陳 江 肖德雙 吳 樂 蔣佩佩 邵歡義 應(yīng)江輝 朱珊麗 薛向陽 張麗芳 朱冠保

癌胚抗原(CEA)是腫瘤相關(guān)抗原［1］。正常情況下CEA經(jīng)胃腸道代謝，而腫瘤狀態(tài)時的CEA則進(jìn)入血和淋巴循環(huán)，引起血清CEA異常增高。分泌CEA的腫瘤大多位于空腔臟器，如胃腸道、呼吸道、泌尿道等。既往的研究已證實，CEA可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性細(xì)胞和體液免疫，從而抑制體內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長，因此CEA是腫瘤疫苗研究的靶抗原之一。目前，基于CEA的一些細(xì)胞表位已被鑒定，本實驗室也對CEA的B細(xì)胞表位進(jìn)行了分析報道［2～4］。本研究在既往研究基礎(chǔ)上，選擇富含T、B細(xì)胞表位的短肽基因，通過原核表達(dá)系統(tǒng)制備多表位融合蛋白并分析其誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性體液免疫反應(yīng)的特征，為該短肽的進(jìn)一步應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

1．材料:(1)主要試劑:限制性核酸內(nèi)切酶XholⅠ、BamHⅠ、IPTG和預(yù)染蛋白Marker購自MBI公司。6×His－Tag單克隆抗體購自Bethyl公司、HRP－山羊抗小鼠IgG(H+L)及HRP－山羊抗兔IgG(H+L)抗體購自MultiSciences公司。金屬螯合純化試劑盒Ni－NTA購自德國QIAGEN公司。胎牛血清、細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI1640購自美國Gibco公司。弗氏佐劑購自Sigma公司。膜蛋白提取試劑盒(Membrane Protein Extraction kit)購買自上海BestBio生物技術(shù)公司。(2)質(zhì)粒和細(xì)胞株:原核表達(dá)載體pET32a(+)和E．coli BL21(DE3)菌株由本實驗室保存。Lovo細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫。(3)動物:健康日本大耳白兔，雌性，體重1．8～2.4kg，由溫州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。

2．方法:(1)CEA多表位短肽的預(yù)測、篩選:CEA氨基酸序列來自GeneBank公布的數(shù)據(jù)(M17303)。根據(jù)本實驗室已預(yù)測結(jié)果，經(jīng)綜合比較分析，評判確定CEA的B細(xì)胞優(yōu)勢表位，篩選B細(xì)胞表位基因。CTL細(xì)胞表位的預(yù)測應(yīng)用SYFPEITHI超基序法遠(yuǎn)程預(yù)測由9個氨基酸殘基組成的CEA的CTL表位，即利用Intenet網(wǎng)絡(luò)進(jìn)入SYFPEITH I主頁(http://www．uni－tuebingen．de/uni/kxi)介紹的方法，對 CEA 的HLA－A*0201限制性CTL表位及HLA－A24和H2－Kd進(jìn)行遠(yuǎn)程預(yù)測［4，5］。(2)CEA多表位目的基因的獲得:選擇CEA蛋白序列中含有抗原指數(shù)較高的B表位，同時選擇位于B表位上下游的分值較高的HLA－A2，A24及H2－Kd限制性的CTL表位作為多表位的組成成分，共同組成含CTL和B細(xì)胞表位的多表位肽。即篩選CEA氨基酸序列580～598區(qū)域(NRSDPVTLD VLYGPDTPII)的基因進(jìn)行研究。并選取原核系統(tǒng)偏愛的氨基酸密碼子進(jìn)行密碼子優(yōu)化確定核苷酸序列，分別設(shè)計核苷酸的正、反鏈，并在其上、下游引入限制性內(nèi)切酶XhoⅠ(酶切位點為CTC GAG)和BamHⅠ(酶切位點為GGATCC)的酶切位點，其序列如下:正向引物:5'gatc caaccgcagcgatccggtcactttagacgtcttgtatgggcccgatactccgattattc 3';反向引物:5'tcgagaataatcggagt atcgggcccatacaagacgtctaaagtgaccggatcgctgcggttg 3'。上述序列委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。將合成的互補(bǔ)寡核苷酸分別退火，獲得雙鏈的目的基因。(3)CEA多表位基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定:通過XhoⅠ和BamHⅠ酶切位點，將獲得雙鏈的目的基因克隆到pET32a(+)載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a(+)/CEA580～598多表位，并通過測序鑒定。(4)CEA多表位基因重組質(zhì)粒的原核表達(dá)和鑒定:將鑒定后的陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E．coli BL21(DE3)后，接種于LB培養(yǎng)液(100μg/ml Amp)，37℃培養(yǎng)過夜。加入 IPTG(終濃度為1mmol/L)誘導(dǎo)4h，10000×g離心5min收集細(xì)菌。取IPTG誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)4h的菌液，經(jīng)PBS洗滌、離心、超聲破菌，10000×g離心10min收集上清，進(jìn)行SDS－PAGE分析。同時，以小鼠抗6×His單克隆抗體為一抗和HRP－山羊抗小鼠IgG(H+L)為二抗，進(jìn)行Western blotting分析。(5)CEA多表位融合蛋白的的純化:收集誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液，5000×g于4℃離心 10min，收集菌體，pH8．0的 Buffer B(8mol/L尿素，100mmol/L NaH2PO4，10mmol/L Tris－ Cl)重懸，并加入 PMSF至終濃度為1mmol/L，冰浴中超聲破菌、離心后，用Ni－NTA Agarose柱純化、洗脫，收集蛋白峰。(6)Western blotting分析:CEA多表位融合蛋白經(jīng)SDS－PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維膜上，用5%脫脂奶粉－TBST于4℃封閉過夜，漂洗3次后加入1∶5000稀釋的小鼠抗6×His單克隆抗體或1∶200稀釋的免疫兔血清為一抗，37℃震蕩孵育1h，漂洗3次后加入1∶2000稀釋的HRP－山羊抗小鼠 IgG(H+L)或1∶5000稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(H+L)為二抗，再于37℃震蕩孵育1h，漂洗3次后DAB顯色。(7)動物免疫:日本大耳白兔隨機(jī)分為3組，每組3只。分別用純化的CEA多表位融合蛋白、Trx－His(空載載體蛋白)和PBS與等體積福氏佐劑充分混勻進(jìn)行背部皮內(nèi)多點注射免疫?？乖庖邉┝?00微克/只(體積500μl)，隔2周加強(qiáng)免疫，共3次。于末次免疫后第2周心臟采血分離免疫血清。(8)免疫血清特異性抗體ELISA檢測:根據(jù)膜蛋白提取試劑盒(BestBio公司)操作手冊，提取Lovo細(xì)胞的膜蛋白作為天然CEA抗原。分別以純化的CEA多表位融合蛋白抗原(2μg/ml)和天然CEA抗原(Lovo細(xì)胞膜蛋白)(1×107/ml)包被ELISA反應(yīng)板，5%脫脂奶粉封閉，PBST洗滌5次，每孔加入稀釋的兔免疫血清，置37℃ 2h，PBST洗滌5次，每孔加入1∶2000稀釋的HRP－標(biāo)記的100μl山羊抗兔IgG(H+L)，置37℃ 1h，PBST洗板5次后OPD顯色，每孔加入50μl的2mol/L H2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測A490值。每份血清標(biāo)本均重復(fù)3孔檢測，并設(shè)標(biāo)準(zhǔn)陽性對照和陰性對照。

結(jié) 果

1．CEA多表位預(yù)測和篩選結(jié)果:根據(jù)SYFPEITH I法預(yù)測分值均較高(分值＞20)的CTL表位，結(jié)合本實驗室既往B細(xì)胞表位預(yù)測的結(jié)果(NRSDP)，選擇在其序列下游的多個CTL表位序列(PVTLDVLYGPDTPII)，即 CEA580～598(NRSDPVTLDVLYGPDTPII)共同組成CEA多表位目的短肽。其中CEA580～584為預(yù)測的B細(xì)胞表位，CEA589～597為HLA－A2限制性CTL表位，CEA590～598既為 H2－Kd限制性CTL表位又為HLA－A24限制性CTL表位(圖1)。

圖1 CEA580～598短肽表位分布

2．CEA多表位重組質(zhì)粒構(gòu)建和鑒定:將引物退火，得到含CTL、B細(xì)胞表位的目的基因，分別插入經(jīng)XhoⅠ和BamHⅠ酶切純化得到的pET32a(+)質(zhì)粒，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a(+)/CEA580～598。重組質(zhì)粒經(jīng)測序結(jié)果經(jīng)BLAST分析顯示插入的表位基因序列與設(shè)計的堿基序列完全一致(圖2)。

圖2 CEA多表位重組質(zhì)粒測序圖

3．CEA多表位重組質(zhì)粒的表達(dá)及目的蛋白純化和鑒定:轉(zhuǎn)化入E．Coli BL21(DE3)的陽性單克隆菌落經(jīng)終濃度為1mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)和SDSPAGE分析，結(jié)果顯示:IPTG誘導(dǎo)6h后，在分子質(zhì)量約21kDa可見特異性的染色條帶，與預(yù)期融合蛋白的分子質(zhì)量相等(圖3A)，經(jīng)Bandscan軟件分析該蛋白表達(dá)量占總蛋白的25．6%。進(jìn)一步將誘導(dǎo)表達(dá)后的細(xì)菌超聲破碎、離心，取上清通過Ni－NTA Agarose親和層析柱分離純化，以鼠抗His單克隆抗體為一抗，經(jīng)Western blotting檢測，顯示在分子質(zhì)量約21kDa處出現(xiàn)特異性陽性信號條帶，空載體轉(zhuǎn)化的E．Coli BL21(DE3)則在分子質(zhì)量約18kDa處出現(xiàn)特異性陽性信號條帶，未轉(zhuǎn)化的E．Coli BL21(DE3)均未顯示陽性信號條帶(圖3B)。以CEA陽性大腸癌患者血清為一抗，經(jīng)Western blotting檢測，顯示在分子質(zhì)量約21kDa處出現(xiàn)特異性陽性信號條帶，而空載體和未轉(zhuǎn)化的E．Coli BL21(DE3)均未顯示陽性信號條帶(圖3C)。

圖3 純化的CEA多表位融合蛋白SDS－PAGE電泳及Western boltting分析

4．CEA多表位融合蛋白免疫血清抗體效價ELISA分析:CEA580－598融合蛋白以1．0μg/ml濃度包被酶標(biāo)板，采用ELISA法檢測CEA多表位融合蛋白、Trx－h(huán)is和PBS兔免疫血清的抗體效價。CEA多表位融合蛋白免疫血清抗體水平明顯高于Trxhis和PBS對照組(圖4)。

圖4 不同稀釋度CEA多表位融合蛋白免疫血清抗體效價ELISA分析

5．CEA580～598短肽兔免疫血清對天然CEA抗原的反應(yīng):用Lovo細(xì)胞提取的膜蛋白作為包被抗原，ELISA方法檢測末次免疫后2周的CEA580～598兔免疫血清對天然CEA抗原的識別能力，分別以Trx－h(huán)is和PBS免疫兔制備的兔血清抗體為對照。結(jié)果，CEA多表位免疫血清抗體水平(0．390±0．100)顯著高于Trx－h(huán)is對照組(0．045 ±0．030)和 PBS 對照組(0．034 ±0.027)，3組比較具有顯著性差異(P≤0．05)(圖5)。

圖5 ELISA檢測不同免疫組血清對天然CEA抗原的識別

討 論

CEA是最常見的腫瘤標(biāo)志物。文獻(xiàn)報道CEA在胃腸道腫瘤、乳癌、肺癌及大多數(shù)上皮來源的腫瘤患者血清中有不同程度的升高，且血清CEA水平與病程進(jìn)展和復(fù)發(fā)有一定的平行相關(guān)關(guān)系［1，6～8］。因此，CEA是腫瘤診斷和病情監(jiān)測中最常用的一種腫瘤標(biāo)志物。CEA檢測對消化系統(tǒng)惡性腫瘤的早期診斷、療效觀察、提示復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及治療方案的選擇具有較大的參考價值。CEA尤其在大腸癌腫瘤組織中呈高表達(dá)，研究表明，CEA能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞和體液免疫，并可抑制體內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長，因此，CEA是研究大腸癌腫瘤疫苗的候選靶抗原之一，且已經(jīng)進(jìn)入臨床Ⅰ期研究［2，9，10］。但是，由于與 CEA 具有機(jī)體某些蛋白如反應(yīng)蛋白(NCA)和膽汁糖蛋白(BGP)等有共同序列，可能產(chǎn)生交叉廣泛而影響CEA全長蛋白作為疫苗的使用，因此研究者將研究目標(biāo)聚集在CEA的多肽及表位的研究上，即可避免產(chǎn)生自身免疫反應(yīng)，又可產(chǎn)生針對性的特異性免疫反應(yīng)。

Li等［11］選擇CEA氨基酸序列625～667的多肽(CEA625～667)，此段序列含有兩個Th表位，將其單獨及重復(fù)3次串聯(lián)構(gòu)建DNA疫苗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BALB/c經(jīng)此DNA疫苗免疫可產(chǎn)生很強(qiáng)的T細(xì)胞增殖反應(yīng)和血清抗體反應(yīng)，重復(fù)肽則可誘導(dǎo)產(chǎn)生顯著的IFN－γ分泌水平及Th1反應(yīng)。Saha等選擇抗－獨特型的CEA模擬表位(3H1)結(jié)合 HLA－A2限制的 CEA(691～699)和CAP1－6D沖擊DC細(xì)胞，聯(lián)合免疫小鼠，能誘導(dǎo)更強(qiáng)的CEA特異的CTL反應(yīng)和抗瘤效應(yīng)。劉晶等［12］選擇 HLA－A2限制的 CEA605～613表位，在其610位上以天冬氨酸代替天冬酰氨，合成修飾肽(CEA610D)，采用同種異體混合淋巴細(xì)胞與肽共孵育的方法分析其CTL活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，修飾的CEA610D疫苗產(chǎn)生最強(qiáng)的肽特異性CTL活性、CTL所釋放的殺傷相關(guān)介質(zhì)穿孔素和上清中IFN－γ的水平也最高。表明，表位或多肽能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫，為CEA表位及多肽疫苗的研究打下了基礎(chǔ)。

本研究結(jié)合我們既往B細(xì)胞表位預(yù)測結(jié)果，根據(jù)SYFPEITH I法預(yù)測分值均較高(分值 ＞20)的CTL表位，選擇 CEA580～598(NRSDPVTLDVLYGPDTPII)短肽進(jìn)行研究。該短肽包含有CEA B細(xì)胞表位，含多個Th細(xì)胞表位及多個HLA－A2、H2－Kd、HLA－A24限制性的CTL表位，為進(jìn)一步的動物實驗與臨床實驗研究打下了基礎(chǔ)。

為獲得大量含表位肽的蛋白，本研究對 CEA CEA580～598的基因進(jìn)行了大腸桿菌偏好的密碼子優(yōu)化，主要的改變是增加了 GC含量，結(jié)果 CEA CEA580～598在大腸桿菌中獲得了高效表達(dá)，表達(dá)量占總蛋白的25．6%。ELISA法檢測兔免疫血清顯示，日本大耳白兔經(jīng)CEA多表位融合蛋白免疫3次后的免疫血清抗體水平明顯高于trx－His和PBS對照組。Western blotting進(jìn)一步證實兔免疫血清與CEA多表位融合蛋白結(jié)合的特異性。提示，CEA多表位融合蛋白具較強(qiáng)的免疫原性。進(jìn)一步以Lovo細(xì)胞制備的天然CEA抗原包被ELISA板檢測兔免疫血清，結(jié)果顯示，兔免疫血清較對照組血清IgG抗體的效價均值具顯著性差異，表明CEA580～598多表位融合蛋白識別Lovo細(xì)胞制備的天然CEA抗原，可進(jìn)一步用于表達(dá)CEA的腫瘤檢測和免疫學(xué)應(yīng)用的研究。同時，經(jīng)CEA陽性患者血清為一抗的Western blotting檢測分析，表明患者的血清可識別CEA580～598多表位融合蛋白，提示本研究CEA580～598多表位融合蛋白具較強(qiáng)的免疫原性，為進(jìn)一步研究CEA580～598短肽蛋白的功能及研制多表位疫苗打下了基礎(chǔ)。

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