宋 宇，黃可欣，李冬梅，石 搏

（1.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，吉林長(zhǎng)春130021；2.長(zhǎng)春大學(xué)特殊教育學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春130022）

硝酸鑭對(duì)小鼠特異性抗體的形成、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

宋 宇1，2，黃可欣1，李冬梅2，石 搏1

（1.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，吉林長(zhǎng)春130021；2.長(zhǎng)春大學(xué)特殊教育學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春130022）

目的：觀(guān)察硝酸鑭作用后小鼠特異性抗體的形成、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化及腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的變化，探討硝酸鑭對(duì)小鼠免疫功能的影響。方法：昆明種小鼠60只，隨機(jī)分為對(duì)照組、硝酸鑭0.1、0.2、2.0、10.0和20.0 mg·Kg－1組，每組10只，分別給予小鼠腹腔注射生理鹽水、硝酸鑭0.1、0.2、2.0、10.0和20.0 mg·kg－11次；應(yīng)用直接凝集法、3H－Td R摻入放射自顯影術(shù)和吞噬雞紅細(xì)胞法，檢測(cè)硝酸鑭作用后小鼠抗A抗體的效價(jià)、被標(biāo)記淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化比值和腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的比值。結(jié)果：與對(duì)照組比較，硝酸鑭0.1、0.2和2.0 mg·kg－1組小鼠抗A抗體的效價(jià)、被標(biāo)記淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化比值和腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞比值均顯著升高（P＜0.01）；與對(duì)照組、酸硝鑭0.1、0.2和2.0 mg·kg－1組比較，酸硝鑭10.0和20.0 mg·kg－1組小鼠抗A抗體的效價(jià)、被標(biāo)記淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化比值和腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞比值顯著降低（P＜0.01）。結(jié)論：小劑量硝酸鑭對(duì)小鼠特異性抗體的形成、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化及腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能具有明顯促進(jìn)作用，大劑量硝酸鑭則具有明顯的抑制作用。

硝酸鑭；抗A抗體 ；放射自顯影術(shù) ；巨噬細(xì)胞

稀土元素共有17種，其中15種為鑭系。鑭系稀土元素具有許多優(yōu)良的理化性質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于各行各業(yè)，因而導(dǎo)致了越來(lái)越多的稀土元素進(jìn)入生物賴(lài)以生存的環(huán)境中，近年來(lái)很多報(bào)道已證實(shí)稀土元素可以通過(guò)食物鏈、呼吸道和皮膚等多種途徑進(jìn)入生物體內(nèi)，并通過(guò)血液運(yùn)輸滯留或蓄積在各臟器組織內(nèi)［1－3］。稀土元素對(duì)生態(tài)環(huán)境和人體健康的影響以及關(guān)于稀土元素近期及遠(yuǎn)期生物學(xué)效應(yīng)的研究越來(lái)越引起人們的關(guān)注，大量的國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道［4－6］已證實(shí)：稀土是一類(lèi)低毒性物質(zhì)，適量攝入對(duì)機(jī)體心臟、肝臟、脾臟和血清激素等方面有良好的保護(hù)作用，而大量攝入則會(huì)對(duì)機(jī)體造成危害。鑭元素在稀土元素中的應(yīng)用較為廣泛，一般常以化合物如氯化鑭、硝酸鑭形式存在，但目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)關(guān)于硝酸鑭對(duì)小鼠免疫功能影響的相關(guān)報(bào)道。本研究探討不同劑量硝酸鑭對(duì)小鼠特異性抗體的形成、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能影響，旨在證實(shí)低劑量硝酸鑭對(duì)免疫功能的作用，為稀土元素應(yīng)用于臨床以及預(yù)防保健提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及主要試劑 采用60只健康雄性昆明種小鼠，均為3周齡，體質(zhì)量（15.48±1.42）g，由吉林大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。硝酸鑭由北京稀土農(nóng)用中心提供，3H－TdR購(gòu)于北京原子能研究所，力豆蛋白（Con A）、低糖營(yíng)養(yǎng)液（IMDM）、小牛血清購(gòu)于四季青生物工程公司。

1.2 動(dòng)物分組及給藥 將小鼠隨機(jī)分為6組，每組10只。第1組為對(duì)照組，第2～6組依次為硝酸鑭0.1、0.2、2.0、10.0和20.0 mg·kg－1組。動(dòng)物進(jìn)行免疫之前做以下處理：對(duì)照組小鼠經(jīng)腹腔注射生理鹽水0.1 mL，第2～6組小鼠經(jīng)腹腔注射硝酸鑭（0.1、0.2、2.0、10.0 和 20.0 mg · kg－1）0.1 mL；各組小鼠每隔10 d注射1次，共注射3次。

1.3 動(dòng)物免疫 各組小鼠經(jīng)上述處理后，于次日取5個(gè)A型血人的混合新鮮血，用生理鹽水洗3次后，按紅細(xì)胞壓積用生理鹽水稀釋10倍，制成紅細(xì)胞懸液，經(jīng)腹腔注射免疫；每隔10 d免疫1次，第3次免疫后10 d再加強(qiáng)免疫1次，3 d后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 抗體效價(jià)的測(cè)定 應(yīng)用直接凝集法［7］測(cè)定抗體效價(jià)。首先稀釋待檢血清：取10支試管排列于試管架上，依次編號(hào)，用吸管在每管加入生理鹽水，第1管加入0.9 m L，其余各管均加入0.5 m L。后吸取0.1 m L待檢血清加入第1管內(nèi)，吸入稀釋液，再行吹出，重復(fù)3次，使混勻，該管含1∶10稀釋血清。接著用同一吸管從第1管吸出0.5 m L加入第2管內(nèi)，按上法混合，并以同法連續(xù)稀釋至第9管，從該管內(nèi)吸取0.5 m L棄去。如此每管內(nèi)所含受檢血清濃度為前一管的一半，即1∶10、1∶20、1∶40……，最后一管留作對(duì)照；其次加入抗原：每排各管加入診斷菌液0.5 m L，振搖試管架，充分混勻。此時(shí)血清的最終稀釋倍數(shù)，從第1管開(kāi)始，分別為1∶20、1∶40……末管為抗原對(duì)照；保溫靜置：37℃靜置2 h，初步判讀結(jié)果，然后移放冰箱過(guò)夜，再次判讀。

1.5 被標(biāo)記轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞比值檢測(cè) 應(yīng)用3H－Td R摻入放射自顯影術(shù)。脫臼處死小鼠，取其脾臟在無(wú)菌條件下制成細(xì)胞懸液，營(yíng)養(yǎng)液為含10%小牛血清、Con A的IMDM；將脾細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，于37℃、5%CO2溫箱靜置48 h后，加入3H－Td R，至終濃度為1 mCi·L－1，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后制成涂片標(biāo)本，于暗室內(nèi)紅燈下涂核乳膠，放入暗盒中于4℃曝光，經(jīng)顯影、定影及HE染色后顯微鏡下觀(guān)察。

1.6 巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 應(yīng)用吞噬雞紅細(xì)胞法［8］，即實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將雞紅細(xì)胞注入小鼠腹腔，2 h后抽出腹腔液體置于干凈的載玻片上，以95%酒精固定15 min，HE染色光學(xué)顯微鏡觀(guān)察巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析?？笰抗體效價(jià)、被標(biāo)記淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化比值、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞比值均以±s表示，多個(gè)樣本均數(shù)組間比較采用方差分析。

2 結(jié) 果

與對(duì)照組比較，小鼠抗A抗體效價(jià)在硝酸鑭0.1、0.2 和 2.0 mg·kg－1劑 量 組 升 高（P＜0.05），尤 以 0.1、0.2 mg·kg－1組 明 顯；而 在10.0和20.0 mg·kg－1組降低（P＜0.01）。脾細(xì)胞懸液標(biāo)本可見(jiàn)大型淋巴細(xì)胞均為轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞，部分轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞核內(nèi)有黑色銀顆粒，即為被標(biāo)記轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞。依次計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，與對(duì)照組比較，硝酸鑭0.1、0.2和2.0 mg·kg－1劑量組轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞比值升高（P＜0.05），尤以 0.1、0.2 mg·kg－1組明顯（P＜0.01）；而在10.0和20.0 mg·kg－1組轉(zhuǎn)化淋巴比值降低，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。對(duì)照組標(biāo)本可見(jiàn)散在巨噬細(xì)胞、雞紅細(xì)胞，有少數(shù)巨噬細(xì)胞吞噬數(shù)個(gè)雞紅細(xì)胞；硝酸鑭0.1、0.2和2.0 mg·kg－1劑量組標(biāo)本可見(jiàn)大量巨噬細(xì)胞吞噬大量雞紅細(xì)胞，與對(duì)照組比較，硝酸鑭0.1、0.2和2.0 mg·kg－1劑量組腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞比值升高（P＜0.01），尤以0.1、0.2組明顯（P＜0.01）；而在10.0和20.0 mg·kg－1組腹腔巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)胞雞紅細(xì)胞比值降低，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 硝酸鑭作用后小鼠抗A抗體效價(jià)、3 H－Td R標(biāo)記轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞比值和腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞比值Tab.1 The anti－A antibody titer，the 3 H－TdR marked lymphocyte transformation ratio and the ratio of chicken erythrocytes phagocytized by peritoneal macrophages of mice after treated with La（NO3）3 （n＝10，±s）

表1 硝酸鑭作用后小鼠抗A抗體效價(jià)、3 H－Td R標(biāo)記轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞比值和腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞比值Tab.1 The anti－A antibody titer，the 3 H－TdR marked lymphocyte transformation ratio and the ratio of chicken erythrocytes phagocytized by peritoneal macrophages of mice after treated with La（NO3）3 （n＝10，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01 compared with control group；＃P＜0.01 compared with La（NO3）3 0.1 mg·kg－1 group；△P＜0.01 compared with La（NO3）3 0.2 mg·kg－1 group；▲P＜0.01 compared with La（NO3）3 2.0 mg·kg－1 group.

Group Antibody titer Marked lymphocyte transformation ratio（η／%）Ratio of chicken erythrocytes（η／%）Control 2.196±0.211 70.430±0.135 53.360±0.021 La（NO3）3 0.1 mg·kg－1 2.932±0.091＊ 94.310±0.011＊＊ 99.810±0.032＊＊0.2 mg·kg－1 2.899±0.132＊ 93.260±0.112＊＊ 98.740±0.017＊＊2.0 mg·kg－1 2.741±0.203＊ 90.640±0.146＊ 95.490±0.025＊10.0 mg·kg－1 1.821±0.214＊＊＃△▲ 51.220±0.097＊＊?！鳌?40.390±0.036＊＊?！鳌?0.0 mg·kg－1 1.722±0.163＊＊＃△▲ 41.390±0.137＊＊?！鳌?35.580±0.041＊＊?！鳌?/p>

3 討 論

近年來(lái)，隨著對(duì)稀土化合物生物效應(yīng)研究的深入，稀土元素在農(nóng)業(yè)及醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景，因此其安全劑量的確定就顯得尤其重要［9－11］。國(guó)內(nèi)學(xué)者［12－13］報(bào)道：小劑量硝酸鑭對(duì)脾臟的免疫功能有促進(jìn)作用，大劑量硝酸鑭有抑制作用，這是對(duì)機(jī)體自身免疫功能調(diào)節(jié)的證實(shí)。機(jī)體的免疫系統(tǒng)是由具有免疫功能的器官、組織、細(xì)胞和分子組成的，是機(jī)體免疫反應(yīng)發(fā)生的物質(zhì)基礎(chǔ)。臟器指數(shù)是衡量機(jī)體免疫功能的初步指標(biāo)，以T和B細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫和體液免疫是反映機(jī)體免疫調(diào)節(jié)平衡狀態(tài)的重要參數(shù)，單核巨噬細(xì)胞的吞噬能力可衡量機(jī)體非特異性免疫功能。因此，本研究主要從特異性免疫及非特異性免疫功能方面評(píng)價(jià)硝酸鑭對(duì)機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用人A型紅細(xì)胞免疫小鼠后，刺激B淋巴細(xì)胞，經(jīng)增殖、分化成為具有合成與分泌抗A抗體的漿細(xì)胞。檢測(cè)小鼠血清中抗A抗體效價(jià)可以看出，硝酸鑭0.1、0.2和2.0 mg·kg－1劑量組對(duì)抗A抗體形成有促進(jìn)作用，尤以0.1和0.2 mg·kg－1組明顯；而在10.0和20.0 mg·kg－1組有抑制作用，說(shuō)明小劑量的硝酸鑭具有刺激B淋巴細(xì)胞母細(xì)胞化、增殖及分化為漿細(xì)胞的功能，而大劑量則有抑制作用［7－8］。3H－TdR摻入放射自顯影術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明：La（NO3）3在0.1、0.2和2.0 mg·kg－1劑量組對(duì)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化具有促進(jìn)作用，尤以0.1、0.2 mg·kg－1組明顯；而在10.0和20.0 mg·kg－1組有抑制作用［9－10］。吞噬功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：硝酸鑭0.1、0.2和2.0 mg·kg－1劑量組標(biāo)本可見(jiàn)大量巨噬細(xì)胞吞噬大量雞紅細(xì)胞，與對(duì)照組比較，硝酸鑭0.1、0.2和2.0 mg·kg－1劑量組吞噬功能增強(qiáng)，尤以0.1和0.2 mg·kg－1組明顯；而在10.0和20.0 mg·kg－1組標(biāo)本可見(jiàn)極少量吞噬現(xiàn)象，與對(duì)照組比較，其吞噬功能減弱。上述實(shí)驗(yàn)通過(guò)外源性刺激進(jìn)一步證實(shí)小劑量硝酸鑭對(duì)機(jī)體免疫功能有促進(jìn)作用而大劑量硝酸鑭對(duì)機(jī)體免疫功能有抑制作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：硝酸鑭對(duì)小鼠的免疫功能有一定的調(diào)節(jié)作用，具體的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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Effects of La（NO3）3on formation of specific antibodies，lymphocyte transformation and peritoneal macrophage phagocytic function in mice

SONG Yu1，2，HUANG Ke－xin1，LI Dong－mei2，SHI Bo1
（1.Morphology Experiment Center，Norman Bethune College of Medicine，Jilin University，Changchun 130021，China；2.School of Special Education，Changchun University，Changchun 130022，China）

Objective To observe the changes of the formation of specific antibodies，lymphocyte transformation and peritoneal macrophage phagocytotic function in mice after treated with La（NO3）3，and to explore the effect of La（NO3）3on immune function in mice.Methods 60 Kunming mice were randomly divided into control group，La（NO3）30.1，0.2，2.0，10.0 and 20.0 mg·kg－1groups，there were 10 mice in each group，and the mice in various groups were given intraperitoneal injection of saline，La（NO3）30.1，0.2，2.0，10.0，and 20.0 mg·kg－1once a day.Direct agglutination，3H－TdR incorporation radiation self－developing technique and phagocytic chicken erythrocytes were used to detect the anti－A－antibody titer，marked lymphocyte transformation ratio and ratio of chicken erythrocytes phagocytized by peritoneal macrophages after treated with La（NO3）3.Results Compared with control group，the anti－A antibody titer，the marked lymphocyte transformation ratio and the ratio of chicken erythrocytes phagocytized by peritoneal macrophages of mice in La（NO3）30.1，0.2 and 2.0 groups were increased significantly（P＜0.01）；compared with control，La（NO3）30.1，0.2 and 2.0 groups，those indexes mentioned above in La（NO3）310.0 and 20.0 mg·kg－1groups were decreased significantly（P＜0.01）.Conclusion Small doses of La（NO3）3can promote the formation of specific antibodies，lymphocyte transformation and phagocytic function of peritoneal macrophages and large doses of La（NO3）3have significantly inhibitory effects in mice.

La（NO3）3；anti－A antibody；autoradiography；macrophages

R392.12

A

1671－587Ⅹ（2012）06－1048－04

2012－06－22

國(guó)家自然科學(xué)基金資助課題（29890208）

宋 宇（1970－），男，吉林省長(zhǎng)春市人，講師，醫(yī)學(xué)碩士，主要從事稀土生物學(xué)效應(yīng)的研究。

黃可欣（Tel：0431－85619734，E－mail：huangkx＠jlu.edu.cn）

時(shí)間：2012－10－2509：34

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／22.1342.R.20121025.0934.002.html