張玉玉， 宋 弋， 周婷婷， 呂 茜， 楊瑞學(xué)， 李全宏

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)機(jī)械化科學(xué)研究院，北京 100083)

高效液相色譜法測(cè)定鎮(zhèn)江香醋中5-羥甲基糠醛的含量

張玉玉1， 宋 弋1， 周婷婷1， 呂 茜1， 楊瑞學(xué)2， 李全宏1

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)機(jī)械化科學(xué)研究院，北京 100083)

采用高效液相色譜法，對(duì)鎮(zhèn)江香醋中5－羥甲基糠醛進(jìn)行了定量分析.樣品中的HMF含量的測(cè)定條件為:以甲醇－水溶液(體積比為5∶95)為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min，采用Venusil XBPC18色譜柱分離，柱溫為30℃，UV檢測(cè)器的檢測(cè)波長(zhǎng)為284 nm.定量分析結(jié)果表明，鎮(zhèn)江香醋中HMF的含量為8.01 mg/kg.高效液相色譜法分析鎮(zhèn)江香醋中HMF含量的方法測(cè)定準(zhǔn)確，穩(wěn)定性高，HMF 在0.014 3 ～0.085 8 μg的進(jìn)樣范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)為 R2=0.999 9，平均回收率98.66%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.53%.

鎮(zhèn)江香醋;高效液相色譜;5－羥甲基糠醛;含量檢測(cè)

釀造食醋在我國(guó)有兩千多年的歷史［1］，是我國(guó)的傳統(tǒng)調(diào)味品，在飲食和保健方面都具有廣泛的應(yīng)用.鎮(zhèn)江香醋作為釀造食醋的一種，具有“色、香、醇、酸、濃”的特點(diǎn)，為我國(guó)傳統(tǒng)名醋之一［2］，其香醋釀造技藝被列入首批“國(guó)家級(jí)非物質(zhì)文化遺產(chǎn)名錄”［3］.國(guó)標(biāo)GB/T 18623—2002對(duì)鎮(zhèn)江香醋的定義是，以優(yōu)質(zhì)糯米為原料，采用傳統(tǒng)的復(fù)式糖化、酒精發(fā)酵和醋酸固態(tài)分層發(fā)酵工藝，經(jīng)陳釀釀制而成的香氣濃郁、酸而不澀的食醋［4］.鎮(zhèn)江香醋的香氣成分［5－7］和營(yíng)養(yǎng)保健作用已經(jīng)得到了廣泛的研究，其具有降血壓、降血脂、消除疲勞、抗菌、防治感冒、抗氧化等作用［8－9］.

5－羥 甲 基 糠 醛 (5－h(huán)ydroxymethylfurfural，5－(hydroxymethyl)furan－2－carbaldehyde，HMF)，是葡萄糖或果糖等單糖化合物在高溫或酸性條件下，催化脫水產(chǎn)生的一種醛類化合物，是美拉德反應(yīng)的重要中間產(chǎn)物［10］.5－羥甲基糠醛廣泛存在于酒類［11］、醬油［12］、蜂蜜［13］、烘焙食品［14］、醋［15］以及一些藥物中［16－17］.研究表明，一定劑量的糠醛或 HMF被機(jī)體吸收后，可引起動(dòng)物橫紋肌麻痹和內(nèi)臟損害，并對(duì)眼黏膜、上呼吸道黏膜等產(chǎn)生刺激作用［18］.5－羥甲基糠醛含量的測(cè)定方法主要有高效液相色譜法［19］、氣相色譜質(zhì)譜法［20］、紫外比色法［21］.目前，利用高效液相色譜法，測(cè)定鎮(zhèn)江香醋中5－羥甲基糠醛含量的研究還未見報(bào)道.

本文采用高效液相色譜法，對(duì)鎮(zhèn)江香醋中的5－羥甲基糠醛進(jìn)行定量分析，旨在建立一種準(zhǔn)確測(cè)定鎮(zhèn)江香醋中5－羥甲基糠醛含量的方法，為鎮(zhèn)江香醋的生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鎮(zhèn)江香醋，購于北京的超市.

5－羥甲基糠醛，純度99%，Sigma公司;甲醇，色譜純，北京愛希姆科技發(fā)展有限公司;水為超純水;0.45 μm水系濾膜，藍(lán)弋化工產(chǎn)品有限責(zé)任公司.

1.2 儀器與設(shè)備

LC－20A型高效液相色譜儀(配有LC－20AT型洗脫泵、SPD－20A型檢測(cè)器、CTO－20A型柱溫箱、LC Solution工作站)，島津國(guó)際貿(mào)易有限公司;Venusil XBP－C18色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，博納艾杰爾科技有限公司;LGJ－12型冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技公司;2000D型超純水器，北京長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司.

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

精確稱取HMF標(biāo)準(zhǔn)品0.028 6 g，用超純水溶解，定容到100 mL的容量瓶中，得0.286 mg/mL的HMF標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，于4℃條件下避光保存.

1.3.2 樣品溶液的配制

準(zhǔn)確稱取醋樣品71.710 0 g，－45℃冷凍干燥24 h，得5.280 7 g干燥醋樣品.取干燥醋樣品0.301 1 g，用超純水溶解并定容至 50 mL，0.45 μm 的水系微孔濾膜過濾后得測(cè)樣液，待HPLC分析.

1.3.3 分析測(cè)定條件

色譜條件為Venusil XBP－C18色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);柱溫為30℃;UV檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為284 nm;流動(dòng)相為5%甲醇，95%水(體積百分含量);流速為 1.0 mL/min;進(jìn)樣量為 20 μL.

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

通過優(yōu)化流動(dòng)相的比例，當(dāng)流動(dòng)相組分為甲醇－水(5∶95，V/V)，等梯度洗脫，流動(dòng)相流速 1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)284 nm時(shí)，HMF標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜峰圖形較好，見圖1.

圖1 HMF標(biāo)準(zhǔn)溶液液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of HMF standard solution

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍

取0.286 mg/mL的HMF標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液1 mL，用超純水溶解，定容到100 mL的容量瓶中，得2.86 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液.取HMF標(biāo)準(zhǔn)品溶液(2.86 μg/mL)5，10，15，20，30 μL，注入液相色譜儀，依次經(jīng)優(yōu)化的高效液相色譜條件進(jìn)行分析.以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖2，得到線性回歸方程:y=7 ×106x－704.57，R2=0.999 9.結(jié)果表明，進(jìn)樣量在 5 ～30 μL(0.014 3 ～0.085 8 μg)的范圍內(nèi)，呈良好的線性關(guān)系.

圖2 5－羥甲基糠醛標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of 5－h(huán)ydroxymethylfurfural

2.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取測(cè)樣液，相同體積20 μL，進(jìn)樣5次，分別按上述色譜條件測(cè)定其中HMF的含量，計(jì)算所測(cè)含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為5.40%(見表1)，說明本方法用于測(cè)定鎮(zhèn)江香醋中5－HMF含量具有較好的重復(fù)性.

表1 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Result of repeatability test

2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取2.86 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，室溫放置.每1.5 h進(jìn)樣1次，測(cè)定5次，分別進(jìn)樣20 μL.結(jié)果表明，所測(cè)含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.83%(見表2)，說明處理后的標(biāo)準(zhǔn)溶液在室溫條件下6 h內(nèi)穩(wěn)定.

表2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Result of stability test

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

在室溫條件下，取同一質(zhì)量濃度的HMF標(biāo)準(zhǔn)品溶液(2.86 μg/mL)，連續(xù) 5 次進(jìn)樣，每次 20 μL，結(jié)果見表3.

表3 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Result of precision test

表3結(jié)果表明，同樣濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液連續(xù)進(jìn)樣的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.27%，說明該方法的精密度較高.

2.6 加樣回收試驗(yàn)

取已知含量的樣品約5 mL，共9份，分別加入濃度為 2.86 μg/mL HMF 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液 0.8，1.0，1.2 mL.經(jīng)測(cè)定、計(jì)算得 HMF平均回收率為98.7%，RSD 為5.5%，結(jié)果見表 4.

表4 HMF加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 HMF recovery tests and corresponding relative standard deviations

Theobald等［15］采用高效液相色譜法，對(duì)未經(jīng)過前處理的醋樣品中HMF的含量進(jìn)行了測(cè)定，其回收率范圍在95%～101%.

2.7 樣品測(cè)定

將鎮(zhèn)江香醋樣品，按1.3.2的既定實(shí)驗(yàn)條件制備樣品溶液，用高效液相色譜測(cè)定HMF峰面積，液相色譜圖如圖3.

將測(cè)定的HMF峰面積代入回歸方程，計(jì)算鎮(zhèn)江香醋樣品中HMF的含量，為8.01 mg/kg.鎮(zhèn)江香醋中HMF含量的計(jì)算公式見式1.

式(1)中，y為峰面積，V1為稀釋體積，mL;V2為進(jìn)樣體積，mL;m1為冷凍干燥后的質(zhì)量，g;m2為稀釋時(shí)取樣的質(zhì)量，g;m3為凍干前樣品的質(zhì)量，g;m為樣品中HMF的含量，mg/kg.Theobald等［15］分析了歐洲的7種醋中HMF的含量，發(fā)現(xiàn)醋樣品中的HMF含量從10 mg/L至3.3 g/L不等，認(rèn)為焦糖化不是HMF的唯一生成途徑，HMF的含量可能與醋的儲(chǔ)藏時(shí)間有關(guān).鎮(zhèn)江香醋樣品中HMF的含量為8.01 mg/kg，比Theobald等測(cè)定的歐洲7種醋樣品低.鎮(zhèn)江香醋的主要原料為優(yōu)質(zhì)糯米，在復(fù)式糖化、酒精發(fā)酵、醋酸固態(tài)分層發(fā)酵和陳釀的過程中，也會(huì)發(fā)生焦糖化和糖的脫水降解等反應(yīng)，產(chǎn)生HMF.

圖3 鎮(zhèn)江香醋樣品中HMF的定量檢測(cè)液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of HMF determination in Zhenjiang vinegar

3 結(jié)論

運(yùn)用高效液相色譜法檢測(cè)鎮(zhèn)江香醋中的HMF含量，選定的檢測(cè)條件為:流動(dòng)相為甲醇－水溶液(體積比為 5∶95)，流速為 1.0 mL/min，分離色譜柱為Venusil XBP－C18，柱溫30℃，UV檢測(cè)器的檢測(cè)波長(zhǎng)為284 nm.鎮(zhèn)江香醋中含有較多的低沸點(diǎn)揮發(fā)性成分，運(yùn)用冷凍干燥法處理樣品，可以除去部分干擾HMF測(cè)定的成分，使得HMF含量的液相色譜定量測(cè)定方法準(zhǔn)確度、精密度均較好，重現(xiàn)性良好，在0.014 3 ～0.085 8 μg的進(jìn)樣范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 9，平均回收率98.66%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.53%.定量分析結(jié)果表明，鎮(zhèn)江香醋中HMF的含量為8.01 mg/kg.鎮(zhèn)江香醋中HMF含量的測(cè)定結(jié)果表明，與歐洲的醋樣品相比，鎮(zhèn)江香醋中的HMF含量相對(duì)較低.

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(責(zé)任編輯:李 寧)

Determination of 5-hydroxymethylfurfural in Zhenjiang Vinegar by HPLC

ZHANG Yu－yu1， SONG Yi1， ZHOU Ting－ting1， Lü Qian1， YANG Rui－xue2， LI Quan－h(huán)ong1
(1.College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China;2.Chinese Academy of Agricultural Mechanization Science，Beijing 100083，China)

A method for determination of 5－h(huán)ydroxymethylfurfural by high－performance liquid chromatography in Zhenjiang vinegar was developed.Samples were analyzed on a Venusil XBP－C18 column with oven temperature of 30℃，using a mixture of methanol and water(5∶95，v/v)as the mobile phase with the flow rate of 1.0 mL/min，and detected at 284 nm.Within the linear range of 0.014 3 ～0.085 8 μg，the correlation coefficient was 0.999 9.The method was accurate with the average recoveries rate and relative standard deviation of 98.66%and 5.53%，respectively.

Zhenjiang vinegar;high－performance liquid chromatographic;5－h(huán)ydroxymethylfurfural;content determination

TS264.2

A

1671－1513(2012)02－0039－04

2011－07－11

國(guó)家“十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAD23B01).

張玉玉，女，博士研究生，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué);

李全宏，男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)及農(nóng)產(chǎn)品綜合利用方面的研究.通訊作者.