陳聰?shù)?吳碎春 王 浩 陳肖鳴 張 華

自20世紀(jì)70年代Folkman提出血管生成抑制療法以來，目前已發(fā)現(xiàn)了多種血管生長抑制因子，特別是近幾年抗血管生成治療發(fā)展迅速。血管內(nèi)皮抑制素(endostatin，ES)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的強(qiáng)效血管生成抑制因子，由于ES特異性地靶向作用于增生的內(nèi)皮細(xì)胞，對轉(zhuǎn)移性腫瘤和原發(fā)性腫瘤的種植瘤均有顯著的抑制作用。但目前國內(nèi)針對兒童生殖細(xì)胞腫瘤的抗血管治療研究甚少，幾乎未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用國內(nèi)首次建立的卵黃囊瘤移植瘤模型為實(shí)驗(yàn)對象，對內(nèi)皮抑素的抗腫瘤作用進(jìn)行深入研究［1］。

材料與方法

1．材料:(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及標(biāo)本:裸鼠BALB/C(nu/nu)小鼠40只，雌雄各半，3～4周齡，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。飼養(yǎng)于溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級實(shí)驗(yàn)室。腫瘤標(biāo)本來源于小兒卵黃囊瘤荷瘤鼠第17代模型。已對荷瘤鼠腫瘤鑒定，證實(shí)保留原腫瘤生物學(xué)特性［1，2］。(2)主要試劑:重組人血管內(nèi)皮抑制素注射液15毫克/(3毫升·支)，避光保存于4℃冰箱，移液器量取，加入醫(yī)用生理鹽水，配制成溶液，濃度為 0．06mg/ml及 0．03mg/ml，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2．方法:(1)動(dòng)物模型建立:對荷瘤鼠第17代腫瘤生物學(xué)性質(zhì)再次鑒定，證實(shí)具有良好的原腫瘤生物學(xué)特性。按照陳聰?shù)碌龋?，2］人移植瘤模型建立的方法，把第17代腫瘤移植在40只雄性裸鼠單側(cè)腹股溝皮下區(qū)。(2)成瘤模型分組:裸鼠按照高劑量組 1．5mg/(kg·d)、低劑量組 0．75mg/(kg·d)、實(shí)驗(yàn)對照組、空白對照組分組后開始重組人血管內(nèi)皮抑制素注射液藥物干預(yù)，每日測量裸鼠重量并記錄，依照測得體重?cái)?shù)據(jù)，計(jì)算用藥量。實(shí)驗(yàn)對照組注射醫(yī)用生理鹽水25ml/(kg·d)，空白對照組不予干預(yù)。于實(shí)驗(yàn)第7天開始干預(yù)，注射部位為腫瘤皮下及瘤內(nèi)。每日定時(shí)注射藥物，連續(xù)給藥14天。(3)腫瘤生長測量:定期觀察腫瘤生長情況，記錄腫瘤生長的潛伏期和腫瘤生長速度，當(dāng)腫瘤直徑達(dá)3mm時(shí)，定人每隔5天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的最大直徑a及橫徑b，按公式V=π/6 ×a×b2計(jì)算腫瘤體積。取第 1、3、6、9、12、15 天腫瘤體積進(jìn)行各組間點(diǎn)差異的比較。(4)免疫組化標(biāo)記:雌性裸鼠各組5只，頸椎脫臼法處死，迅速剝離腫瘤，4℃生理鹽水沖洗，觀察腫瘤標(biāo)本大體形態(tài)(表面及切面顏色、有無壞死灶)，4%多聚甲醛固定液固定，石蠟包埋，連續(xù)切片。免疫細(xì)胞化學(xué)步驟參照SP試劑盒提供的說明書進(jìn)行，AFP、CD34、VEGF的一抗?jié)舛染鶠?∶100。用Image－pro plus軟件進(jìn)行圖像分析。隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)免疫組化陽性細(xì)胞數(shù)及測定陽性細(xì)胞的光密度。將兩項(xiàng)數(shù)據(jù)相乘即為所測樣本的免疫組化染色的相對定量結(jié)果(expression value，OD)。用CD34來計(jì)算血管密度(microvessel density，MVD)，對腫瘤的新生血管形成進(jìn)行量化。(5)腫瘤血管造影:1)藥物干預(yù)完成后，每組取雄性裸鼠各5只，4%水合氯醛溶液12ml/kg腹腔注射麻醉，沿胸骨左緣打開胸腔，剪開心包膜，暴露心尖部，心尖部穿刺，明膠－氧化鉛懸濁液75ml/kg灌注，至裸鼠鼻尖、趾緣、尾尖、虹膜及腫瘤表層血管變色產(chǎn)生橘紅色斑片狀，清潔裸鼠體表，4℃冷藏過夜以便明膠凝集。2)球管至臺(tái)面的高度為102cm，曝光時(shí)間為0．25s，電流為100mA，電壓為45V，X線拍片。3)拍片后以Image－Pro Plus圖像分析軟件計(jì)算腫瘤血管網(wǎng)平面面積，計(jì)算面積比率，面積比率=腫瘤血管網(wǎng)平面面積/腫瘤平面面積，對面積比率進(jìn)行各組間比較。

3．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:全部數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，多組間比較用單因素多重方差分析，組間兩兩比較方差齊者用LSD檢驗(yàn)，方差不齊者用Dunnett'T3檢驗(yàn)，取α=0．05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，以p＜0．05為差異具有顯著性，p＜0．01為差異具有高度顯著性。

結(jié) 果

1．各組腫瘤生長狀況:裸鼠移植腫瘤組織后1周，全部接種成功，瘤體開始生長(圖1)。給藥第1天(即分組后)及第3天測量各組間腫瘤體積均無明顯差異(F=0．567，P ＞0．05)，自第 6 天測量內(nèi)皮抑素治療組，腫瘤生長受到明顯抑制，腫瘤生長速度明顯低于對照組(F=14．254，P ＜0．01);第12天測量結(jié)果提示高劑量組與低劑量組腫瘤體積出現(xiàn)顯著差異(F=12．989，P ＜0．01)，實(shí)驗(yàn)對照組與空白對照組比較，各時(shí)間點(diǎn)腫瘤體積測量結(jié)果均無差異。至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，內(nèi)皮抑素高劑量治療組，平均腫瘤抑制率隨治療時(shí)間的推移持續(xù)增長，最高抑瘤率為第15天測得49%，明顯高于低劑量治療組及實(shí)驗(yàn)對照組;低劑量治療組腫瘤抑制率曲線稍有波動(dòng)，最高抑瘤率為第15天測得31%;實(shí)驗(yàn)對照組腫瘤抑制率低，且呈下降趨勢，與高劑量組及低劑量組差異明顯(F=15．147，p＜0．01)，不同劑量間腫瘤抑制率存在差異(F=9.628，P ＜0．05)(表1)。

圖1 第18代卵黃囊瘤移植瘤模型

表1 各實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積測量結(jié)果(mm3)

2．免疫組化結(jié)果:各實(shí)驗(yàn)組腫瘤切片中均可見不同程度的AFP表達(dá)(圖2)，AFP定位于胞質(zhì)，染色陽性者呈黃棕色，細(xì)胞核及周圍細(xì)胞間質(zhì)無AFP表達(dá)處，蘇木素染色呈藍(lán)色。CD34表達(dá)，從高劑量、低劑量、實(shí)驗(yàn)對照、空白對照的 OD 值為 7．24±4．01、12.28 ±5．59、22．32 ±3．75、22．52 ± 3．06，高劑量組MVD值明顯低于低劑量組(F=18．852，P ＜0．01)及兩對照組(F=20．198，P ＜0．01)，低劑量組 MVD 值低于兩對照組(F=11．323，P ＜0．01)，兩對照組之間無明顯差別(F=1．658，P ＞0．05)(圖 3)。各實(shí)驗(yàn)組從高劑量、低劑量、實(shí)驗(yàn)對照、空白對照的VEGF的OD 值為 12．40 ± 3．25、9．50 ± 3．12、7．08 ± 2．93、7.48±2．39，表達(dá)強(qiáng)度上，兩對照組均較強(qiáng)且之間無明顯差別(F=1．459，P ＞0．05)，低劑量組弱于實(shí)驗(yàn)對照組(F=11．225，P ＜0．05)，強(qiáng)于高劑量組(F=15．978，P ＜0．01)(圖4)。

圖2 移植瘤組織AFP表達(dá)(×400)

3．腫瘤血管明膠－氧化鉛造影:荷瘤裸鼠血管灌注并拍片后，由X線片可以發(fā)現(xiàn)經(jīng)藥物干預(yù)的組別，腫瘤內(nèi)部未見明顯的壞死空腔，兩個(gè)對照組個(gè)別腫瘤內(nèi)部可以見到偏心性壞死空腔。腫瘤周邊部位正常血管。各實(shí)驗(yàn)組腫瘤血管面積比率:高劑量組0．36±0．12、低劑量組 0．49 ±0．04、實(shí)驗(yàn)對照組 0．69 ±0.07、空白對照組0．65±0．12。治療組與對照組之間存在顯著差異(F=12．989，P ＜0．01)，兩治療組之間存在差異(F=1．275，P ＜0．05)。

討 論

睪丸生殖細(xì)胞腫瘤的發(fā)生率在過去的40年里增加了2倍，達(dá)7．5/10萬人［1］。而兒童生殖細(xì)胞腫瘤占小兒睪丸腫瘤的60% ～75%，其中以卵黃囊瘤最多。我們首次在國內(nèi)建立了卵黃囊瘤裸小鼠移植瘤模型，并通過對其生物學(xué)特性的鑒定，已經(jīng)成功應(yīng)用于對卵黃囊瘤的抗腫瘤研究［2］。本次研究選取卵黃囊瘤模型，為血管密度高、血運(yùn)豐富的惡性實(shí)體瘤，而且血道轉(zhuǎn)移較多，目前國內(nèi)尚無針對該瘤血管治療的相關(guān)報(bào)道。

自20世紀(jì)70年代Folkman提出血管生成抑制療法以來，發(fā)現(xiàn)了很多具有血管抑制活性的藥物，由其是近幾年抗血管生成治療發(fā)展迅速［3～5］。針對血管內(nèi)皮細(xì)胞的抗血管生成療法具有針對腫瘤細(xì)胞的化療所不可比擬的優(yōu)越性，腫瘤細(xì)胞具有基因突變性，因而化療容易產(chǎn)生耐藥性且不良反應(yīng)大，而腫瘤內(nèi)的血管具有基因的相對穩(wěn)定性，因而不易耐藥，重復(fù)給藥有效。而血管內(nèi)皮抑制素(endostatin，ES)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的強(qiáng)效血管生成抑制因子，可通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞增生和遷移、拮抗腫瘤新生血管生成，阻斷腫瘤血液供應(yīng)，抑制腫瘤生長而使其進(jìn)入“休眠狀態(tài)”并導(dǎo)致凋亡［6，7］。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，ES顯示出強(qiáng)大的特異性抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用，由于ES特異性地靶向作用于增生的內(nèi)皮細(xì)胞，對轉(zhuǎn)移性腫瘤和原發(fā)性腫瘤的種植瘤均有顯著的抑制作用，一般不會(huì)誘發(fā)骨髓抑制和胃腸道反應(yīng)等化療藥物常表現(xiàn)出的不良反應(yīng)［8～11］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，腫瘤組織中VEGF含量，高劑量組＜低劑量組＜實(shí)驗(yàn)對照組≈空白對照組。關(guān)于ES對VEGF的影響機(jī)制仍不十分清楚，Hohenester等［12］的研究認(rèn)為內(nèi)皮抑素可能是與bFGF和VEGF競爭細(xì)胞表面的硫酸肝素黏蛋白類，阻擋有絲分裂生長因子的信號傳導(dǎo)，抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖，并阻止內(nèi)皮細(xì)胞移向bFGF，從而抑制血管生成。目前較肯定的信號傳導(dǎo)通路有:通過抑制EGFR、Raf－Ras－MEK－MAPK、STAT3和PI3K－AKT等信號傳導(dǎo)途徑下調(diào)VEGF［13］;通過Thrombin受體啟動(dòng)PAR －1和PAR －2通路，下調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)，從而減少其產(chǎn)生;影響內(nèi)皮細(xì)胞上一氧化氮合成酶的活性，減少VEGF誘導(dǎo)的一氧化氮的生成，從而抑制了VEGF介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管的形成。ES可能通過上述或者尚未知的途徑對腫瘤組織內(nèi)的VEGF起作用，從而減少其在腫瘤組織中的含量，進(jìn)而抑制新生卵黃囊瘤血管發(fā)生及進(jìn)展，但具體機(jī)制仍需后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)。

本實(shí)驗(yàn)首次選擇明膠－氧化鉛懸濁液作為造影劑應(yīng)用于卵黃囊瘤裸鼠移植瘤模型。氧化鉛是解剖標(biāo)本血管灌注造影最常用的造影劑之一，管徑0.1mm的動(dòng)脈也可以清晰顯影，造影效果保留相對之間較長可以反復(fù)拍片觀察，并且操作簡便，價(jià)格低廉，適用腫瘤血管的觀察。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果非常直觀地顯示，經(jīng)內(nèi)皮抑素干預(yù)后，腫瘤體積明顯小于未經(jīng)干預(yù)者，腫瘤內(nèi)血管管徑較小，血管分布范圍及密度低，面積比率高劑量組＜低劑量組＜實(shí)驗(yàn)對照組≈空白對照組。也驗(yàn)證了內(nèi)皮抑素抗血管生成治療的靶點(diǎn)是新生的卵黃囊瘤血管的觀點(diǎn)。

通過研究筆者發(fā)現(xiàn)，ES抑制卵黃囊瘤VEGF的生成，減少其對血管內(nèi)皮的作用，從而減少血管生成，從而抑制卵黃囊瘤裸鼠移植瘤的生長。為卵黃囊瘤的臨床抗血管生成治療提供有效的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 陳聰?shù)拢愋Q．順鉑誘導(dǎo)體外培養(yǎng)兒童睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制研究［J］．中華小兒外科雜志，2009，30(7):423－426

2 陳聰?shù)?，陳肖鳴．卵黃囊瘤裸鼠移植瘤模型的建立及其生物學(xué)特性的研究［J］．中華小兒外科雜志，2010，30(3):176－179

3 Folkman J．Antiangiogenic gene therapy ［J］．Proc Natl Acad Sci USA，1998，95(16):9064－ 9066

4 Kong HL，Crystal RG．Gene therapy strategies for tumor antiangiogenesis［J］．Natl Cancer Inst，1998，90(4):273 － 286

5 Cao Y．Endogenous angiogenesis inhibitors:angiostatin，endostatin，and other proteolytic fragments［J］．Prog Mol Subcell Biol，1998，20:161－176

6 Perletti G，Concari P，Giardini R，et al．Antitumor activity of endostatin against carcinogen－induced rat primary mammary tumors［J］．Cancer Res，2000，60(7):1793－ 1796

7 Ziche M，Donnini S，Morbidelli L，et al．Development of new drugsin an giogenesis［J］．Curr Drug Targets，2004，5:485

8 Luo X，Slater JM，Gridley DS．Enhancement of radiation effects by pXLG － mEndo in a lung carcinoma model［J］．Int JRadiat Oncol Biol Phys，2005，63(2):553－ 564

9 Bloch W，Huggel K，Sasaki T，et al．The angiogenesis inhibitor endostatin impairs blood vessel maturation during wound healing［J］．FASEB J，2000，14(15):2373－ 2376

10 Abraham D，Abri S，Hofmann M，et al．Low dose carboplatin combined with angiostatic agents prevents metastasis in human testicular germ cell tumor xenografts［J］．JUrol，2003，170(4 Pt 1):1388 －1393

11 Scharovskyo G，Binda MM，Rozados VR，et al．An giogenic andantian giogenic balance regulates concomitant antitumoral resistance［J］．Clin Exp Metastasis，2004，21:177

12 Hohenester E，Sasaki T，Olsen BR，et al．Crystal structure of the angiogenesis inhibitor endostatin at 1．5 A resolution ［J］．Embo J，1998，17(6):1656－1664

13 Kuhn H，Hammerschmidt S，Wirtz H．Targeting tumorangiogenesis in lung cancer by suppression of VEGF and it s receptor－results from clinical trials and novel ecperimental approaches［J］．Curr Med Chem，2007，14(30):3157－3165