崇 蕾 張維溪 聶 穎 王 婷 李昌崇

Notch受體家族廣泛存在于從無脊椎動(dòng)物到哺乳動(dòng)物等多種生物體內(nèi)，參與多種組織細(xì)胞的信號(hào)識(shí)別、增殖、分化和凋亡等功能活動(dòng)，近來研究表明，Notch參與外周T淋巴細(xì)胞及其亞群的分化發(fā)育過程［1，2］。支氣管哮喘是一種由多種炎癥細(xì)胞和細(xì)胞成分參與的慢性氣道炎癥性疾病，Th2細(xì)胞的分化發(fā)展是其發(fā)病的始動(dòng)環(huán)節(jié)［3］。布地奈德作為一種吸入性糖皮質(zhì)激素，具有減輕氣道炎癥和抗過敏的作用，但它的具體作用機(jī)制如何，目前尚未明確。Oh等［4］研究提示，姜黃素也可明顯改善過敏性氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性，故本研究利用布地奈德和姜黃素干預(yù)哮喘模型，觀察其可能的作用靶點(diǎn)。

材料與方法

1．材料:體重18～22kg的SPF級(jí)雄性Balb/c小鼠購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司;卵白蛋白(OVA)和姜黃素藥液購自美國Sigma公司;布地奈德霧化液由阿斯利康公司提供;SP二步法檢測(cè)試劑盒為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;Notch2單克隆抗體和Notch4多克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司;Trizol抽提試劑由美國Invitrogen公司提供;RT－PCR試劑盒購自美國Fermentas公司。

2．方法:(1)小鼠氣道炎癥模型的建立:將64只Balb/c小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后，隨機(jī)分為4組，即正常對(duì)照組(A組)、哮喘組(B組)、布地奈德組(C組)和姜黃素組(D組)，每組8只。參照李昌崇等［5］方法制備哮喘小鼠氣道炎癥模型:分別于第1天和第13天經(jīng)小鼠腹腔注射0．01%OVA/Al(OH)3混合液0．1ml致敏，第25～32天每天以1%OVA生理鹽水溶液進(jìn)行霧化激發(fā);布地奈德組于每次OVA激發(fā)前2h霧化吸入0．5mg/ml的布地奈德霧化液，持續(xù)至最后1次激發(fā)［6］;姜黃素組小鼠于每次激發(fā)前20min胃飼姜黃素藥液200mg/kg，持續(xù)至最后1次激發(fā)［7］;正常組以生理鹽水代替OVA致敏和激發(fā)小鼠。(2)肺組織標(biāo)本的采集及處理:各組小鼠于末次激發(fā)后24h內(nèi)處死，取左肺肺門段組織固定于4%多聚甲醛，送病理科石蠟包埋切片，用于HE染色和免疫組織化學(xué)染色;取右肺組織迅速置于液氮冷凍后轉(zhuǎn)入－80℃冰箱保存，用于RT－PCR檢測(cè)。(3)肺組織中Notch2、Notch4受體蛋白的測(cè)定:用SP二步法檢測(cè)試劑盒對(duì)肺組織切片進(jìn)行Notch2(1∶400)、Notch4(1∶100)免疫組化染色，陽性結(jié)果為胞膜、胞質(zhì)或胞核呈棕黃色，每張切片隨機(jī)選擇4個(gè)×400倍鏡下支氣管視野，圖像分析軟件測(cè)定陽性部位的平均吸光度(MOD)，取其平均值作為該樣本的MOD值。(4)肺組織中Notch2、Notch4受體mRNA的檢測(cè):用 Trizol一步法抽提總RNA，然后根據(jù)RT－RCT試劑盒說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增。Notch2上游引物:5'－CAACTGTGAGGTGGACAAAAATG－3'，下游引物:5'－TGTTCATACACGGCTTGGAGATA －3';Notch4上游引物::5'－CACCAGGCTTGGAAGGGAG －3'，下游引物:5'－GAAACCAGGACGGCAGAGG－3';β－actin上游引物::5'－CGGGACCTGACAGACTACCTCAT－3'，下游引物:5'－CCACAGGATTCCATACCCAAGA－3'。以上引物均由上?；瞪锕こ逃邢薰竞铣?。Notch2、Notch4、β－actin的擴(kuò)增片段長度分別為398，353，272。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，用SMART凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行條帶掃描分析，以目的基因與內(nèi)參照(β－actin)的IOD比值作為mRNA表達(dá)的相對(duì)含量。

3．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:用SPSS16．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用Levene'test進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，同一指標(biāo)各組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊者采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊者采用Dunnett'T3檢驗(yàn)，以p＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．各組小鼠HE染色結(jié)果:見圖1。B組小鼠肺組織氣管支氣管周圍炎細(xì)胞浸潤明顯，以中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞為著，C、D組炎細(xì)胞浸潤較B組稍減弱，而A組無炎細(xì)胞浸潤。

2．各組小鼠Notch2蛋白和mRNA表達(dá)的比較:Notch2蛋白于A組主要表達(dá)在支氣管上皮細(xì)胞的胞膜和胞質(zhì)，于B組主要表達(dá)在支氣管上皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的胞核(淋巴細(xì)胞胞質(zhì)少，胞核呈圓形，幾乎占滿了細(xì)胞，通過蘇木素復(fù)染，胞核染成淡藍(lán)色)，B組Notch2受體蛋白和mRNA水平明顯高于A組(P均＜0．01)，C、D組Notch2受體蛋白和mRNA均低于B組(P ＜0．01)，但仍高于 A 組(P ＜0．01)(圖1、圖2、表1)。

圖1 布地奈德、姜黃素對(duì)Notch2受體蛋白表達(dá)的影響(×400)

3．各組小鼠Notch4蛋白和mRNA表達(dá)的比較:Notch4蛋白主要表達(dá)于支氣管上皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞胞膜和胞質(zhì)，4組Notch4受體蛋白和mRNA差異均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0．05(圖3、表2)。

討 論

圖2 布地奈德、姜黃素對(duì)Notch2受體mRNA表達(dá)的影響

表1 各組小鼠肺組織中Notch2蛋白及mRNA表達(dá)的比較(n=8

表1 各組小鼠肺組織中Notch2蛋白及mRNA表達(dá)的比較(n=8

A～D分別為正常對(duì)照、哮喘、布地奈德、姜黃素組;與 A組比較，a p＜0．01，與B 組比較，b P ＜0．01

組別 蛋白mRNA A 0．049 ±0．004 0．041 ±0．007 B 0．104 ±0．005a 0．275 ±0．015a 0．075 ±0．002ab 0．088 ±0．012ab D 0．073 ±0．002ab 0．085 ±0．008 C ab

圖3 布地奈德、姜黃素對(duì)Notch4受體mRNA表達(dá)的影響

表2 各組小鼠肺組織中Notch4蛋白及mRNA表達(dá)的比較(n=

表2 各組小鼠肺組織中Notch4蛋白及mRNA表達(dá)的比較(n=

A～D分別為正常對(duì)照、哮喘、布地奈德、姜黃素組;4組Notch4受體蛋白和mRNA差異均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0．05

組別 蛋白mRNA A 0．121 ±0．004 0．595 ±0．019 B 0．118 ±0．003 0．601 ±0．125 C 0．117 ±0．004 0．606 ±0．145 0．117 ±0．005 0．604 ±0．019 D

Notch家族是目前備受國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的一類跨膜受體家族，在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)有4種Notch受體和5種Notch配體。Notch廣泛存在于多種生物體內(nèi)，參與多種組織細(xì)胞的信號(hào)識(shí)別、增殖、分化和凋亡等功能活動(dòng)，在多種細(xì)胞命運(yùn)的決定中均發(fā)揮著重要作用［1］。越來越多的研究表明，Notch信號(hào)通路在調(diào)節(jié)外周T淋巴細(xì)胞分化過程中起了決定性作用，且不同的Notch受體和配體結(jié)合產(chǎn)生的效應(yīng)可完全不同，這就使得Notch家族愈發(fā)神秘難解［2，8］。但大多數(shù)研究證實(shí)，在細(xì)菌、病毒、TLR配體等Th1誘導(dǎo)因素作用下，抗原呈遞細(xì)胞(APC)表面DLL1或DLL4產(chǎn)生增多，與Notch3受體結(jié)合后可抑制Th2細(xì)胞分化，從而促進(jìn)Th1細(xì)胞分化，而在蠕蟲、過敏原、毒素或前列腺素E2等Th2誘導(dǎo)環(huán)境下，APC表面Jagged1/2配體增多，與 Notch1受體結(jié)合后誘導(dǎo) Th2細(xì)胞分化［8］。而Notch2、Notch4對(duì)外周T淋巴細(xì)胞分化的作用不甚明確，且Kopan等［9］還發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)激活方式較一般的信號(hào)通路不同，激活后通過3次酶切作用，產(chǎn)生縮短的胞內(nèi)段，及NICD，NICD隨即進(jìn)入細(xì)胞核，與靶基因結(jié)合產(chǎn)生一系列的生物學(xué)效應(yīng)。故本研究通過免疫組化染色和RT－PCR觀察Notch2和Notch4受體在Th2型免疫反應(yīng)——哮喘中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Notch2受體蛋白和mRNA在哮喘小鼠肺組織中明顯增高，且Notch2蛋白在哮喘組中主要表達(dá)于支氣管上皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的胞核，而Notch4受體蛋白和mRNA在哮喘小鼠肺組織中的表達(dá)與正常組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明Notch2受體在哮喘小鼠氣道炎癥中發(fā)揮了一定作用，且激活后大部分轉(zhuǎn)移到了核內(nèi)，Notch4則對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥無明顯影響。

布地奈德是一種吸入性糖皮質(zhì)激素，較之全身性皮質(zhì)激素，它局部濃度高，不良反應(yīng)少，是目前控制和緩解哮喘發(fā)作的關(guān)鍵藥物，但它的抗炎機(jī)制目前仍不十分明確，前期研究提示布地奈德可能部分通過Notch1受體發(fā)揮一定的抗炎作用，但它是否對(duì)Notch2受體也有類似的作用呢?姜黃素是從姜黃中提取出來的一種中成藥，眾多研究已證實(shí)，姜黃素具有抗炎、抗氧化、抗纖維化等作用，近期研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可通過抑制NF－κB轉(zhuǎn)錄激活改善過敏性氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性，那么它也可能通過Notch2受體對(duì)哮喘氣道炎癥有一定的作用［4］。

本實(shí)驗(yàn)利用布地奈德和姜黃素干預(yù)哮喘模型，發(fā)現(xiàn)布地奈德組和姜黃素組小鼠肺組織中Notch2受體蛋白和mRNA均比哮喘組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而兩組小鼠肺組織中Notch4蛋白和mRNA表達(dá)與哮喘組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示布地奈德和姜黃素均可部分通過抑制Notch2信號(hào)改善哮喘氣道炎癥［10］。

綜上所述，Notch2信號(hào)在哮喘氣道炎癥過程中也發(fā)揮了一定作用，布地奈德和姜黃素可能部分通過抑制Notch2信號(hào)改善哮喘氣道炎癥，而Notch4對(duì)哮喘氣道炎癥的發(fā)生發(fā)展影響不大。近年來，哮喘的定義在不斷的改進(jìn)改善，哮喘的治療方案也在不斷的演變完善，尋求更有效、不良反應(yīng)更少的治療方案是當(dāng)前醫(yī)務(wù)工作者的首要任務(wù)，深入研究藥物的作用靶點(diǎn)可為以后的聯(lián)合用藥提供更精準(zhǔn)的理論依據(jù)，為進(jìn)一步完善哮喘的治療方案打下基礎(chǔ)。

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