)NCCLS文件，在混合血清標(biāo)本分別加入臨床上常見的干擾物質(zhì)，生理鹽水做平行管對(duì)照，每個(gè)測(cè)試標(biāo)本分析2次，與對(duì)照樣本結(jié)果比較，Hb干擾比較嚴(yán)重，Hb濃度在2g/L時(shí)偏差＜10%，其余幾項(xiàng)偏差均＜10．0%，干擾試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 HCY抗干擾試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

5．回收試驗(yàn):采用混合血清標(biāo)本2．7ml，平均分成3份，分別加入濃度為20、40μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液和生理鹽水0．1ml，以生理鹽水管做對(duì)照，每個(gè)測(cè)試樣本分析4 次，測(cè)的回收樣本結(jié)果均值為 11．95、14．20μmol/L，對(duì)照樣本結(jié)果均值為10．0μmol/L，回收率為 97．5%和105．0%，平均回收率為101．25%。

6．試劑穩(wěn)定性:新配工作試劑當(dāng)天在 Abbott Aeroset自動(dòng)生化分析儀上定標(biāo)并測(cè)定高、低值質(zhì)控血清中Hcy含量，然后貯存在儀器試劑倉(cāng)(2～8℃)，分別在第2、3、4天測(cè)定，每個(gè)標(biāo)本上下午各測(cè)定2次，取當(dāng)天數(shù)據(jù)均值記錄。結(jié)果顯示新配工作試劑在說明書注明的4天內(nèi)測(cè)定結(jié)果無影響(表3)。

表3 HCY新配工作試劑穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果

討 論

Hcy是一種含硫氨基酸，是蛋氨酸代謝過程中的中間產(chǎn)物。許多臨床研究及大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查表明，Hcy水平升高是動(dòng)脈粥樣硬化性血管病，動(dòng)、靜脈血栓栓塞、糖尿病、肝臟疾病以及周圍血管性疾病等的一個(gè)重要的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，在臨床上測(cè)定Hcy對(duì)于疾病的診斷有很重要的意義［4，5］。上海復(fù)星長(zhǎng)征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司生產(chǎn)的Hcy試劑，其原理是:以酶轉(zhuǎn)換法為基礎(chǔ)，樣本中的氧化型同型半胱氨酸首先被還原劑二硫蘇糖醇還原為還原型同型半胱氨酸;還原型同型半胱氨酸其后被特異性極高的基因重組同型半胱氨酸酶分解產(chǎn)生NH3、α－氧代丁酸、硫化氫;分解產(chǎn)物硫化氫在氧化劑FeCl3存在下與呈色劑二乙基對(duì)苯二胺硫酸鹽反應(yīng)形成甲基藍(lán)色化物;上述反應(yīng)中形成的甲基藍(lán)色化物與樣本中同型半胱氨酸的濃度成正比，通過在波長(zhǎng)660nm處測(cè)定吸光度的變化值，即可測(cè)得樣本中同型半胱氨酸的總濃度。

我們按照NCCLS評(píng)價(jià)方案和已建立的方法對(duì)復(fù)星長(zhǎng)征公司提供的Hcy試劑進(jìn)行了線性、精密度、抗干擾能力、回收試驗(yàn)等方面的評(píng)價(jià)試驗(yàn)，結(jié)果表明該方法具有較好的精密度，批內(nèi)、批間、日間、總CV均＜5．0%，見表1;在0～40μmol/L內(nèi)檢測(cè)線性良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線至少可穩(wěn)定3周;平均回收率為101．25%;我們選用了臨床常見的干擾物質(zhì)，結(jié)果表明血紅蛋白干擾比較嚴(yán)重，Hb濃度在2g/L時(shí)偏差大于10%，其余幾項(xiàng)偏差均＜10．0%，見表2;由于實(shí)驗(yàn)條件限制，我們與北京九強(qiáng)公司的Hcy試劑進(jìn)行了比較，相關(guān)性良好(r2=0．924，n=60)，兩者測(cè)定結(jié)果基本一致(t=0．08，P ＞0．05)。由于試劑 1 需新配制，我們對(duì)其進(jìn)行了穩(wěn)定性測(cè)試，結(jié)果表明其在說明書規(guī)定的時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定性良好，見表3。

綜上所述，酶轉(zhuǎn)換法測(cè)定Hcy試劑盒具有操作簡(jiǎn)便、快速、適合自動(dòng)生化儀使用操作、具有較高的精密度和準(zhǔn)確度、較寬的線性、較強(qiáng)的抗干擾能力和試劑穩(wěn)定性，符合臨床檢驗(yàn)使用的要求，適合在臨床實(shí)驗(yàn)室使用。但是血紅蛋白會(huì)使測(cè)定結(jié)果偏高，應(yīng)注意避免樣本溶血。

1 韓志鈞，黃志峰，盧業(yè)成，等．臨床化學(xué)常用項(xiàng)目自動(dòng)分析法［M］．3版．沈陽:遼寧科學(xué)技術(shù)出版社，2005:1043－1049

2 王金良，李曉軍，涂植光，等．實(shí)用檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)·下冊(cè)［M］．北京:人民衛(wèi)生出版社，2009:7－33

3 李萍，劉小娟，黃亨建．多項(xiàng)式評(píng)價(jià)線性在實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用［J］．檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2006，21(6):582 －587

4 McCully KS．Homocysteine and vascular disease［J］．Nature Medicine，1996，2(4):386 －389

5 賈瑛，穆紅．同型半胱氨酸的檢測(cè)技術(shù)與臨床應(yīng)用新進(jìn)展［J］．國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2008，29(11):1023 －1025