馬金梁，黃 帆，汪 洋，羅進(jìn)勇，鄧忠良

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨科，重慶400010；2.重慶醫(yī)科大學(xué)分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，重慶400016）

雙表達(dá)重組腺病毒介導(dǎo)的骨形態(tài)發(fā)生蛋白2－9復(fù)合納米羥基磷灰石／聚酰胺66融合器用于山羊椎間融合的效果評(píng)價(jià)

馬金梁1，黃 帆1，汪 洋1，羅進(jìn)勇2，鄧忠良1

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨科，重慶400010；2.重慶醫(yī)科大學(xué)分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，重慶400016）

目的：比較雙表達(dá)重組腺病毒介導(dǎo)的骨形態(tài)發(fā)生蛋白2－9（Adv－BMP2－9）與單表達(dá)Adv－BMP9和Adv－BMP2復(fù)合納米羥基磷灰石／聚酰胺66（n HA／PA66）融合器用于山羊椎間融合的效果，驗(yàn)證BMP2與BMP9的協(xié)同成骨作用。方法：選用40只中國青山羊行L2－3、L3－4和L4－5腰椎間融合術(shù)，共融合120個(gè)腰椎間隙。每個(gè)腰椎間隙植入n HA／PA66融合器復(fù)合以下4種腺病毒之一，Adv－BMP9（Adv－BMP9組，n＝30）、Adv－BMP2（Adv－BMP2組，n＝30）、Adv－BMP2－9（Adv－BMP2－9組，n＝30）和 Adv－GFP（Adv－GFP組，n＝30）。術(shù)后24周處死所有山羊，取出融合節(jié)段標(biāo)本，行影像學(xué)評(píng)估和生物力學(xué)分析。結(jié)果：X線檢測(cè)，術(shù)前、術(shù)后各組間椎間隙高度（DSH）比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；各組標(biāo)本椎間融合率，Adv－BMP2－9組為70%（21／30），Adv－BMP9組為53%（16／30），Adv－BMP2組為43%（13／30），而 Adv－GFP組為30%（9／30）。各組椎間CT融合度評(píng)分，Adv－h(huán)BMP2－9組、Adv－h(huán)BMP9組、Adv－h(huán)BMP2組和 Adv－GFP組依次為52.29±0.72、44.02±0.67、38.83±0.86和28.65±0.47，各組間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。生物力學(xué)評(píng)估，Adv－BMP2－9組融合節(jié)段剛度大于Adv－BMP9組（P＜0.05）；Adv－BMP9組融合節(jié)段剛度大于Adv－BMP2組，但差異無統(tǒng)計(jì)意義（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)期間各組山羊均未觀察到局部或遠(yuǎn)處感染、發(fā)熱和異物排斥反應(yīng)。結(jié)論：雙表達(dá)Adv－BMP2－9復(fù)合n HA／PA66融合器對(duì)山羊椎間融合效果優(yōu)于單表達(dá) Adv－BMP9或Adv－BMP2，BMP2與BMP9具有協(xié)同成骨作用。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白；重組腺病毒；椎間融合；納米羥基磷灰石；聚酰胺

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）屬于轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）超家族的成員之一。BMP不僅有促進(jìn)成骨功能，而且具有促進(jìn)軟骨細(xì)胞的成骨、血管發(fā)生和脂肪細(xì)胞分化等多種生物學(xué)功能［1－3］。目前發(fā)現(xiàn)的具有誘導(dǎo)成骨分化的BMP主要有BMP2、4、6、7和9，其中重組人骨形態(tài)生成蛋白（rhBMP）2、7已經(jīng)在臨床用于骨折延遲愈合、骨折骨不連、骨缺損和脊柱融合術(shù)的治療，并 取 得 了 一 定 的 治 療 效 果［4－5］。 然 而 rh BMP2、rhBMP 7的價(jià)格昂貴，在修復(fù)成骨的同時(shí)也存在成脂現(xiàn)象［6］，成骨能力不理想導(dǎo)致的手術(shù)失敗率也較高，因此尋找具有更強(qiáng)成骨能力的因子或者因子的組合十分迫切。對(duì)重組腺病毒介導(dǎo)的骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Adv－BMP）2、4、6、7和9的研究［7］顯示：人肌肉成纖維細(xì)胞瘤細(xì)胞C2C12、小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞系C3H10細(xì)胞和裸鼠皮下注射的體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，BMP9誘導(dǎo)成骨能力遠(yuǎn)強(qiáng)于BMP2和BMP7。 關(guān) 于 Adv－BMP2、 Adv－BMP4、Adv－BMP6、Adv－BMP7 和 Adv－BMP9 的 研 究 顯示：BMP9和BMP2的協(xié)同成骨作用最強(qiáng)，但是該結(jié)果的準(zhǔn)確性受到BMP2和BMP9腺病毒用量以及滴度測(cè)定準(zhǔn)確性的影響。為了使BMP2和BMP9達(dá)到1∶1表達(dá)，避免基因表達(dá)的相互干擾，準(zhǔn)確地研究BMP2和BMP9之間的協(xié)同作用及其促進(jìn)成骨作用，本研究采用雙表達(dá)BMP2－9的重組腺病毒載體［8］，復(fù)合納米羥基磷灰石聚酰胺66融合器應(yīng)用于山羊椎間，對(duì)其融合效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 選擇40只雌性中國本地青山羊，1～2歲，體質(zhì)量（30.00±2.08）kg，由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK（渝）2002007。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物處置符合動(dòng)物倫理學(xué)要求［9］。根據(jù)所選40只山羊腰椎L2～L5節(jié)段的平均椎間高度（disc space height，DSH），設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)用納米羥基磷灰石／聚酰胺66椎間（n－HA／PA66） 融 合 器。 腺 病 毒 BMP2－9、BMP9和BMP2由美國芝加哥大學(xué)分子腫瘤研究室提供，重慶醫(yī)科大學(xué)分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 動(dòng)物分組及給藥 40只成年雌性山羊，行L2－3、L3－4和 L4－5腰椎融合術(shù)。每只山羊3個(gè)腰椎間隙分別被植入n HA－PA66融合器復(fù)合以下4種腺病 毒 的 3 種： Adv－BMP2－9、 Adv－BMP2、Adv－BMP9和 Adv－GFP。按植入物不同分為 Adv－BMP2－9組（n＝30）、Adv－BMP9 組（n＝30）、Adv－BMP2（n＝30）和Adv－GFP組（n＝30）。所有動(dòng)物麻醉成功后取右側(cè)臥位，拍腰椎側(cè)位X線片。取左側(cè)腎型切口，切口起自羊左肋緣下3.0 cm、 距 后 中 線 約 10.0 cm， 止 于 髂 棘 上3.0 cm，切口長約11.0 cm。定位確定L2－3、L3－4和L4－5椎間盤。取同側(cè)自體髂骨大小約10 mm×10 mm×8 mm，均分成3份剪碎，分別加入等量等 滴 度（1×109IU·m L－1，0.5 m L）的 Adv－BMP2－9、Adv－BMP9、Adv－BMP2和 Adv－GFP中的3種，充分混勻后分別填至3個(gè)n HA－PA66融合器內(nèi)，壓實(shí)備用。分別切除 L2－3、L3－4、和L4－5椎間盤，刮除終板軟骨至出血，保留前縱韌帶。隨機(jī)取n HA－PA66融合器分別植入3個(gè)椎間隙。于術(shù)后第2天開始，每天分2次臀部肌肉注射青霉素鈉320萬單位，共3 d。第2、4和6天消毒手術(shù)切口。觀察各組山羊腰部外觀，肢體活動(dòng)、進(jìn)食和傷口愈合情況。

1.3 影像學(xué)分析山羊椎間融合率和融合度評(píng)分術(shù)后即刻和每4周攝羊腰椎X線正側(cè)位片，在X線片上測(cè)量各手術(shù)節(jié)段的DSH（圖1），計(jì)算各組DSH平均值。X線融合率分析標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，無新骨形成；1級(jí)，植入物和椎骨間可見到少量骨小梁；2級(jí)，植入物和椎骨間可見明顯的骨長入，但融合不明顯；3級(jí)，植入物和椎骨完全融合。所有山羊在第24周處死后取出融合節(jié)段標(biāo)本，行螺旋CT掃描，在植入椎間融合器節(jié)段處取5個(gè)矢狀切面，每1 mm 1個(gè)層面，每個(gè)層面又分為與椎體相接的1、2和3三個(gè)區(qū)域（圖2）進(jìn)行融合度評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分，無新生骨的形成；1分，可見新生骨的形成，但椎體與植入物間無骨性連接；2分，椎體與植入物間已形成骨性連接。

圖1 腰椎DSH值測(cè)量示意圖Fig.1 Schematic diagram of measurement of DSH of lumbar vertebra

1.4 山羊椎體力學(xué)性能測(cè)試 術(shù)后24周處死所有山羊，取其中5只山羊腰椎標(biāo)本，24 h內(nèi)進(jìn)行無破壞生物力學(xué)測(cè)試：取完整的山羊L2～L5椎體標(biāo)本，剔除腰部肌肉，保留完整骨骼及韌帶，用骨水泥將標(biāo)本兩端與上下實(shí)驗(yàn)盤固定，用Instron力學(xué)測(cè)試機(jī)進(jìn)行前屈、后伸、側(cè)屈和旋轉(zhuǎn)4個(gè)模式加載［10］。下位椎體固定，一個(gè)2 N·m最大力矩加于上位椎體，生物力學(xué)強(qiáng)度由載荷－位移曲線初始部分決定并計(jì)算。生物力學(xué)強(qiáng)度檢測(cè)指標(biāo)選用剛度值，單位為牛·米／度（N·m／°）。比較4組山羊腰椎標(biāo)本融合后的剛度。1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。各組標(biāo)本CT層面融合度評(píng)分、不同運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下平均剛度以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。

圖2 融合度CT評(píng)分分區(qū)示意圖Fig.2 Partition schematic diagram of CT fusion score

2 結(jié) 果

2.1 山羊一般情況 實(shí)驗(yàn)過程中有1只山羊術(shù)后第2天死亡，以另一只代替。所有動(dòng)物均無脊髓損傷，術(shù)后可以正常飲食，傷口正常愈合。

2.2 各組山羊椎體融合影像學(xué)評(píng)價(jià) 各組融合節(jié)段X線片DSH測(cè)量，術(shù)前和術(shù)后各組山羊平均DSH比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。X線融合率分析，術(shù)后24周時(shí)，Adv－BMP2－9組山羊所有椎間隙21個(gè)椎間發(fā)生了融合（3級(jí)），余9個(gè)椎間可見明顯的骨長入（2級(jí)），融合度為70%（21／30）；Adv－BMP9組山羊術(shù)后24周16個(gè)椎間融合（3級(jí)），融合度為53%（16／30）；Adv－BMP2組山羊13個(gè)椎間融合（3級(jí)），融合度為43%（13／30）；Adv－GFP組山羊。僅9個(gè)椎間發(fā)生融合，18個(gè)椎間可見明顯的骨長入，但融合不明顯（2級(jí)），2個(gè)椎間發(fā)生了假關(guān)節(jié)形成（1級(jí)），1只發(fā)現(xiàn)融合器已脫出，但未脫落，融合度30%（9／30）。所有融合器均未見椎間融合器下沉和碎裂。Adv－BMP2－9組山羊椎體融合率明顯高于 Adv－BMP9組和 Adv－BMP2組（P＜0.05）。融合度CT分析，術(shù)后24周 時(shí)，Adv－BMP2－9組山羊椎間已完全融合（圖3A）；Adv－BMP9組山羊所有CT層面均可見植骨塊與椎體之間已形成骨性連接（圖3B）；Adv－BMP2組山羊椎體所有CT層面均可見新生骨形成，2、3區(qū)域的植骨塊與椎體之間有骨性連接（圖3C）；Adv－GFP組山羊椎體僅3區(qū)域的植骨塊與椎體之間有骨性連接（圖3D）。

各組山羊椎體術(shù)后24周時(shí)融合度評(píng)分：Adv－BMP2－9、Adv－BMP9、 Adv－BMP2 和 Adv－GFP組依次為52.29±0.72、44.02±0.67、38.83±0.86和28.65±0.47，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。

圖3 各組山羊標(biāo)本椎間融合度CT評(píng)分Fig.3 CT fusion score specimens of goats in various groups

2.3 4組標(biāo)本不同運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下平均剛度Adv－BMP2－9、Adv－BMP9、 Adv－BMP2 和 Adv－GFP組標(biāo)本融合節(jié)段剛度呈遞減趨勢(shì)；Adv－BMP9、Adv－BMP2組間剛度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；Adv－BMP2－9組標(biāo)本的融合節(jié)段剛度大于Adv－BMP9組和Adv－BMP2組，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Adv－BMP2組標(biāo)本剛度大于Adv－GFP組，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 術(shù)后24周各組標(biāo)本不同運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下平均剛度Tab.1 Average stiffness of specimens at different motion state 24 weeks after operation in various groups（n＝30±s，N·m／°）

表1 術(shù)后24周各組標(biāo)本不同運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下平均剛度Tab.1 Average stiffness of specimens at different motion state 24 weeks after operation in various groups（n＝30±s，N·m／°）

＊P＜0.05 vs Adv－BMP2－9 group；△P＜0.05 vs Adv－BMP9 group.

Group Average stiffness Fexion Extension Torsion Bending Adv－BMP2－9 5.6±0.35 5.2±0.34 6.6±0.42 6.5±0.39 Adv－BMP9 5.1±0.29＊ 4.7±0.32＊ 6.1±0.31＊ 5.9±0.44＊Adv－BMP2 5.0±0.27＊ 4.5±0.29＊ 6.0±0.51＊ 5.7±0.45＊Adv－GFP 4.5±0.36＊△ 4.1±0.41＊△ 5.3±0.39＊△ 5.0±0.22＊△

3 討 論

BMP是目前研究的熱點(diǎn)，其被認(rèn)為是成骨能力最強(qiáng)、最具有臨床運(yùn)用前景的成骨因子，但是現(xiàn)在臨床使用的骨形成誘導(dǎo)因子BMP2、7價(jià)格昂貴，治療效果不穩(wěn)定。近來研究［11］顯示：BMP9具有異位成骨能力。本課題組前期研究［12］結(jié)果顯示：BMP9成骨能力較BMP2和BMP7強(qiáng)；BMP9和其他的BMP具有協(xié)同成骨的能力，特別與BMP2的協(xié)同成骨能力最強(qiáng)［7］。

山羊動(dòng)物模型是脊柱融合較常用的模型，因?yàn)樯窖蚣怪纳锪W(xué)承重軸是脊柱的縱軸，其生物力學(xué)特點(diǎn)與人很相似。研究［13－14］表明：山羊頸椎的解剖、力學(xué)特點(diǎn)和骨密度植入與人體非常相似。Kandziora等［15］研究顯示：山羊 的 C2－3、C3－4節(jié) 段的生物力學(xué)特性與人體頸椎最為相似，適合進(jìn)行生物力學(xué)測(cè)試。本研究采用山羊腰椎融合模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并以L2～L5節(jié)段作為融合節(jié)段。

本研究結(jié)果顯示：術(shù)前和術(shù)后4組山羊椎體融合節(jié)段DSH差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后24周時(shí)，Adv－BMP2－9組山羊椎體融合節(jié)段的融合率分別較Adv－BMP9組、Adv－BMP2組高。生物力學(xué)測(cè)定被認(rèn)為是衡量椎間融合效果的另一個(gè)重要客觀指標(biāo)。上述測(cè)試結(jié)果表明：術(shù)后24周Adv－BMP2－9組山羊椎體平均剛度大于Adv－BMP9組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而Adv－BMP9組山羊椎體平均剛度高于Adv－BMP2組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4組標(biāo)本中，Adv－GFP組標(biāo)本融合節(jié)段平均剛度最低，與Adv－BMP2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。影像學(xué)及生物力學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示：術(shù)后24周，Adv－BMP2－9組與其余3組標(biāo)本在組織融合度和力學(xué)穩(wěn)定性方面的比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明Adv－BMP2－9組標(biāo)本達(dá)到了良好的融合效果。

本實(shí)驗(yàn)中Adv－BMP9組山羊椎間融合率高于Adv－BMP2組，說明Adv－BMP9對(duì)椎骨缺損修復(fù)效果優(yōu)于 Adv－BMP2，同盧小娟等［12］的研究結(jié)論一致，因此Adv－BMP9是更強(qiáng)的成骨誘導(dǎo)因子。而本實(shí)驗(yàn)中Adv－BMP2－9組山羊椎體椎間融合率高 于 Adv－BMP9 和 Adv－BMP2 組， 說 明Adv－BMP2與Adv－BMP9具有協(xié)同作用，具體機(jī)理尚不明確。Adv－BMP2－9有望為骨腫瘤、骨折愈合和脊柱融合等多種骨骼疾病的基因治療提供一個(gè)作用強(qiáng)且安全和有效的平臺(tái)。

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Evaluation on effects of bone morphoge netic protein2－9 mediated by co－expressing recombinant adenovirus combined with nano－h(huán)ydroxyapatite／polyamide 66 cage on lumbar interbody fusion of goats

MA Jin－liang1，HUANG Fan1，WANG Yang1，LUO Jin－yong2，DENG Zhong－liang1
（1.Departments of Orthopedics，Second Affiliated Hospital，Chongqing Medical University，Chongqing 400010，China；2.Molecular Medicine Laboratory，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

Objective To compare the interbody fusion effects of bone morphogenetic protein 2－9（Adv－BMP 2－9）with single expression of Adv－BMP9 or adv－BMP2 mediated by co－expressing recombinant adenovirus combined with nano－h(huán)ydroxyapatite／polyamide 66（n HA／PA66）cage on lumbar interbody fusion of goats，and to clarify the collaborative osteogenesis effects of BMP2 and BMP9.Methods Interbody fusion was performed at L2－3，L3－4and L4－5in 40 Chinese green goats，included a total of 120 interspace of lumbar vertebrae.Each interspace of lumbar vertebra was randomly implanted with a n HA／PA66 cage combined with one of the following four adenovirus，Adv－BMP9（Adv－BMP9 group，n＝30），Adv－BMP2（Adv－BMP2 group，n＝30），Adv－BMP2－9（Adv－BMP2－9 group，n＝30），and Adv－GFP（Adv－GFP group，n＝30）.The goats were euthanized 24 weeks after operation，and the fusion segment speciments were obtained；radiographic inspection and biomechanical analysis were performed on the segment speciments.Results The X－ray results showed there was no significant difference of disc space height（DSH）before and after operation between various groups.The interbody fusion rates were 70%（21／30）in Adv－BMP2－9 group and 53%（16／30）in Adv－BMP9 group and 31%（5／16）in Adv－BMP2 group and 30%（9／30）in Adv－GFP group.CT fusion degree tests showed that CT fusion scores in Adv－h(huán)BMP2－9 group，Adv－h(huán) BMP9 group，Adv－h(huán)BMP2 group and Adv－GFP group were 52.29±0.72，44.02±0.67，38.83±0.86，and 28.65±0.47，respectively；there were significant differences between various groups（P ＜0.05 or P ＜0.01）.Biomechanical analysis showed that the stiffness of the fusion segment in Adv－BMP2－9 group was higher than that in Adv－BMP9 group（P＜0.05），and stiffness in the fusion segment in Adv－BMP9 group was higher than that in Adv－BMP2 group，but there was no significant difference（P＞0.05）.During the experiment，no local or distant infection，fever，and foreign body rejection were observed in all goats.Conclusion The interbody fusion effect of co－expressing Adv－BMP2－9 combined with n HA／PA66 cage is superior to Adv－BMP9 or Adv－BMP2 on goat lumbar，and BMP2 and BMP9 have collaborative osteogenesis.

bone morphogenetic protein；recombinant adenovirus；interbody fusion；nano－h(huán)ydroxyapatite；polyamide

R681.5

A

1671－587Ⅹ（2012）06－1086－05

2012－03－03

國家 “863”計(jì)劃資助課題（2008AA02Z443）；重慶市衛(wèi)生局科研基金資助課題（2011－1－053）

馬金梁（1978－），男，湖北省荊州市人，講師，醫(yī)學(xué)博士，主要從事脊柱微創(chuàng)外科方面的研究。

鄧忠良（Tel：023－63693138，E－mail：deng7586＠gmail.com）