田文禮， 趙亞周， 方小明， 高凌宇， 彭文君

(中國農(nóng)業(yè)科學院蜜蜂研究所農(nóng)業(yè)部授粉昆蟲生物學重點開放實驗室/國家蜂產(chǎn)品加工技術研發(fā)中心，北京 100093)

高效液相色譜法檢測蜂花粉中總維生素C

田文禮， 趙亞周， 方小明， 高凌宇， 彭文君

(中國農(nóng)業(yè)科學院蜜蜂研究所農(nóng)業(yè)部授粉昆蟲生物學重點開放實驗室/國家蜂產(chǎn)品加工技術研發(fā)中心，北京 100093)

為了得到一種效果較好的測定蜂花粉中總維生素C含量的方法，本文采用高效液相色譜法對油菜蜂花粉進行總VC的定性與定量分析，從結果的穩(wěn)定性、精密度和重現(xiàn)性三方面對其進行了考量.結果發(fā)現(xiàn)，總VC含量在12.70～200.00 μg范圍內(nèi)與色譜峰面積呈良好的線性關系，且回收率在95.71% ～98.60%，相對標準偏差為1.05%;穩(wěn)定性實驗的相對標準偏差為2.12%，精密度實驗的相對標準偏差為1.1%;最終測得油菜蜂花粉樣品的總VC平均含量為36.99 mg·(100 g)－1，相對標準偏差為1.43%.本研究所建立的HPLC測定蜂花粉中總VC含量的方法簡單快速、重現(xiàn)性好，可以較為準確的實現(xiàn)定性與定量分析.

高效液相色譜;蜂花粉;總維生素C

蜂花粉來源于大自然，是蜜蜂從顯花植物(蜜源植物和粉源植物)的花蕊內(nèi)采集的花粉粒，并加入其特殊腺體的分泌物、花蜜和唾液混合而成的一種不規(guī)則扁圓形顆粒物［1］.蜂花粉具有獨特的天然保健、醫(yī)療及美容價值，被譽為“濃縮的天然營養(yǎng)庫”.研究證實，蜂花粉中含有多種營養(yǎng)物質(zhì)，其中包括23種氨基酸、14種維生素和30多種微量元素以及大量的活性蛋白、核酸、黃酮類化合物及其他活性物質(zhì)［2－3］.蜂花粉的維生素種類和含量豐富，其中維生素C(vitamin C，VC)較為重要，其化學名為L-抗壞血酸，主要分為還原型VC、脫氫型VC和二酮古龍?zhí)撬?種，廣泛存在于蔬菜、水果等植物組織中，是人體新陳代謝所必需的營養(yǎng)物質(zhì)［4］.

VC溶于水或乙醇中，不溶于油等有機溶劑，在水溶液中易被氧化，堿性條件下易分解，弱酸條件下較穩(wěn)定.測定VC多依據(jù)其還原性質(zhì)，主要方法有2，6-二氯靛酚滴定法、碘滴定法、鉬藍比色法、紫外分光光度法、2，4-二硝基苯肼法、高效液相色譜法(high-performance liquid chromatography，HPLC)、熒光法以及電化學法等［5］.中華人民共和國供銷合作行業(yè)標準——蜂花粉(GH/T 1014—1999)通用理化要求規(guī)定VC(含量大于4 mg·(100 g)－1)的測定方法依據(jù)GB/T 12392—蔬菜、水果及其制品中總VC的測定方法(熒光法和 2，4-二硝基苯肼法)［6］.但是，蜂花粉中總VC含量的測定如采用2，4-二硝基苯肼比色法，存在操作步驟繁瑣、耗時長和平行樣品間測定結果偏差較大等不足;而采用熒光法對空白樣品的條件要求較高，且結果的重現(xiàn)性較差［7］.目前，關于采用HPLC法對蜂花粉中總VC含量的分析報道較少.本文擬建立一種利用高效液相色譜法測定蜂花粉中總VC含量的方法，以達到操作簡單、易控制且重現(xiàn)性好的效果，可以廣泛應用于實際生產(chǎn)中的質(zhì)量檢測，為開發(fā)利用蜂花粉中豐富的VC，提供一定的理論參考.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜂花粉由北京中蜜科技發(fā)展有限公司提供.

偏磷酸-乙酸溶液:稱取15 g偏磷酸，加入40 mL冰乙酸及250 mL水，加溫，攪拌，使之逐漸溶解，冷卻后加水至500 mL，于4℃冰箱保存7～10 d.

鄰苯二胺溶液(200 mg/L):稱取20 mg鄰苯二胺，使用前用水稀釋至100 mL.

VC標準溶液(1 mg/mL)(母液):準確稱取50 mg VC，用偏磷酸-乙酸溶液溶于50 mL容量瓶中，稀釋至刻度.

VC標準使用液(100 μg/mL):取10 mL VC標準液，用偏磷酸-乙酸溶液稀釋至100 mL.

1.2 儀器與設備

Agilent1200型高效液相色譜儀，熒光檢測器，Agilent1200色譜工作站;HY-2型調(diào)速多用振蕩器，江蘇省金壇市宏華儀器廠;AL-204型電子天平，Acculab公司.

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品制備

蜂花粉樣品經(jīng)高速組織搗碎機處理，稱取2 g加入50 mL偏磷酸-乙酸溶液中，振蕩萃取30 min，過濾;向過濾液中加入1 g活性炭，用力振搖1 min，過濾.吸取2 mL濾液置于10 mL帶蓋試管中，在暗室內(nèi)迅速向各管加入5 mL鄰苯二胺溶液，振搖混合，在室溫下反應35 min，過微濾膜后備用.

1.3.2 色譜條件

色譜柱為Agilent TC-C18(4.6 mm×150 mm)，柱溫為40℃，熒光檢測器為激發(fā)光波長338 nm，發(fā)射光波長420 nm.流動相為甲醇/磷酸二氫鉀溶液(40 mmol/L)=20/80(v/v);流速為1 mL/min.

2 結果與分析

2.1 定性分析

2.1.1 HPLC色譜圖對比

VC標準品的HPLC圖和蜂花粉樣品的HPLC圖分別如圖1和圖2.從圖1和圖2可以看出，VC標準品與蜂花粉樣品中VC色譜峰的保留時間和峰型一致，分別在8.152 min和8.197 min出現(xiàn)，可以肯定HPLC能對蜂花粉中VC進行準確定性.

圖1 VC標準品的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of VC standard

圖2 蜂花粉樣品的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of bee pollen samples

2.1.2 標準曲線及線性范圍測定

精密稱取 VC標準品 12.70，31.75，65.00，127.00，200.00 μg置于10 mL 容量瓶中，加偏磷酸-乙酸溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，配成標準工作液.用 HPLC進行測定，得到其線性方程為y=8.956x－0.397(R=0.999 6)(y為色譜峰面積，x為VC濃度).結合圖3與線性方程中的線性相關系數(shù)可以看出，VC含量在12.70～200.00 μg范圍內(nèi)與色譜峰面積呈現(xiàn)良好的線性關系.

圖3 VC標準曲線Fig.3 Calibration curve of VC

2.1.3 回收率實驗

在底物中含有VC 743.65 μg的基礎上，向其中添加不同量的標準品后，繼續(xù)測試VC含量，并計算回收率(見表1).從表1可以看出，5次重復實驗中，回收率在95.70% ～98.57%，并且相對標準偏差為1.05%.說明HPLC測試蜂花粉樣品中的VC含量具有較高的準確性，數(shù)據(jù)比較可靠.

表1 VC回收率實驗結果Tab.1 Recovery experiments of VC

2.2 定量分析

2.2.1 HPLC精密度實驗

精密度是指在同一實驗室中，同一工作人員采用同一臺儀器，在較短時間間隔內(nèi)，對樣品平行測定.實驗利用HPLC對油菜蜂花粉中的VC含量進行了5次實驗，結果見表2，發(fā)現(xiàn)實驗中所制備的油菜蜂花粉中 VC含量在36.24～37.18 mg·(100 g)－1，相對標準偏差為1.10%，說明本實驗所采用的方法進行蜂花粉中VC含量測定，結果的精密度良好.

表2 VC含量精密度實驗結果Tab.2 Precision experiments of VC content

2.2.2 HPLC穩(wěn)定性實驗

將油菜蜂花粉進行樣品制備，經(jīng) 0，1，2，3，4 和5 h時利用HPLC測定其VC含量(見表3)，各樣品平行測定5次.所得結果的相對標準偏差為1.05%，說明由該樣品制備方法得到的樣品中VC含量在5 h內(nèi)可以基本保持穩(wěn)定.

表3 VC含量穩(wěn)定性實驗結果Tab.3 Stability experiments of VC content

2.2.3 蜂花粉中VC含量測定

稱取油菜蜂花粉3份，各2 g，對其進行制備后，分別精密吸取20 μL，利用 HPLC進行 VC含量測定，每個樣品平行測定5次，結果如表4.樣品中VC含量平均值為36.99 mg·(100g)－1，相對標準偏差為1.43%.

表4 油菜蜂花粉中VC含量Tab.4 VC content of rape bee pollen

3 結論

研究建立了高效液相色譜法測定油菜蜂花粉中VC含量的方法，該方法操作簡單，結果的精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好.可以實現(xiàn)油菜蜂花粉中VC的定性和定量分析，為蜂花粉中VC的開發(fā)利用提供參考.

［1］Gonzalez G，Hinojo M J，Mateo R，et al.Occurrence of mycotoxin producing fungi in bee pollen［J］.International Journal of Food Microbiology，2005，105(1):1-9.

［2］Paramas A M G，Barez J A G，Marcos C C，et al.HPLC-fluorimetric method for analysis of amino acids in products of the hive(honey and bee-pollen) ［J］.Food Chemistry，2006，95(1):148-156.

［3］Almeida-Muradian L B，Pamplona L C，Coimbra S，et al.Chemical composition and botanical evaluation of dried bee pollen pellets［J］.Journal of Food Composition and Analysis，2005，18(1):105-111.

［4］Arrigoni O，De Tullio M C.The role of ascorbic acid in cell metabolism:between gene-directed functions and unpredictable chemical reactions［J］.Journal of Plant Physiology，2000，157:481-488.

［5］張昉，高蓉.維生素C檢測方法研究進展［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2009(2):457-460.

［6］中國蜂產(chǎn)品協(xié)會花粉專業(yè)委員會及科技委員會.GH/T1014—1999中華人民共和國供銷合作行業(yè)標準—蜂花粉［S］.北京:中國標準出版社.

［7］林桂榮，郭泳，付亞文，等.新鮮果蔬維生素C測定方法研究［J］.北方園藝，1999(2):7-9.

(責任編輯:李 寧)

Determination of Total Vitamin C in Bee Pollen by HPLC Method

TIAN Wen-li， ZHAO Ya-zhou， FANG Xiao-ming， GAO Ling-yu， PENG Wen-jun
(Key Laboratory for Insect-Pollinator Biology，Ministry of Agriculture/National R＆D Center for Bee Product Processing，Institute of Apiculture，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100093，China)

To obtain an efficient method for determination of total vitamin C(VC)in bee pollen，highperformance liquid chromatography(HPLC)was employed and investigated for its stability，precision and repeatability in qualitative and quantitative analysis of total VC in bee pollen.As the results，total VC content and chromatogram peak area presented good linear correlation.The recoveries were 95.71%～98.60%with RSD 1.05%.The RSD of the stability and precision experiments were 2.12%and 1.1%respectively.Total VC content in rape bee pollen was 36.99 mg/100 g in average，and its RSD was 1.43%.In conclusion，HPLC can be used as a simple and fast method for qualitative and quantitative analysis of total VC in bee pollen.

high-performance liquid chromatography;bee pollen;total vitamin C

TS207.3;S896.4

A

1671-1513(2012)02-0035-04

2012-02-27

國家現(xiàn)代蜜蜂產(chǎn)業(yè)技術體系資助項目(NYCYTI-43-KXJ17);科研院所技術開發(fā)專項資金資助項目(2009EG134274);農(nóng)業(yè)科技成果轉化資金資助項目(2010GB23260588).

田文禮，助理研究員，碩士，主要從事功能食品與生物活性物質(zhì)方面的研究;

彭文君，研究員，主要從事功能食品與生物活性物質(zhì)方面的研究.通訊作者.