管泳宇，吳滿剛，葛慶豐，于 海，汪志君

(揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225127)

豆豉自先秦時(shí)起源距今已有兩千多年的歷史。豆豉具有很高的營養(yǎng)價(jià)值［1］，可以藥食兼用，還具有驅(qū)寒健食等功效［2］。根據(jù)主要制曲微生物的不同，可以分為毛霉型、曲霉型和細(xì)菌型豆豉。目前，豆豉的生產(chǎn)仍然以完全靠經(jīng)驗(yàn)制作的自然發(fā)酵為主，無法采用合理有效的方法對產(chǎn)品的質(zhì)量進(jìn)行控制;此外，自然發(fā)酵有可能因腐敗菌和病原菌帶來衛(wèi)生和安全的隱患［3］。為了控制發(fā)酵，實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)的工業(yè)化，必須用純種發(fā)酵代替自然發(fā)酵。無論是我國的醬油，還是日本的納豆［4］、豆醬和印尼的天培［5］，都是在純種發(fā)酵的前提下實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的。豆豉生產(chǎn)過程中制曲工序主要產(chǎn)生豐富的酶系，因此制曲微生物的發(fā)酵特性和產(chǎn)酶特性非常關(guān)鍵［6－7］。就曲霉型豆豉而言，霉菌及部分細(xì)菌(如芽孢菌、葡萄球菌)生產(chǎn)胞外蛋白酶并直接作用于大豆蛋白［8］，將大分子蛋白質(zhì)水解成小分子肽類以及游離態(tài)氨基酸，這些既具有很強(qiáng)的生物活性又易為人體消化還對風(fēng)味的產(chǎn)生有積極作用;乳酸菌能降低體系酸度，產(chǎn)生特有風(fēng)味;酵母菌無氧發(fā)酵分解大分子物質(zhì)的同時(shí)產(chǎn)生乙醇，乙醇能夠與酸類物質(zhì)產(chǎn)生酯類物，對風(fēng)味的形成有很大貢獻(xiàn)［9］。本實(shí)驗(yàn)旨在對自然發(fā)酵豆豉中的微生物進(jìn)行分離、篩選、鑒定，為豆豉工業(yè)化、可控化、標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豆豉 自然發(fā)酵豆豉;蛋白胨、牛肉膏、酵母膏 生化純;SDS、羥甲基纖維素鈉、瓊脂糖等 分析純。

eps300電泳儀 上海UNICO;高速冷凍離心機(jī)5804R 北京艾澤信科技有限公司;分光光度計(jì)WFJ2000 尤尼柯(上海)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株分離純化 取2g豆豉樣，以無菌水定容至10mL，于搖床以120r/min浸提30min。取此溶液梯度稀釋 10－4～10－8，后取稀釋液 200μL 涂布于不同培養(yǎng)基(見表1)，挑取單菌落劃線培養(yǎng)(不同菌種使用不同培養(yǎng)基，如表1)，重復(fù)劃線培養(yǎng)2～3次，得到微生物單菌落。

1.2.2 霉菌鑒定 先根據(jù)菌株的菌落形態(tài)和菌絲形態(tài)，將分離得到的菌株中毛霉和曲霉區(qū)分開，然后按曲霉在PDA、CYA和CA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)對其進(jìn)行初步分類，最后按類別取有代表性的菌株，進(jìn)行鑒定［10］。

1.2.3 霉菌篩選 采用雙層瓊脂平板法(PDA雙層酪蛋白選擇培養(yǎng)基)以產(chǎn)生透明圈的大小作為篩選標(biāo)準(zhǔn)對初篩得到的菌株蛋白酶活力初篩。將6株活性較大的菌株進(jìn)行蛋白酶活力測定，選出活力最大的菌株。

表1 發(fā)酵豆豉中各種菌的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件Table 1 The media and condition of traditional fermented Dou－chi

樣品處理:于PDA液體培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)菌株，培養(yǎng)時(shí)間2d，取培養(yǎng)液進(jìn)行酶活力測定。蛋白酶活力測定采用 Folin法［11］，纖維素酶活力測定使用Matsuura and Obata 的方法［12］。

1.2.4 細(xì)菌篩選 根據(jù)備選菌株發(fā)揮的不同作用，參照發(fā)酵劑必須具備的特征，建立相應(yīng)篩選體系，見表2。

表2 備選發(fā)酵菌株的篩選實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2 Design of screening test of pre－selceted strains

蛋白提取物降解能力測定:參照汪家政與范明［13］的方法，并加以改進(jìn)。濃縮膠為4%，分離膠為15%。上樣:將兩樣品濃度調(diào)至1mg/mL且與5倍濃度樣品緩沖液(含60mmol/L Tris，2%SDS，14.4mmol/L巰基乙醇、25%甘油，用4mol/L鹽酸調(diào)pH至6.8，加入0.1%溴酚藍(lán))按體積比4∶1混合，煮沸10min，上樣量均為10μL。電泳:起始電壓80V，樣品進(jìn)入分離膠后電壓調(diào)至150V。染色:加入考馬斯亮藍(lán)R－250染色液(甲醇∶冰醋酸∶水 =45∶10∶45，并加入 0.2% 考馬斯亮藍(lán)R－250)，混合染色40min。脫色:水洗凝膠，加脫色液(甲醇∶冰醋酸∶水 =5∶5∶40)于搖床脫色。

1.3 篩選菌株分子鑒定

1.3.1 總DNA提取 破壁:收集霉菌生長3d菌絲，無菌水洗滌后擠干水分，液氮研磨;取2mL酵母菌生長1d菌懸液無菌水洗滌后離心去上清，沉淀用567μL TE緩沖液重懸加入酸洗玻璃珠破壁;取2mL細(xì)菌生長2d菌懸液無菌水洗滌后離心去上清，沉淀用567μL TE緩沖液重懸，加入40μL 10%SDS和10μL 20mg/mL蛋白酶以及10μL 20mg/mL溶菌酶，37℃處理2h。DNA 提取:加入100μL 5mol/L NaCl，再加入 80μL CTAB/NaCl，混勻，65℃ 溫育 10min后加入等體積的氯仿/異戊醇，混勻，10000r/min離心5min，保留上清。上清中加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，混勻，10000r/min 離心 5min，保留上清。加入0.6倍體積的異丙醇，混勻，10000r/min離心5min，收集DNA沉淀，用70%乙醇離心洗滌DNA沉淀。用50μL TE緩沖液溶解DNA，加入終濃度為20μg/mL RNaseA，4℃保存。

1.3.2 鑒定 分別對霉菌進(jìn)行ITS rDNA鑒定、酵母進(jìn)行26S rDNA鑒定、細(xì)菌進(jìn)行16S rDNA鑒定［14］。不同菌株使用的不同引物。真菌:上游引物5'－TCC GTA GGT GAA CCT GCG G－3'，下游引物 5'－TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC－3';酵母:上游引物 5'－GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG－3'，下游引物 5'－GGT CCG TGT TTC AAG ACG G－3';細(xì)菌:上游引物5'－AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG－3'，下游引物 5'－AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA－3'。

1.3.3 PCR反應(yīng)體系建立 PCR反應(yīng)體系包括:10×PCR 緩沖液5μL，dNTP 1μL，兩端引物的終濃度均為0.2μmol/L，模板 DNA 為200ng，Taq聚合酶2U，用ddH2O將體系調(diào)整至50μL。PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性 5min，94℃變性 1min，55℃退火 1min，72℃延伸90s，35個循環(huán)，72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后取3μL PCR產(chǎn)物經(jīng)濃度為15mg/mL瓊脂糖凝膠電泳檢測。后送樣至上海生工測序部測序。

1.3.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 利用NCBI中的Blast對DNA序列進(jìn)行對比分析，用構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。自GenBank下載的菌株如下:JQ02379 Staphylococcus Xylosus、HM854231 Staphylococcus Xylosus、FJ210844 Staphylococcus Saproph、HQ449670 Lactobacillus Fermentu、DQ309297BacillusMojavensis、JQ653051 Bacillus Subtilis、AY267821 Pichia Ohmeri、AF548064 Aspergillus Niger、JQ619849 Aspergillus Niger、HQ285580 Aspergillus Oryzae、HQ285576AspergillusOryzae。 用Mega軟件［15］以 Maximum Likehood 法繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，以Bootstrap對系統(tǒng)樹進(jìn)行檢驗(yàn)1000次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離純化

豆豉發(fā)酵過程分離得到58株曲霉、7株毛霉;得到328株單菌株，經(jīng)革蘭氏染色和顯微鏡觀察，篩選出革蘭氏陽性的純菌株279株，不產(chǎn)生溶血圈、血漿凝固酶陰性的菌株206株，注射菌液的實(shí)驗(yàn)小鼠無不良反應(yīng)［16］，表明所篩菌為非致病性菌株。

2.2 霉菌優(yōu)勢菌種鑒定與篩選

2.2.1 霉菌優(yōu)勢菌種鑒定 豆豉曲中曲霉的種類如表3。

A5號菌株的菌落形態(tài)如圖1及表3所示。其菌絲形態(tài)為:分生孢子頭球形直徑100～300μm，孢梗徑1000～3000μm，直徑 5～15μm;頂囊呈燒瓶形或近球形20～40μm;產(chǎn)包結(jié)構(gòu)單層或雙層;分生孢子近球形，直徑5μm，壁光滑。初步鑒定為:環(huán)繞亞屬，黃綠組，米曲霉原變種(Aspergillus oryzae)。

A41號菌株的菌落形態(tài)如圖2及表3所示。其菌絲形態(tài)為:分生孢子頭球形直徑150～500μm，分生孢子梗于基質(zhì)產(chǎn)生，孢梗莖 1000～4000μm，直徑10～20μm;頂囊球形，直徑40～80μm;產(chǎn)包結(jié)構(gòu)雙層;分生孢子球形，直徑3～8μm，壁粗糙。初步鑒定為:環(huán)繞亞屬，黑色組，黑曲霉(Aspergillus niger)。

2.2.2 曲霉篩選 以菌株產(chǎn)蛋白酶活力大小，對經(jīng)鑒定無毒的黃曲霉(米曲霉)菌株進(jìn)行篩選。首先使用雙層瓊脂平板法篩選出蛋白酶活力較大的6株菌。蛋白酶解圈直徑大小:A2為(1.4±0.1)cm、A3為(1.2±0.1)cm、A5為(1.8±0.15)cm、A17為1.4cm、A23為(1.45±0.5)cm、A35為(1.45±0.5)cm。后對這6株菌株進(jìn)行蛋白酶活測定，篩選出蛋白酶活力最高的菌株。結(jié)合圖3與圖4，可得菌株A5具有較高的蛋白酶活力，可作為復(fù)合菌劑發(fā)酵菌株，其蛋白酶活力為355U/g。黑曲霉因與米曲霉產(chǎn)生拮抗作用且產(chǎn)蛋白酶量較米曲霉低，故不作繼續(xù)篩選。

表3 豆豉曲中的曲霉種類Table 3 Aspergillus Molds in douchiqu

圖1 A5菌絲及菌落形態(tài)Fig.1 Hyphae and colony morphology of A5

圖2 A41菌絲及菌落形態(tài)Fig.2 Hyphae and colony morphology of A41

圖3 不同菌株蛋白酶水解圈對比Fig.3 The circle of enzymatic hydrolysis of protein of strains

2.3 細(xì)菌篩選

2.3.1 細(xì)菌初篩 分離菌株初篩結(jié)果見表4。

由表4可知，經(jīng)初篩得出17株乳酸菌、5株葡萄球菌、3株芽孢桿菌和1株酵母符合篩選指標(biāo)的要求，可作為發(fā)酵的目標(biāo)菌株。

圖4 不同菌株蛋白酶活力值比較Fig.4 The activity of protease of strains

2.3.2 乳酸菌復(fù)篩 將17株菌接于脫脂乳，42℃培養(yǎng)，取凝乳時(shí)間較短的5株菌接入經(jīng)過前發(fā)酵的黑豆中進(jìn)行產(chǎn)酸測定。酸度測定值如圖5所示。

表4 分離菌株初篩結(jié)果Table 4 The fermented characters of one－step selected strains

圖5 復(fù)篩菌株產(chǎn)酸比較Fig.5 The acid－producing of selected strains

由圖5可見，5株乳酸菌產(chǎn)酸趨勢相近，但其表現(xiàn)出不同的酸度變化。0～8h時(shí)，菌株產(chǎn)酸較低且產(chǎn)酸率較低;8～18h時(shí)，菌株產(chǎn)酸增加較快且產(chǎn)酸率較大;18～22h，菌株進(jìn)入穩(wěn)定期，酸度停止增加。達(dá)穩(wěn)定期時(shí)，菌株M59酸度最高且酸度達(dá)平衡時(shí)間最快，可作為發(fā)酵的目標(biāo)菌株，其發(fā)酵20h終酸度66°T。

2.3.3 芽孢桿菌復(fù)篩 對經(jīng)初篩的芽孢桿菌進(jìn)行蛋白酶活力與纖維素酶活力測定，結(jié)果如圖6所示。

結(jié)果顯示，蛋白酶活最高的菌株為M231，M253次之，前者較后者高6.8%;纖維素酶活最高的菌株為M253，M231次之，前者較后者高27.2%。比較酶活差距，選擇M253為發(fā)酵的目標(biāo)菌株，其纖維素酶活為47U/g、蛋白酶活為140U/g。

圖6 芽孢桿菌蛋白酶活力與纖維素酶活力Fig.6 The activity of protease and bacillus of strains

2.3.4 葡萄球菌復(fù)篩 所選菌株對經(jīng)前發(fā)酵處理過的大豆蛋白降解圖譜見圖7。

圖7 不同菌株處理后發(fā)酵大豆蛋白SDS－PAGE電泳圖Fig.7 SDS－PAGE of soy proteins hydrolysis by strains

由圖7可知，將不同的菌株接種到經(jīng)前發(fā)酵處理的大豆蛋白提取物中，37℃發(fā)酵5～6d，和對照組CK相比，接種M101的蛋白分子量為45ku和31ku的條帶發(fā)生降解變淡;接種M184的蛋白降解情況相似，其分子量在31ku以上的蛋白條帶均發(fā)生明顯的降解;接種M21的肌原纖維蛋白降解情況最為明顯，大于31ku的大分子蛋白質(zhì)片段明顯減弱，而14.4～20ku區(qū)域條帶降解不明顯，推測為生成14～20ku之間的小分子片段，20ku處的蛋白條帶也發(fā)生明顯的降解。綜合菌株對蛋白的降解情況，最終選擇菌株M21作為發(fā)酵的目標(biāo)菌株。

2.4 篩選菌株分子鑒定

2.4.1 PCR擴(kuò)增片段結(jié)果 篩選菌株DNA提取結(jié)果如圖8所示，篩選菌株P(guān)CR結(jié)果如圖9。

圖8 提取的DNA電泳結(jié)果Fig.8 Gel electrophoresis results of DNAs

圖9 DNA的PCR電泳結(jié)果Fig.9 Gel electrophoresis results of PCR of DNAs

用1%(W/W)的瓊脂糖凝膠電泳對菌株的總DNA和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作電泳檢測，溴化乙錠染色后通過凝膠成像系統(tǒng)觀察并照相。從圖8看出，在大分子量區(qū)域出現(xiàn)明顯熒光條帶。因提取量較大且菌體使用液氮研磨，故有一定的拖尾現(xiàn)象，但不影響其后續(xù)PCR操作，能滿足16S rDNA擴(kuò)增和測序的需要。如圖9知，曲霉A5、A41在600～700bp處出現(xiàn)熒光條帶，酵母A71在600bp處出現(xiàn)熒光條帶，細(xì)菌M21、M59、M253在1500bp左右出現(xiàn)熒光條帶;與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相符，且條帶亮度高無拖尾，能滿足后續(xù)序列測定的需要。

2.4.2 測序及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 基因序列分析顯示，真菌A5、A41、A71 PCR產(chǎn)物基因序列長度分別為 622、619、593bp。細(xì)菌 M21、M59、M253 PCR 產(chǎn)物基因序列長度分別為 1432、1453、1411bp。A5、A41、A71、M21、M59、M253 于 Genbank 登錄號分別為:JX393053、 JX393054、 JX393055、 JX393056、JX393057、JX393058。將序列與 GenBank中相關(guān)菌株的對應(yīng)序列進(jìn)行比較，系統(tǒng)發(fā)育樹如圖10所示。

圖10 采用Maximum Likehood法構(gòu)建的菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.10 The phylogentic tree based on rDNA sequence using Maximum Likehood methods

由圖10可得，M21與木糖葡萄球菌JQ023729的支持率為90%，M21、JQ023729與木糖葡萄球菌HM854231的支持率為99%，證明此菌株為木糖葡萄球菌。類似分析可得:M59為發(fā)酵乳桿菌、M253為枯草芽孢桿菌、A71為畢赤酵母、A41為黑曲霉、A5為米曲霉。

3 討論

豆豉的生產(chǎn)分為前酵(制曲)和后酵兩個階段。豆豉制曲期間在霉菌的作用下，氨基酸態(tài)氮以及蛋白酶酶活隨著制曲時(shí)間的進(jìn)行而增加，后到達(dá)某一值時(shí)開始降低。后發(fā)酵期間由于枯草芽孢桿菌對應(yīng)的需氧型發(fā)酵，使得體系中氧氣迅速減少，且枯草芽孢桿菌能夠產(chǎn)生蛋白酶與纖維素酶幫助分解大分子物質(zhì)產(chǎn)生特有的風(fēng)味［17］;乳酸菌進(jìn)一步分解大分子物質(zhì)，產(chǎn)生的物質(zhì)猶以酸居多;酵母菌無氧發(fā)酵分解大分子物質(zhì)的同時(shí)產(chǎn)生乙醇，乙醇能夠與酸類物質(zhì)產(chǎn)生酯類物［18］。菌株的共同作用形成了豆豉特有的風(fēng)味。本研究根據(jù)不同菌株的發(fā)酵特性對豆豉發(fā)酵過程中優(yōu)勢菌株進(jìn)行篩選，后對菌株進(jìn)行分子檢測，初步確定菌種科屬。在我國，曲霉型豆豉的制作由于參加發(fā)酵的菌種多、發(fā)酵過程變化大、沒有明確菌體的菌種，生產(chǎn)過程及發(fā)酵均難以控制且存在一定的安全隱患，故明確豆豉發(fā)酵菌種，并利用豆豉中優(yōu)良菌種進(jìn)行豆豉制作具有重要意義。

4 結(jié)論

本研究對曲霉型豆豉發(fā)酵優(yōu)勢菌株進(jìn)行篩選。初篩獲得真菌3種、細(xì)菌3種。復(fù)篩以蛋白酶活力為指標(biāo)篩米曲霉、以產(chǎn)酸率為指標(biāo)篩選乳酸菌、以蛋白酶與纖維素酶活力為指標(biāo)篩選芽孢桿菌、以蛋白降解能力為指標(biāo)篩選葡萄球菌。篩選得到:A5蛋白酶活355U/g、M59 發(fā)酵 20h 終酸度66°T、M253 纖維素酶活47U/g、蛋白酶活140U/g、高蛋白降解率菌株M21。對篩選菌株進(jìn)行分子鑒定、構(gòu)建進(jìn)化樹。鑒定得到:A5為米曲霉、A41為黑曲霉、M21為木糖葡萄球菌、M59為發(fā)酵乳桿菌、A71為畢赤酵母、M253為枯草芽孢桿菌。

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