景麗玲 王 欣 陳 虹 張俊文

p75NTR(neurotrophins receptor，p75)屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員，最初被認(rèn)定是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素(neurotrophins，NTs)的“通用”受體，但隨著對(duì)其研究的深入，發(fā)現(xiàn) p75NTR可以和不同的配體，如proNGF、β －淀粉樣肽(beta amyloid，Aβ)以及和共受體，如Trk，NgR及Sortilin等結(jié)合，不僅介導(dǎo)神經(jīng)元的存活、分化、軸突的生長(zhǎng)，還可以介導(dǎo)神經(jīng)元的死亡［1～3］。p75NTR 與 sortilin 作為 proNGF(proneurotrophins)的受體介導(dǎo)細(xì)胞死亡［4］。近年來在神經(jīng)退行性疾病的研究中，p75NTR作為Aβ的受體越來越引起關(guān)注［5～7］。在神經(jīng)退行性疾病動(dòng)物模型中，上調(diào)p75NTR的水平，導(dǎo)致更多的神經(jīng)元凋亡。海馬和大腦皮質(zhì)的膽堿能神經(jīng)元丟失是AD發(fā)病的早期特點(diǎn)，而這些神經(jīng)元都是高表達(dá) p75NTR的［8］。將 Aβ作用于從p75NTR基因敲除小鼠分離得到的海馬神經(jīng)元，與Aβ作用于富含p75NTR的海馬神經(jīng)元相比，Aβ不能引起p75NTR基因敲除的海馬神經(jīng)元的凋亡卻能引起富含p75NTR的海馬神經(jīng)元的凋亡［5］。因此，p75NTR已成為研究治療神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默病等的一個(gè)熱點(diǎn)。

研究顯示，p75NTR是通過胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域和配體結(jié)合，胞內(nèi)區(qū)結(jié)構(gòu)域激活介體(mediators)而發(fā)揮效應(yīng)［9～11］。筆者曾經(jīng)用畢赤酵母成功的表達(dá)過p75NTR194－Fc重組蛋白，但發(fā)現(xiàn)該重組蛋白的純化產(chǎn)物中大部分為其蛋白酶降解產(chǎn)物，氨基端氨基酸順序測(cè)定證實(shí):蛋白酶切位點(diǎn)位于p75NTR 170位氨基酸。因此，本研究中，我們重新表達(dá)了由p75NTR胞外區(qū)1～169位氨基酸構(gòu)成的p75NTR169與人Ig G Fc融合的重組蛋白。該重組蛋白特點(diǎn)為:①保留了p75NTR配體結(jié)合區(qū)，刪除掉蛋白酶解位點(diǎn)，將不再有因?yàn)槊噶旬a(chǎn)生的低分子質(zhì)量p75NTR－Fc融合蛋白;②融合人IgG Fc片段后將延長(zhǎng)重組蛋白半衰期并方便蛋白純化。重組蛋白p75NTR169－Fc的生物活性實(shí)驗(yàn)研究顯示:該重組蛋白能夠抵抗 Aβ(25－35)對(duì)PC12的細(xì)胞毒作用，抑制由NGF刺激引起PC12細(xì)胞軸突的生長(zhǎng)，具有同NGF抗體相同的效果。

材料與方法

1．材料:大鼠PC12嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞系，購自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心，培養(yǎng)液為含有5%馬血清及10%胎牛血清的RPMI 1640(Hyclone公司產(chǎn)品)。大腸桿菌菌株DH5α，用于質(zhì)粒的擴(kuò)增和轉(zhuǎn)化;大腸桿菌菌株BL21(DE3)是pET系列質(zhì)粒表達(dá)的宿主菌，質(zhì)粒pET－28a(+)系蛋白表達(dá)載體，均由本室保存。Aβ(25～35)購自 Sigma公司;純化基質(zhì) HiTrap rProtein A FF購自GE公司;神經(jīng)生長(zhǎng)因子NGF為R＆D公司產(chǎn)品;兔源多克隆抗p75NTR抗體購自ABCAM公司;兔源多克隆抗NGF抗體購自Santa Cruze公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。所有引物及基因測(cè)序由北京奧科生物有限公司完成。

2．方法:(1)p75NTR169的胞外區(qū)、IgG重鏈鉸鏈區(qū)和Fc區(qū)結(jié)構(gòu)域基因的擴(kuò)增和拼接:參考 Gene Bank中已知的p75NTR全序列，用軟件Oligo分析后設(shè)計(jì)如下一對(duì)引物:上游引物:5'－TATACCATGG GCAAGGAGGCATGCCCCACAG－3'(含NcoⅠ識(shí)別位點(diǎn));下游引物:5'－tgg gca tgt gtg agt ttt gtc TGT AAT CCA ACG GCCAGG－3'(小寫字母示IgG鉸鏈區(qū)順序，大寫字母示p75NTR順序)。免疫球蛋白IgG重鏈恒定區(qū)Fc的 DNA片段(216～443)順序源自文獻(xiàn)(Capon．D．et al．Nature，1986，337:525～531)，其上游引物 P216:5'－GAC AAA ACT CACACA TGCCCA C－3'，下游引物P433:5'－ TCGAATTCTCATTTACCCGGAGACAGGGAG－3'(含EcoRⅠ識(shí)別位點(diǎn))。以本組保存的pUC12－NGFR和人肝cDNA為模板，用上述引物分別擴(kuò)增出p75NTR(1～169)，F(xiàn)c(216～433)基因順序，再按照重疊PCR的原則和方法，將兩組擴(kuò)增產(chǎn)物混合變性、復(fù)性后再擴(kuò)增，得到p75NTR(1～169)－Fc(216～433)融合基因，縮寫為p75NTR169－Fc(圖1)。(2)原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a－p75NTR169－Fc的構(gòu)建:將上述融合基因p75NTR169－Fc經(jīng)NcoⅠ、EcoRⅠ酶切和回收，與經(jīng) NcoⅠ、EcoRⅠ酶切的載體pET28a(+)，在T4 DNA連接酶作用下連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，挑選陽性克隆、重組質(zhì)粒酶切鑒定，測(cè)定克隆片段核苷酸序列。(3)重組蛋白p75NTR169－Fc表達(dá)、純化、超濾、除菌及定量:重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主表達(dá)菌BL21(DE3)，涂鋪于含有卡那霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。挑選單菌落接種于含有卡那霉素的2ml LB培養(yǎng)基中，37℃，250r/min振蕩培養(yǎng)過夜，按1∶100的比例接種到含卡那霉素的新 LB培養(yǎng)基中，37℃，250r/min振蕩培養(yǎng)2h，至 OD600在 0．5～1．0之間，加入 IPTG至終濃度為1mmol/L，于不同溫度誘導(dǎo)表達(dá)12～18h。8000r/min離心10min收集菌體，加入細(xì)菌裂解液，超聲破碎，12000r/min離心15min，收集上清和沉淀，SDS－PAGE凝膠電泳及Western blotting檢測(cè)。利用AKTA層析系統(tǒng)以protein A親和層析柱純化樣品，全程低溫操作以防止蛋白降解。上樣前，上清需經(jīng)0．45μm微孔膜過濾。親和層析操作:用結(jié)合緩沖液(20mmol/L PBS，pH 7．0)以1ml/min的流速平衡親和柱;將過濾后的上清樣品以0．6ml/min的流速上樣，再用結(jié)合緩沖液以1ml/min清洗，直至基線，然后用洗脫緩沖液(0．1mol/L glycine－HCl，pH2．5)洗脫，收集洗脫峰，收集管中預(yù)先加入1mol/L，pH9．0 Tris－ HCl 80 ～100μl/ml。將純化后的樣品倒入超濾管中，4℃離心30min，轉(zhuǎn)速不超過6000r/min，將蛋白樣品壓縮至約5ml，加入PBS離心，重復(fù)2～3次，逐步更換緩沖液。0．22μm微孔膜過濾除菌，BCA方法定量，小量分裝，－80℃保存。(4)重組蛋白p75NTR169－Fc基于細(xì)胞的功能實(shí)驗(yàn):1)重組蛋白p75NTR169－Fc干預(yù)β－淀粉樣肽Aβ(25～35)對(duì)PC12細(xì)胞毒的作用:以100μl，約1×104細(xì)胞/孔將PC12細(xì)胞接種在96孔板中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后分別進(jìn)行如下分組處理，A組:24h后，以1∶10體積加入終濃度為10μmol/L、5μmol/L、1μmol/L Aβ(25～35)作用細(xì)胞 24h，不含 Aβ(25 ～35)的為對(duì)照組;B組:24h后，以1∶10體積加入p75NTR169－Fc融合蛋白，終濃度為 1.2μmol/L、0.9μmol/L、0.6μmol/L、0.3μmol/L、0.1μmol/L，0μmol/L;C 組:24h 后，以1∶10體積加入終濃度5μmol/L Aβ(25～35)與不同濃度的p75NTR169－Fc(分別為 0、0．1、0．3、0．6、0．9、1．2μmol/L)。每組設(shè) 5 個(gè)平行孔，24h后進(jìn)行MTT檢測(cè)。2)p75NTR169－Fc重組蛋白阻止NGF引起的PC12細(xì)胞分化:以100微升/孔，約5×103細(xì)胞/孔接種PC12細(xì)胞于96孔板中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁約24h后，以1∶10體積加入終濃度50ng/ml的NGF與不同濃度的NGF抗體或 p75NTR169 － Fc(分別為 0、12．5、50、100ng/ml)，設(shè)100ng/ml的p75NTR169－Fc及正常培養(yǎng)的PC12細(xì)胞為對(duì)照組，每組3個(gè)平行孔。48h后每組隨機(jī)選取視野拍照。(5)Aβ(25～35)的準(zhǔn)備:1mg的Aβ(25～35)用高壓滅菌的去離子水溶解配成終濃度200μmol/L，－20℃存放。使用前在37℃溫育24h。

3．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS18．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，P ＜0．05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．重組蛋白基因的獲得、在原核中的誘導(dǎo)表達(dá)及親和純化:p75NTR包括胞外區(qū)(extracellular domain，ECD)、莖區(qū)、跨膜區(qū)(transmembrane，TM)、胞內(nèi)區(qū)(intracellular domain，ICD)4 區(qū)(圖 1A)，p75NTR194－Fc含有170位氨基酸的蛋白酶裂位點(diǎn)(圖1B)，而p75NTR169－Fc保留了完整胞外區(qū)和部分莖區(qū)的共169個(gè)氨基酸，是由人IgG的鉸鏈區(qū)鏈接Fc段融合而成，該重組蛋白不含有p75NTR 170位氨基酸以后順序(圖1C)。

圖1 抗酶裂嵌合體p75NTR169－Fc的設(shè)計(jì)

按照重疊PCR的原則和方法，將兩組擴(kuò)增產(chǎn)物混合變性、復(fù)性后再擴(kuò)增，得到預(yù)期大小(1188bp)p75NTR169－Fc融合基因，如圖2A。融合基因插入到表達(dá)載體pET28a(+)后，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切及DNA測(cè)序證實(shí)片段的大小、堿基序列和讀碼框正確。表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，SDS－PAGE電泳，發(fā)現(xiàn)在約50kDa大小處有一特異表達(dá)條帶，見圖2B。為進(jìn)一步驗(yàn)證箭頭所指條帶為p75NTR169－Fc重組蛋白。經(jīng)anti－IgG抗體及anti－p75NTR抗體進(jìn)行Western blotting鑒定，50kDa特異條帶確實(shí)為重組蛋白，見圖2C。從圖2B可見，蛋白的可溶性表達(dá)在25℃及37℃沒有明顯差異，所以在以后試驗(yàn)中，我們選擇室溫條件(約25℃)誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)菌裂解上清液經(jīng)protein A親和層析柱純化，將分步收集到的蛋白進(jìn)行SDS－PAGE電泳，銀染鑒定，如圖2D，可見純化后雜蛋白較少，凝膠掃描純度分析所得產(chǎn)品純度可達(dá)到96%。

圖2 重組蛋白基因的獲得、在原核中的誘導(dǎo)表達(dá)、Western blotting鑒定及親和純化

2．p75NTR169－Fc重組蛋白抑制 Aβ(25～35)寡聚肽對(duì)PC12的細(xì)胞毒作用:根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，Aβ通過p75NTR促進(jìn)細(xì)胞的凋亡［5～8］。本研究中，我們通過MTT檢測(cè)Aβ(25～35)寡聚肽對(duì)PC12的細(xì)胞毒性，發(fā)現(xiàn) PC12 暴露于 10μmol/L 和 5μmol/L Aβ(25～35)24h后，細(xì)胞活性顯著下降，與不加 Aβ(25～35)的對(duì)照組相比，Aβ(25～35)引起的細(xì)胞凋亡有顯著性差異(10μmol/L，5μmol/L:P ＜0．05)，如圖3A;單加0．1～1．2μmol/L的 p75NTR169－Fc重組蛋白對(duì)PC12細(xì)胞活性沒有明顯的影響(P＞0.05)，如圖3B;如加入5μmol/L的 Aβ(25～35)，同時(shí)又加入不同濃度的p75NTR169－Fc，與只加5μmol/L Aβ(25～35)的對(duì)照組相比，0．6μmol/L 至 1.2μmol/L p75NTR169－Fc均能抑制Aβ(25～35)引起的細(xì)胞凋亡，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0．05)，如圖3C。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上，證明p75NTR169－Fc對(duì) Aβ(25～35)寡聚肽引起的PC12細(xì)胞毒性有抑制作用。

圖3 p75NTR169－Fc重組蛋白抑制Aβ(25～35)寡聚肽對(duì)PC12細(xì)胞的毒性作用

3．p75NTR169－Fc重組蛋白能夠中和NGF引起的PC12細(xì)胞分化:NGF與p75NTR及TrkA結(jié)合可以促進(jìn)細(xì)胞的分化，NGF抗體與NGF結(jié)合阻止其與受體相互作用。PC12細(xì)胞易分化，表現(xiàn)為細(xì)胞從圓形的半貼壁變?yōu)槎噙呅位蝈F形的貼壁細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)中，與只加培養(yǎng)基的對(duì)照組相比(圖4B或圖4C)，加入NGF可以明顯的引起PC12細(xì)胞體積變大并產(chǎn)生神經(jīng)突起，長(zhǎng)度可以達(dá)到細(xì)胞直徑的3倍，如圖4A;加入NGF與不同濃度的NGF抗體后，可以觀察到NGF引起的PC12細(xì)胞分化受到不同程度的抑制，如圖4D～F;加入 NGF與不同濃度的重組蛋白p75NTR169－Fc后，也可以觀察到NGF引起的PC12細(xì)胞分化受到明顯的抑制，如圖4G～I(xiàn)。

圖4 p75NTR169－Fc重組蛋白對(duì)NGF引起的PC12細(xì)胞分化的影響 (×100，48h)

討 論

β－淀粉樣肽［Aβ(40～42)］是一種神經(jīng)毒性多肽，在AD病變中起到了主導(dǎo)作用［13］。它的低聚物是Aβ最強(qiáng)毒性形式，導(dǎo)致AD患者突觸傳導(dǎo)中神經(jīng)元死亡、神經(jīng)炎性病變和功能障礙［14］。腦中 Aβ的水平，是通過淀粉樣前體蛋白(APP)分解產(chǎn)生的，正常生理狀態(tài)下，新產(chǎn)生的Aβ與經(jīng)過酶降解和運(yùn)輸清除掉的Aβ維持在一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡水平［15］。在神經(jīng)退行性疾病的細(xì)胞研究模型中，上調(diào)或通過配體激活p75NTR 都 可 以 導(dǎo) 致 神 經(jīng) 元 的 死 亡［8］。Aβ 與p75NTR結(jié)合后，其胞內(nèi)區(qū)激活下游信號(hào)分子如JNK，NF－κB等以及介導(dǎo)tau蛋白磷酸化，最終介導(dǎo)細(xì)胞死亡［1］?；谏鲜鲋饕碚?，我們?cè)O(shè)計(jì)并在原核系統(tǒng)中成功的表達(dá)了重組蛋白p75NTR169－Fc，期望其類似p75NTR游離受體的活性能夠結(jié)合Aβ并抵抗其毒性作用，為AD治療開辟新途徑。

重組人抗酶裂嵌合體蛋白p75NTR169－Fc保留了p75NTR完整的胞外區(qū)和莖部9個(gè)氨基酸，去掉了易受蛋白酶攻擊的部分，使其不再被蛋白酶降解而提高了重組蛋白的穩(wěn)定性，我們之前表達(dá)的重組蛋白p75NTR194－Fc穩(wěn)定性差，極易被蛋白酶降解［16］;在p75NTR169－Fc羧基端融合了IgG的Fc段，方便了蛋白純化。在重組DNA設(shè)計(jì)時(shí)，通過合理使用質(zhì)粒本身的酶切位點(diǎn)，目的蛋白不帶有任何標(biāo)簽。經(jīng)凝膠掃描純度分析顯示終產(chǎn)品純度可達(dá)96%，為研究其活性提供了保證。此外Fc段蛋白的融合也為延長(zhǎng)重組蛋白的半衰期提供了可能性。

Aβ(25～35)保留了Aβ全長(zhǎng)的毒性，常用于Aβ的毒性研究。我們通過MTT法研究Aβ(25～35)對(duì)p75NTR陽性的PC12的細(xì)胞毒作用，表明10μmol/L、5μmol/L Aβ(25～35)作用24h可以明顯殺傷 PC12細(xì)胞。而重組蛋白p75NTR169－Fc可以有效地抑制Aβ(25～35)引起的細(xì)胞毒性。有趣的是，在本研究中，重組蛋白p75NTR169－Fc的濃度600nmol/L比5μmol/L Aβ(25～35)低近10倍的情況下，仍可有效地與p75NTR競(jìng)爭(zhēng)，可能與該重組蛋白氨基端的p75NTR的胞外區(qū)(ECD)對(duì)Aβ的高親和力結(jié)合有關(guān)。

為了更好地研究重組蛋白p75NTR169－Fc與配基結(jié)合的生物學(xué)活性，我們通過PC12細(xì)胞軸突生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)重組蛋白可以抑制NGF引起的軸突生長(zhǎng)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，p75NTR與trkA受體介導(dǎo)NGF引起的軸突生長(zhǎng)和突觸連接［2］。在我們的實(shí)驗(yàn)中，50ng/ml的NGF刺激PC12細(xì)胞軸突生長(zhǎng);同時(shí)加入NGF與NGF抗體或者重組蛋白p75NTR169－Fc，與只加NGF相比，神經(jīng)軸突明顯變短、數(shù)量變少，隨著NGF抗體或者重組蛋白p75NTR169－Fc劑量的增加，抑制軸突生長(zhǎng)的程度更加明顯。毋庸置疑，NGF抗體是通過競(jìng)爭(zhēng)游離的NGF，而減少NGF與受體相互作用的機(jī)會(huì)，而重組蛋白p75NTR169－Fc保留了和配體結(jié)合的胞外結(jié)構(gòu)域，理論上講，其可以和NGF結(jié)合，但由于其不含傳遞細(xì)胞外信號(hào)的跨膜區(qū)和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，所以重組蛋白p75NTR169－Fc和p75NTR競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合 NGF，而不能發(fā)揮刺激軸突生長(zhǎng)的功能。proNGF是NGF未經(jīng)蛋白酶切割的前體，也是NGF在AD中存在的主要形式。有研究表明，proNGF通過p75NTR抑制神經(jīng)軸突的生長(zhǎng)。p75NTR169－Fc作為新型重組蛋白，與p75NTR競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合配體，有望在AD的治療中，除了結(jié)合Aβ也能結(jié)合proNGF而發(fā)揮一箭雙雕的作用。

針對(duì)p75NTR為藥物靶點(diǎn)的研究，不少研究者做了很多的工作，如Yaar M等合成的NGFβ發(fā)夾環(huán)類似物可以和Aβ競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合p75NTR，從而保護(hù)神經(jīng)元免受Aβ介導(dǎo)的毒性作用，而我們構(gòu)建的重組蛋白p75NTR169－Fc與p75NTR競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Aβ，同樣是為了保護(hù)神經(jīng)元免受Aβ的毒性作用。盡管該工作還有待更深一步的研究，但重組人抗酶裂嵌合體蛋白p75NTR169－Fc是一個(gè)有生物活性的新型抗凋亡蛋白，有可能為阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病的治療開辟了又一途徑。

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