范文來，徐 巖，史斌斌

(教育部工業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，江南大學(xué)生物工程學(xué)院，釀造微生物與應(yīng)用酶學(xué)研究室，江蘇無錫214122)

氨基甲酸乙酯(EC，ethyl carbamate)天然存在于發(fā)酵食品中［1］，1943 年發(fā)現(xiàn) EC 具有致癌性［2］。早期，世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究把EC歸為一種可能對人類致癌的物質(zhì)(2B類)。2007年3月，該機(jī)構(gòu)經(jīng)過重新分類，已把EC歸為2A類致癌物［3－4］。大量文獻(xiàn)報道了EC的基因毒性和致癌性，但飲料酒中EC的檢測到1985年才引起關(guān)注，加拿大官方發(fā)現(xiàn)多種飲料酒中EC的含量很高。當(dāng)年，加拿大設(shè)定了飲料酒中EC最高允許濃度，規(guī)定佐餐葡萄酒、加強(qiáng)葡萄酒(fortified wine)、蒸餾酒(distilled spirits)、清酒(sake)和水果白蘭地(fruit brandy)中EC含量分別不得超過 30、100、150、200、400μg/L［5］。研究表明，飲料酒中EC由尿素或氰化物與乙醇反應(yīng)產(chǎn)生［5］，主要形成于發(fā)酵、加熱或蒸餾以及儲存過程［6］。尿素公認(rèn)為是葡萄酒中EC最主要的前體物［5］，在葡萄酒儲存過程中EC會繼續(xù)產(chǎn)生，且隨溫度的升高生成速度加快［7］，通?？刂频陀?4℃貯存溫度避免大量EC的形成［8］。氰化物是威士忌與白蘭地酒中EC的前驅(qū)物［9］。飲料酒中EC濃度最高的是石果白蘭地(stone－fruit brandy)，最高達(dá) 22mg/L［5］。我國黃酒中 EC的研究較早［10－11］，白酒中EC的研究是近幾年才開始的，通常采用氣相色譜－質(zhì)譜法(GC－MS)［12－14］、二維氣相色譜法(MDGC)［15］、頂空固相微萃取(HSSPME)結(jié)合 GC－MS［16－17］檢測白酒中的 EC，但沒有發(fā)現(xiàn)發(fā)酵過程中固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)大曲與酒醅檢測方法的研究報道。為深入研究白酒發(fā)酵過程中EC及其前驅(qū)物尿素的變化規(guī)律，本研究采用超聲萃取處理白酒大曲和酒醅，HS－SPME方法來定量分析白酒大曲和酒醅中EC的含量。通過對白酒大曲和酒醅進(jìn)行定量分析，確定EC的演化規(guī)律;同時對白酒大曲和酒醅中的尿素進(jìn)行檢測，確定EC與尿素之間的相互關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

內(nèi)標(biāo)氨基甲酸丙酯(PC) 上海安譜科學(xué)儀器有限公司;氯化鈉、磷酸、硫酸、尿素、硫代氨基脲、二乙酰一肟 中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司;實驗專用水 超純水(Milli－Q 系統(tǒng)，Millipore，Badford，MA，USA);白酒大曲和酒醅 由相應(yīng)白酒廠提供。

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC 6890N－MSD 5975)美國Agilent公司;固相微萃取自動進(jìn)樣器(MPS2)德國Gerstel公司;固相微萃取頭PA Supelco公司;分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液配制 二乙酰一肟(DAM)溶液，濃度2.5×104mg/L，4℃冰箱保存。硫代氨基脲(TSC)溶液，濃度2.5×103mg/L，4℃冰箱保存。酸試劑:準(zhǔn)確量取300mL濃磷酸與10mL濃硫酸混合，分別倒入500mL容量瓶中，邊倒邊用自來水冷卻，最后用水定容至液面保持不變。顯色劑:按比例DAM溶液∶TSC溶液∶酸試劑 =2.5∶1∶50(V/V/V)混合三種溶液，搖勻后備用。顯色劑現(xiàn)配現(xiàn)用。尿素溶液(25mg/L):配濃度較大的母液作為儲藏液，稀釋得到梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 EC檢測樣品預(yù)處理 白酒大曲和酒醅的預(yù)處理(超聲萃取):稱量10g大曲(或者酒醅)，添加1%CaCl2(酒醅不添加)，用30mL(酒醅添加20mL)水作為浸提劑，浸泡30min，超聲30min(功率60W，超聲頻率40kHz)。然后在8000r/min于4℃下離心10min，收集上清浸提液。頂空固相微萃取(HSSPME):取8mL的上清浸提液到20mL的頂空瓶中，加入5μL內(nèi)標(biāo)PC，加入3g氯化鈉。插入萃取頭，預(yù)熱后萃取吸附，然后250℃下解吸5min。

1.2.3 GC－MS方法 GC條件:進(jìn)樣口溫度250℃，載氣He，流速2mL/min，不分流進(jìn)樣，色譜柱為DBFFAP(60m ×0.25mm ×0.25μm，J＆W Scientific)。升溫程序為:50℃恒溫2min，以5℃/min的速度升溫至170℃，再以 10℃/min的速度升溫至 230℃，保持5min。MS條件:EI電離源，電子能量70eV，離子源溫度230℃，掃描范圍35.00～350.00amu。MS檢測器采用SIM模式，特征離子m/z 62用于EC和內(nèi)標(biāo)PC兩種物質(zhì)的定量。質(zhì)譜分析用數(shù)據(jù)庫NIST05a1L。

1.2.4 EC標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 取超純水8mL，添加梯度濃度的EC標(biāo)準(zhǔn)品，再加入內(nèi)標(biāo)溶液，HS－SPME以及GC－MS檢測，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法，以待測物EC峰面積與內(nèi)標(biāo)PC峰面積之比為橫坐標(biāo)(x)，待測物EC濃度與內(nèi)標(biāo)PC濃度之比值為縱坐標(biāo)(y)，線性回歸，對目標(biāo)化合物進(jìn)行定量。

1.2.5 尿素分光光度計測定 參照文獻(xiàn)方法［18］，以超純水作為空白，在比色管中加入待測樣品1mL，再加入15mL顯色劑，定容到25mL，充分搖勻，于沸水浴(電磁爐燒水)中加熱26min，取出于流動的自來水中冷卻14min，再于室溫下分光光度計比色，波長527nm，光程1cm。

1.2.6 尿素標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 準(zhǔn)備7只25mL比色管，依次加入 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3mL 的 25mg/L 尿素溶液，各管再分別加入15mL顯色劑，全部定容至25mL，充分搖勻，于沸水浴中加熱26min，取出于流動的自來水中冷卻14min。迅速取出于室溫下分光光度計比色，波長527nm，光程1cm。

以尿素含量為縱坐標(biāo)，比色結(jié)果OD值為橫坐標(biāo)，作尿素－吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 EC檢測方法評價

將一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液置于優(yōu)化好的萃取條件下(萃取溫度70℃，萃取時間45min)，加入內(nèi)標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，結(jié)果詳見表1。

表1 酒醅和大曲中EC定量方法的線性及檢測限Table 1 Linearity and limit of detection of EC detected in fermented grains and daqu

從表1可以看出，該方法可以檢測的EC下限達(dá)7.8μg/L，檢測上限達(dá) 600μg/L，線性范圍寬;線性關(guān)系良好(R2＞0.99)。由表2可知，準(zhǔn)確度(平均RSD 7.51%)、回收率(平均118%)較好。以信噪比等于3為標(biāo)準(zhǔn)，EC的檢測限(LOD)1.16μg/L，該方法可用于大曲和酒醅中EC的檢測。

表2 酒醅和大曲中EC定量方法的準(zhǔn)確度和回收率(n=3)Table 2 Recovery and precision of EC detected in fermented grains and daqu

2.2 尿素檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用1.2.6的步驟制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線如表3，可知在0～60mg/L的線性范圍內(nèi)，該方法的線性關(guān)系很好(R2＞0.99)。

表3 酒醅和大曲中尿素定量方法線性Table 3 Linearity of urea detectedin fermented grains and daqu

2.3 白酒成品大曲中EC和尿素

對不同類型的大曲進(jìn)行了分析，結(jié)果如表4。

由表4可以看出，不同類型大曲中尿素含量相差比較大。高溫曲(發(fā)酵溫度58～60℃)的三個樣品中尿素含量比較低，平均含量243.24mg/kg，超高溫曲(發(fā)酵溫度 65～70℃)和中溫曲(發(fā)酵溫度55～56℃)中尿素的含量則比較高，平均含量分別為512.57mg/kg和475.74mg/kg。這一現(xiàn)象與EC的含量變化類似，即超高溫曲與中溫曲EC含量高，而高溫曲EC濃度較低。

2.4 白酒酒醅中EC和尿素變化

表4 不同類型大曲中EC和尿素含量Table 4 Concentration of EC and urea in different type of Daqu

圖1 清香型大與二酒醅發(fā)酵過程中尿素與EC變化Fig.1 Changes of urea and EC of fermented grains of light aroma type liquor in the fermentation

2.4.3 兼香型酒醅發(fā)酵過程中EC與尿素的變化兼香型酒醅在發(fā)酵過程中開始時尿素含量上升，發(fā)酵至30d，尿素含量達(dá)最大(88.01mg/kg)，然后開始下降，至發(fā)酵終了時，尿素濃度下降到79.45mg/kg(見圖2)。EC的變化與尿素的變化同步，發(fā)酵至30d時，EC達(dá)最大值(130.69μg/kg)，然后開始下降，至發(fā)酵終了時，EC濃度降至122.89μg/kg。

表5 濃香型大酒醅中尿素與EC變化Table 5 Changes of urea and ECin fermented grain of strong aroma type liquor

表5 濃香型大酒醅中尿素與EC變化Table 5 Changes of urea and ECin fermented grain of strong aroma type liquor

注:0、2d是指濃香型酒醅堆積的天數(shù)，25、30、60d是指發(fā)酵時間。

0 2 25 30 60尿素(mg/kg)發(fā)酵時間(d)33.70 24.02 32.21 26.63 28.12 EC(μg/kg)＜q.l. ＜q.l. 167.99 149.18 112.12

圖2 兼香型酒醅發(fā)酵過程中尿素與EC變化Fig.2 Changes of urea and EC of fermented grains from complex aroma type liquor in the fermentation

比較清香型、濃香型與兼香型三種不同香型白酒，具有如下共同特點:一是出窖(出缸)時，EC濃度在110～130μg/kg，但尿素濃度在 26～80mg/kg。有研究表明，黃酒中尿素含量約在 20～30mg/L［20－21］，高的可達(dá)35mg/L［22］;二是EC的增長或下降與尿素的變化基本同步，推測白酒中EC的形成可能是尿素途徑，而不同于同是糧食蒸餾酒的威士忌－氰化物途徑。

成品黃酒中 EC 含量 116～205μg/L［23］，白酒中EC 濃度在 78～120μg/L(折算成 40%vol)［17］，這一數(shù)值低于黃酒中EC濃度。黃酒中EC主要是黃酒發(fā)酵結(jié)束后煎酒與黃酒貯存老熟階段產(chǎn)生的。研究發(fā)現(xiàn)在黃酒生產(chǎn)用水和糖化液中未檢測到EC，米酒、發(fā)酵液、煎酒液和成品黃酒中平均含量在8.2、7.9、21.6和52.7μg/kg［24］。從白酒酒醅中 EC 濃度看，這一數(shù)值比發(fā)酵結(jié)束后黃酒中7.9μg/L(發(fā)酵液)要高得多。推測這可能與白酒多菌種發(fā)酵中菌系比黃酒豐富有關(guān)，也與白酒生產(chǎn)中使用小麥、豌豆等高蛋白質(zhì)含量的原料有關(guān)。

2.4.4 兼香型酒醅配料與蒸餾前后EC與尿素的變化 配料后，由于加入高粱，酒醅中尿素與EC濃度均下降，分別下降25.37%和32.08%;蒸餾后，酒醅中尿素和EC濃度比配料后濃度低。蒸餾后，酒醅中尿素和EC濃度分別下降15.37%和13.57%。這主要是糧食的稀釋與蒸餾作用引起的。

圖3 兼香型酒醅配料、蒸餾前后EC變化Fig.3 Changes of urea and EC of fermented grains from complex aroma type liquor before and after mixed and distillation

3 結(jié)論

超聲萃取固體基質(zhì)樣品，頂空固相微萃取技術(shù)(HS－SPME)結(jié)合氣相色譜－質(zhì)譜(GC－MS)檢測白酒大曲和酒醅中氨基甲酸乙酯(EC)的方法是一種快速、準(zhǔn)確、環(huán)境友好的方法，該分析方法線性范圍寬，線性關(guān)系良好，準(zhǔn)確度、回收率較好。通過研究大曲和酒醅中EC和尿素的變化，發(fā)現(xiàn)酒醅發(fā)酵過程中EC的變化與尿素濃度變化基本同步。

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