史曉紅 孫 亮 王 瀝 金 鋒 朱小泉 唐 雷 楊 澤

瘦素受體(leptin receptor，Lepr)屬細(xì)胞因子受體超家族，人類Lepr基因定位于染色體1p31。Lepr基因是T2DM的一個(gè)重要候選易感基因，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種Lepr基因的多態(tài)性，Lepr基因的多態(tài)性對(duì)T2DM的影響日益受到關(guān)注。本文旨在研究Lepr基因第6外顯子內(nèi)的Gln223Arg多態(tài)性與中國北方人T2DM發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

材料與方法

1．實(shí)驗(yàn)材料:(1)對(duì)象:所有研究對(duì)象選自2004～2005年北京地區(qū)和哈爾濱地區(qū)T2DM流行病學(xué)調(diào)查資料，本研究中病例樣本為:有糖尿病家族史，且相互間無親緣關(guān)系的T2DM患者333例，其中男性120例，女性213例，年齡40～89歲，平均年齡60．61±11．05歲。對(duì)照樣本為:無糖尿病家族史的糖耐量正常者，無急性心腦血管疾病、內(nèi)分泌疾病，且相互間無親緣關(guān)系，共395例。其中男性181例，女性214例;患者年齡40～80歲，平均年齡47．50±6．25歲。所有受試者均為漢族人，均簽署了知情同意書。T2DM診斷依據(jù)1999年WHO診斷標(biāo)準(zhǔn):①有明確糖尿病病史;②空腹血漿葡萄糖≥7.0mmol/L和(或)口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)2h血糖≥11．1mmol/L。根據(jù)病史和家族史排除1型糖尿病、年輕起病的成人型糖尿病及線粒體性糖尿病。(2)主要試劑:全血DNA提取試劑盒購自北京天為時(shí)代科技有限公司;DNA marker購自天根生化科技(北京)有限公司;引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成;限制性內(nèi)切酶Msp I購自TaKaRa公司;dNTP，Taq酶購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司。(3)主要儀器:PCR擴(kuò)增儀為美國MJ公司的PTC－225型PCR儀;凝膠成像系統(tǒng)為美國Bio－Rad公司的Gel DOC－2000成像系統(tǒng)。

2．方法:(1)基因組DNA的提取:取EDTA Na2抗凝的外周血0．3ml，用全血DNA提取試劑盒抽提基因組DNA。(2)PCR－RFLP分析 上游引物:5'－ACCCTTTAAGCTGGGTGTCCCAAATAG－3'，下游引物:5'－ AGCTAGCAAATATTTTTGTAAGCAATT－3'。PCR反應(yīng)體系為20μl，其中包含10×PCR buffer 2μl，10mmol/L dNTP 0．4μl，引 物 (10pmol/μl)各0.4μl，Taq 酶(2．5U/μl)0．4μl，基因組 DNA(10ng/μl)2μl。擴(kuò)增條件為95℃ 預(yù)變性5min;95℃ 變性 30s、64．1℃ 退火30s、72℃ 延伸30s，共35個(gè)循環(huán)，完成后72℃延伸7min。擴(kuò)增產(chǎn)物用8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，Bio－Rad凝膠成像系統(tǒng)成像。PCR產(chǎn)物用Msp I酶進(jìn)行消化，反應(yīng)體系10μl，包含 Msp I(10U/μl)0．3μl、10 × buffer 1μl、0．1%BSA 1μl、PCR產(chǎn)物6μl，37℃酶切過夜，取4μl酶切產(chǎn)物用8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)成像，觀察結(jié)果。

3．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均采用SPSS11．5軟件完成。以Hardy－Weinberg平衡判斷樣本的代表性。相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)用比數(shù)比(OR)值及其95%置信區(qū)間(95%CI)來評(píng)價(jià)。組間基因型頻率及等位基因頻率比較采用χ2檢驗(yàn)，以p＜0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

結(jié) 果

1．T2DM病例組與正常對(duì)照組一般特征比較:T2DM病例組與正常對(duì)照組相比，不僅表現(xiàn)為臨床上血糖、血脂等指標(biāo)的變化，其他身體特征和功能也與正常人群有一定的差異。包括T2DM病例組具有顯著高的體質(zhì)量指數(shù)(BMI)，腰臀比，腰圍，總膽固醇和三酰甘油。

2．基因型分析:包含Lepr基因第6外顯子 Gln 223 Arg多態(tài)性的PCR產(chǎn)物長度為421bp，此多態(tài)性位點(diǎn)可被限制性內(nèi)切酶Msp I識(shí)別。AA基因型不能被Msp I識(shí)別，GG基因型可被Msp I切割，可見294和127bp兩條帶;因此酶切后不同基因型的電泳帶型分別為:AA(421bp)，AG(421bp，294bp，127bp)，GG(294bp，127bp)(圖 1)。

圖1 Lepr基因第6外顯子Gln23Arg變異基因分型圖片1，2，4，5，7，11．GG 型;3，6，9．AG型;8，10．AA 型

T2DM組和正常對(duì)照組基因型頻率經(jīng)Hardy－Weinberg擬合優(yōu)度檢驗(yàn)，均符合Hardy－Weinberg平衡(P＞0．05)，表明此基因各基因頻率已達(dá)遺傳平衡，所選擇的T2DM和正常對(duì)照樣本均具有群體代表性。T2DM組和正常對(duì)照組間Lepr基因第6外顯子Gln223Arg多態(tài)性基因型與等位基因頻率的比較見表1。

表1 Lepr基因第6外顯子Gln223Arg多態(tài)性的基因型與等位基因頻率在2型糖尿病組和正常對(duì)照組中的分布比較［n(%)］

經(jīng)自由度為2的χ2檢驗(yàn)，Lepr基因第6外顯子Gln223Arg多態(tài)性基因型頻率在T2DM組與正常對(duì)照組間的分布存在顯著差異(P=0．047)。對(duì)逐個(gè)基因型進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，GG基因型在病例組和對(duì)照組間的頻率分布具有顯著差異(P=0．024)，GG基因型的攜帶能增加T2DM的患病風(fēng)險(xiǎn)(OR=1．55，95%CI:1.04～2．32)。χ2檢驗(yàn)表明，Lepr基因第 6 外顯子Gln223Arg多態(tài)性的等位基因頻率在T2DM組與對(duì)照組間的分布有顯著性差異(P=0．016)。

3．Lepr基因Gln 223 Arg多態(tài)性的多因素Logistic回歸分析:由于年齡、性別可能作為T2DM的混雜因素，影響基因型參與T2DM發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)價(jià)，而本研究選取病例對(duì)照樣本的年齡和性別沒有得到很好的匹配，因此對(duì)該研究多態(tài)性的基因型進(jìn)行年齡和性別調(diào)整，排除其混雜效應(yīng)，評(píng)價(jià)易感基因的多態(tài)位點(diǎn)的不同基因型獨(dú)立于年齡和性別之外的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)由于體質(zhì)指數(shù)(BMI)和腰圍對(duì)于T2DM的公認(rèn)影響，同時(shí)在回歸模型分析中引入BMI和腰圍兩個(gè)變量，見表 2。由表 2可見，Lepr基因第 6外顯子Gln223Arg多態(tài)性與T2DM有顯著的相關(guān)性(P=0.003)。GG基因型的攜帶能夠增加T2DM的患病風(fēng)險(xiǎn)(OR=2.212，95%CI:1．316 ～3．717)。

表2 Lepr基因Gln223Arg多態(tài)性的多因素非條件Logistic回歸分析

討 論

Lepr基因又稱糖尿病基因(diabetes gene，DB)。1995年人類的Lepr基因被定位克隆，并定位于染色體1p31，由20個(gè)外顯子和19個(gè)內(nèi)含子組成，共編碼1165 個(gè)氨基酸［1］。

1996 年，Considine等［2］首次報(bào)道在人類 Lepr基因第6外顯子上存在有Gln223Arg變異，該變異第6外顯子第668位A→G的堿基突變，該突變位于瘦素受體的胞外區(qū)，其所編碼的氨基酸由精氨酸(Arg)變成谷氨酸(Gln)。1997年Tuomi等報(bào)道該變異與芬蘭白種人T2DM患者的血糖水平相關(guān)。2005年，Salopuro T等［3］在芬蘭的DM干預(yù)研究中發(fā)現(xiàn)，Lepr基因Gln223Arg變異與IGT向T2DM的轉(zhuǎn)歸有關(guān)，Gln223Gln基因型的個(gè)體較Arg223等位基因的攜帶者相比，更容易發(fā)展為T2DM。Chagnon等［4］在魁北克人群中的研究提示Gln223Arg多態(tài)性與BMI相關(guān)。Van Rossum等［5］在荷蘭青少年中的研究發(fā)現(xiàn)Arg223變異與高瘦素水平及增重相關(guān)。Ataka Y等［6］對(duì)太平洋島民以及Duarte等對(duì)巴西人群的研究顯示，該多態(tài)性與肥胖相關(guān)。Fnrusawa［7］對(duì)南部印度人的研究顯示，該多態(tài)性與肥胖和 T2DM相關(guān)。而 Heo等［8］觀察了3263例研究對(duì)象，包括非洲裔美國人、高加索白種人、丹麥人、芬蘭人、法裔加拿大人、尼日利亞人，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)Lepr基因Gln223Arg多態(tài)性與BMI或 WC 相關(guān)。在 Park等［9，10］對(duì)韓國人群的研究中，未發(fā)現(xiàn)該多態(tài)性與糖尿病的相關(guān)性［9，10］。Wang等對(duì)中國臺(tái)灣人群的研究結(jié)果顯示，該多態(tài)性與肥胖無相關(guān)性。這些表明Lepr基因Gln223Arg多態(tài)性與表型的關(guān)系存在種族的差異。目前為止，Gln223Arg多態(tài)性與T2DM的相關(guān)性仍存在爭議。

本次對(duì)Lepr基因Gln223Arg變異的研究顯示，對(duì)照組的G等位基因頻率為88．6%、A等位基因頻率為 11．4%，與上海地區(qū)正常漢族人 88．9%、11.1%，山西正常人群87．6%、12．4%，日本人報(bào)道的83．8%、16．2%以及韓國人報(bào)道的85%、15%分布相似，提示該等位基因頻率分布在亞洲人種中可能保持一致;但與白種人的39．0%、61．0%分布存在極顯著差異(p＜0．001)，提示該基因型和等位基因頻率分布存在明顯的種族差異。

本研究結(jié)果顯示，在中國北方人群中Lepr基因Gln223Arg多態(tài)性的野生型純合子GG在人群中最為常見，而在病例組和對(duì)照組中突變純合型AA個(gè)體均極少。χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示，Lepr基因Gln223Arg多態(tài)性的基因型頻率在T2DM組與正常對(duì)照組間的分布存在顯著差異(P=0．047)，GG基因型的攜帶能增加T2DM 的患病風(fēng)險(xiǎn)(P=0．024，OR=1．55，95%CI:1.04～2．32)。進(jìn)行年齡、性別、BMI和腰圍調(diào)整后，GG基因型的攜帶對(duì)增加T2DM患病風(fēng)險(xiǎn)的作用更加顯著(P=0.003，OR=2.212，95%CI:1.316～3.717)。結(jié)果表明，Lepr基因 Gln223Arg多態(tài)性的GG基因型是中國北方漢族人罹患T2DM的風(fēng)險(xiǎn)基因型。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Lepr基因Gln223Arg多態(tài)性與中國北方漢族人T2DM的發(fā)生相關(guān)，GG基因型的攜帶能夠增加T2DM的患病風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于Lepr基因Gln223Arg多態(tài)性對(duì)T2DM的影響機(jī)制還有待更深入的研究。

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