張義鵬 解學(xué)關(guān) 高偉陽 王安遠(yuǎn) 呂 雷 張國佑

活化的成纖維細(xì)胞被認(rèn)為是瘢痕纖維化時細(xì)胞外基質(zhì)的主要來源和發(fā)生、發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator－activated receptor gamma，PPAR－γ)是一類由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，是核受體超家族成員之一［1］，具有多種生物學(xué)效應(yīng)，對細(xì)胞生長、分化及凋亡具有重要影響，可作為負(fù)調(diào)節(jié)信號，參與多種組織和器官纖維化等多種病理生理效應(yīng)，在纖維化發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用［2］。目前PPAR－γ在皮膚纖維化形成機(jī)制中的研究報道很少。本實驗擬研究PPAR－γ在增生性瘢痕和正常皮膚成纖維細(xì)胞的表達(dá)差異，探討其在增生性瘢痕形成機(jī)制中的作用。

對象與方法

1．對象:增生性瘢痕組織分別來自筆者醫(yī)院9例臨床患者，其中男性4例，女性5例，患者年齡7～33歲，所有標(biāo)本均取自于上臂、頸胸部及下肢近端，瘢痕生長時間4～14個月。正常皮膚組織分別來自上述患者瘢痕周圍皮膚。所有患者無其他系統(tǒng)性疾病，瘢痕組織未經(jīng)特殊處理。

2．方法:(1)常規(guī)原代組織塊細(xì)胞培養(yǎng):在超凈工作臺、無菌條件下，對組織塊用PBS液沖洗5遍，移入培養(yǎng)皿中，用眼科組織彎剪剪棄脂肪和結(jié)締組織，盡量去除皮下組織;用手術(shù)刀片切割成1～2mm寬的小皮條，放置于直徑3．5cm的培養(yǎng)皿中，加入2．0U/ml的 DispaseⅡ(neutral protease，gradeⅡ)(Sigma公司)，4℃中冷消化，16～18h后，用顯微鑷分離表皮和真皮層;將獲取的小皮條用眼科組織彎剪剪成1～2mm2的小組織，眼科鑷均勻放入培養(yǎng)瓶中，加入3～5ml含20%胎牛血清(杭州四季青)的高糖－DMEM培養(yǎng)液(美國Gibco公司)，置37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3天更換1次培養(yǎng)液。5～7天可見梭形的成纖維細(xì)胞游出，待細(xì)胞爬滿瓶底，0．25%胰蛋白酶(含EDTA)消化傳代。并取第3～5代的成纖維細(xì)胞進(jìn)行實驗。(2)實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real－time Q－PCR):以每孔1×106個細(xì)胞的密度將各組細(xì)胞分別接種于6孔板，培養(yǎng)3天后，利用RNA提取試劑盒 (美國 Invitrogen公司)提取正常成纖維細(xì)胞和增生性成纖維細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄(反轉(zhuǎn)錄試劑盒、美國 MBI公司)合成 cDNA模板，進(jìn)行目的基因的 PCR擴(kuò)增(PCR擴(kuò)增儀、美國ABI公司)，產(chǎn)物倍比稀釋，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。采用熒光定量RCP儀(美國Stratagene公司)分別擴(kuò)增目的基因和內(nèi)參基因，測定標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線，用Ct值表示樣品中模板的相對含量。熒光定量RCP的反應(yīng)體系與條件:95℃預(yù)變性10min，1個循環(huán)，95℃、變性30s，退火40s，72℃延伸40s，共45個循環(huán)。每個樣本的RNA含量均根據(jù)各自的β－2actin含量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。本實驗所使用的正向引物(F)和反向引物(R):PPAR－γ(L)5'－ACTCCACATTACGAAGACATTCC －3';PPAR － γ，(R)5'－TTATCTCCACAGACACGACATTC －3'。(3)Western blotting法檢測PPAR－γ蛋白表達(dá)水平:以每孔1×106個細(xì)胞的密度將各組細(xì)胞分別接種于 6孔板，培養(yǎng)3天后，每孔加入100μlRIPA細(xì)胞裂解液(碧云天公司)，4℃ 冰浴下提取總蛋白。以BCA蛋白定量試劑盒(碧云天公司)進(jìn)行蛋白定量 。每孔加入40μg蛋白進(jìn)行10%SDSPA G E凝膠電泳，蛋白電泳轉(zhuǎn)移儀將分離后的蛋白條帶轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上，封閉液室溫封閉2h，按1∶800分別加入兔抗人PPAR－γ多克隆抗體(ABCAM公司)和兔抗人β－actin多克隆抗體(Santa cruz公司)，37℃孵育 2h，PBST洗膜 ，按1∶400加入羊抗兔二抗(Santa cruz公司)，37℃孵育2h，化學(xué)發(fā)光試劑反應(yīng)2min，發(fā)光成像儀取像并測定條帶灰度值。以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達(dá)量。

3．統(tǒng)計學(xué)方法:采用SPSS18．0統(tǒng)計軟件進(jìn)行配對樣本t檢驗分析，取p＜0．05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1．實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(real－time Q－PCR)檢測正常皮膚成纖維細(xì)胞和增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中PPAR－γm RNA基因PCR擴(kuò)增動力學(xué)曲線和PPAR－γ基因擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線:結(jié)果顯示PPAR－γ蛋白在正常皮膚成纖維細(xì)胞和增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中均有表達(dá)，mRNA相對表達(dá)量根據(jù)2－ΔCT×100%計算。正常皮膚成纖維細(xì)胞中PPAR－γmRNA相對表達(dá)量為14．62% ±2．92%，增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中PPAR－γmRNA的相對表達(dá)量為7．08% ±3．04%，增生性瘢痕組PPAR－γmRNA表達(dá)量明顯低于正常皮膚成纖維細(xì)胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0．05，圖1、圖2)。

圖1 PPAR－γ(m RNA)基因PCR擴(kuò)增動力學(xué)曲線

圖2 PPAR－γ基因擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線

2．Western blotting法檢測PPAR－γ蛋白表達(dá)水平:兩組β－actin雜交條帶亮度相似，于相對分子質(zhì)量為50kDa位置均呈現(xiàn)PPAR－γ表達(dá)，但亮度有明顯差異，正常皮膚PPAR－γ蛋白條帶亮度明顯高于增生性瘢痕PPAR－γ蛋白條帶(圖3)。正常成纖維細(xì)胞PPAR－γ蛋白的相對表達(dá)量為22．48% ±4.13%，增生性瘢痕組為9．40% ±2．23%。正常成纖維細(xì)胞PPAR－γ蛋白的相對表達(dá)量明顯高于增生性瘢痕組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0．05)。

圖3 增生性瘢痕及正常皮膚PPAR－γ蛋白條帶

討 論

瘢痕纖維化是在機(jī)體創(chuàng)傷修復(fù)過程中，由于全身和局部因素的影響，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積和膠原降解減少而形成的最終結(jié)果［3］?；罨某衫w維細(xì)胞被認(rèn)為是瘢痕纖維化時細(xì)胞外基質(zhì)的主要來源和發(fā)生、發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，但增生性瘢痕確切形成機(jī)制目前尚不明確。

過氧化物酶體增殖物激活受體－γ(PPAR－γ)是一類由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，是核受體超家族中的成員之一［1］。1990年Isseman等首次發(fā)現(xiàn)其存在于脂肪細(xì)胞的分化調(diào)控通路中，故又稱為脂激活轉(zhuǎn)錄因子。PPAR－γ具有多種生物學(xué)效應(yīng)，是體內(nèi)糖、脂代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，對細(xì)胞生長、分化及凋亡具有重要影響，且與炎癥、心血管疾病、糖尿病及腫瘤等多種疾病密切相關(guān)［4］。

研究發(fā)現(xiàn):PPAR－γ參與多種組織和器官纖維化等多種病理生理效應(yīng)，在纖維化發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，具有拮抗TGF－β1的促纖維化、調(diào)控TGF/Smad通路等效應(yīng)［2，5］。高糖環(huán)境下培養(yǎng)的腎系膜細(xì)胞PPAR－γ表達(dá)降低、Ⅰ型膠原表達(dá)增加。以轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor－β1，TGF－β1)作用于人腎小球系膜細(xì)胞，ECM成分明顯增多。轉(zhuǎn)染PPAR－γ載體或加入PPAR－γ激動劑匹格列酮干預(yù)后，Ⅰ型膠原表達(dá)水平降至正常水平，特異性抑制腎成纖維細(xì)胞增生和細(xì)胞外基質(zhì)的合成，減輕了高糖及正常血糖狀況下的進(jìn)行性腎小管間質(zhì)纖維化作用［6，7］。體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)PPAR－γ激動劑同樣能減輕腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化的程度［8］。此外，在肝臟的星狀細(xì)胞中有PPAR－γ的表達(dá)，活化的星狀細(xì)胞中PPARγ的表達(dá)水平及轉(zhuǎn)錄能力均下降，天然或人工合成的PPAR－γ配體可抑制星狀細(xì)胞增殖、Fb轉(zhuǎn)分化和膠原過量合成［9，10］。在二甲基亞硝胺、四氯化碳和膽管阻塞所致的肝纖維化動物模型中，給予PPAR－γ的激動劑，可以減少細(xì)胞外基質(zhì)的沉積和HSC的活化，抑制膠原和纖維連接蛋白的合成與分泌，減弱肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展的程度［11］。PPAR－γ激活后，能抑制體外培養(yǎng)肝星狀細(xì)胞受TGF－β刺激后Ⅰ型膠原、纖維連接蛋白的合成與分泌，抑制α－SMA的表達(dá)。實驗證明PPAR－γ有可能逆轉(zhuǎn)激活的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，并抑制Ⅰ型膠原酶啟動子的活性、mRNA的表達(dá)以及膠原的過量表達(dá)［10］。PPAR－γ在肺纖維化的形成過程中，可能通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，參與免疫反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)基膜增厚反應(yīng)和細(xì)胞外基質(zhì)沉積等途徑來調(diào)節(jié)肺的纖維化。在大鼠肺纖維化模型中，發(fā)現(xiàn) PPAR－γ激動劑具有體內(nèi)抗肺纖維化的效應(yīng)［12］。同時，體外細(xì)胞實驗證實，將PPAR－γ激動劑作用于正常人和特發(fā)性間質(zhì)性肺炎患者的肺成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)有拮抗TGF－β1的作用，進(jìn)而減少肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化及膠原的過度合成［13］。近來研究發(fā)現(xiàn):采用不用濃度的PPAR－γ激動劑曲格列酮作用于體外培養(yǎng)的瘢痕疙瘩皮膚成纖維細(xì)胞，在一定濃度范圍內(nèi)TGF－β1、細(xì)胞外基質(zhì)、Ⅰ型膠原及纖維連接蛋白在基因和蛋白水平均明顯下調(diào);同時能夠明顯抑制TGF－β1誘導(dǎo)的ECM的表達(dá)，且這種促進(jìn)作用能夠被PPAR－γ拮抗劑GW9662所抑制，其具體的作用機(jī)制可能與TGF/Smad通路有關(guān)。所有這些研究結(jié)果說明了PPAR－γ與體內(nèi)各種器官的纖維化過程有著密切關(guān)系。

本實驗應(yīng)用具有高特異性和高靈敏性的實時定量PCR技術(shù)和Western blotting技術(shù)，分別從基因水平和蛋白水平檢測PPAR－γ在正常皮膚成纖維細(xì)胞和增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果提示PPAR－γmRNA和蛋白在正常皮膚成纖維細(xì)胞和增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中均有表達(dá)，但在增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中表達(dá)較正常皮膚成纖維細(xì)胞低。表明PPAR－γ可能在增生性瘢痕形成中發(fā)揮著重要的作用，參與了增生性瘢痕的形成過程。本實驗為進(jìn)一步研究瘢痕形成機(jī)制提供一定了實驗基礎(chǔ)，同時有望為瘢痕纖維化的臨床治療提供新的靶點。

1 Reddy RC．Immunomodulatory role of PPAR－gamma in alveolarm acrophages［J］．JInvestig Med，2008，56(2):522 － 527

2 Pascual G，Sullivan AL，Ogawa S，et al．Anti－ inflammatory and antidiabetic roles of PPAR － gamma［J］．Novartis Found Symp，2007，286:183－196

3 Gregor M，Bran，Ulrtch R，et al．Keloids:current concepts of pathogenesis［J］．International Jouenal of Molecular Medicine，2009，24(3):283－293

4 Zingarelli B，Cook JA．Peroxisome proliferator－activated receptorgamma is a new therapeutic target in sepsis and inflammation［J］．Shock，2005，23(5):393 －399

5 Zhang GY，Cheng T，Zheng MH，et al．Peroxisome proliferator－ activated receptor－g(PPAR－g)agonist inhibits transforming growth factor－ beta1 and matrix production in human dermal fibroblasts［J］．J Plast Reconstr Aesthet Surg，2010，63(7):1209 －1216

6 Zafiriou S，Stanners SR，Saad S，et al．Pioglitazone inhibits cell growth and reduces matrix production in human kidney fibroblasts［J］．J Am Soc Nephrol，2005，16(3):638 － 645

7 Maeda A，Horikoshi S，Gohda T，et al．Pioglitazone attenuates TGF －beta(1)－induction of fibronectin synthesis and its splicing variant in human mesangial cells via activation of peroxisome proliferator－activated receptor(PPAR)gamma［J］．Cell Biol Int，2005，29(6):422－428

8 Zou R，Xu G，Liu XC，et al．PPAR － gamma agonists inhibit TGF － beta － PKA signaling in glomerulosclerosis［J］．Acta Pharmacol Sin，2010，31(1):43 －50

9 Masamune A，Kikuta K，Satoh M，et al．PPAR agonists prevent TGF－ beta1/Smad3 signaling in human hepatic stellate cells［J］．Biochem Biophys Re Commun，2006，350(2):385 －391

10 Sun K，Wang Q，Huang XH．PPAR gamma inhibts growth of rat hepatic stellate cells and TGF beta－induced connective tissue growth factor expression［J］．Acta Pharmacol Sin，2006，27(6):715 －723

11 Wang Z，Xu JP，Zheng YC，et al．Peroxisome proliferator－ activated receptor gamma inhibits hepatic fibrosis in rats［J］．Hepatobiliary Pancreat Dis Int，2011，10(1):64 － 71

12 Aoki Y，Maeno T，Aoyagi K，et al．Pioglitazone，a peroxisome proliferator－activated receptor gamma ligand suppresses bleomycin－induced acute lung injury and fibrosis［J］．Respiration，2009，77(3):311－319

13 Milam JE，Keshamouni VG，Phan SH，et al．PPAR－gamma agonists inhibit profibrotic phenotypes in human lung fibroblasts and bleomycin－ induced pulmonary fibrosis［J］．Am JPhysiol Lung Cell Mol Physiol，2008，294(5):L891 －901