唐姝姝，唐書澤，* ，李紅愛，范方輝，吳希陽，陳振強

(1.暨南大學食品科學與工程系，廣東廣州510632;2.暨南大學光電工程系，廣東廣州510632)

腸出血性大腸桿菌(EHEC)O157是上世紀末新發(fā)現(xiàn)的危害嚴重的新型人類致病菌，能夠致人腹瀉、出血性結腸炎(HC)，還可在5%～10%的病例中引發(fā)溶血性尿毒綜合征(HUS)及血栓性血小板減少紫癜(TTP)等嚴重并發(fā)癥，嚴重者可致死亡［1］。該菌對加熱的抵抗力比其他腸道菌要強，少數(shù)巴氏殺菌也不能將其完全殺滅，在水中可存活數(shù)月，在冷藏條件下比在室溫條件下能存活更久［2］。近20年來，EHEC O157∶H7引發(fā)的食物中毒在世界各地都有不同規(guī)模的暴發(fā)流行，已經(jīng)成為全球性的公共衛(wèi)生問題，對人們的健康構成了巨大威脅［1］。光動力療法(Photodynamic therapy，PDT)是目前國際上正在發(fā)展的一種新技術，它主要利用光激活光敏劑產(chǎn)生光化學效應選擇性的殺傷病原微生物，目前已經(jīng)成功應用于惡性腫瘤的治療等方面。光動力滅菌技術(APDT)基于光動力作用，是指利用光敏劑能夠選擇性富集在目標細胞或組織(如各種病源微生物)，并在特定波長的可見光照射情況下生成大量活性氧，進而通過活性氧與多種生物大分子的相互作用，損傷目標細胞組織從而影響其正常生理功能，但不傷害周圍細胞和組織的特性，實現(xiàn)對目標微生物有效殺滅的一項新技術［2－4］。亞甲基藍(Methylene blue，MB)是一種常見的堿性染料，由于其滲透系數(shù)高于其他染料，易穿透細胞膜在細菌體內(nèi)部集中，從而在細菌的細胞膜上染色，于特定波長的光結合產(chǎn)生光動力學效應。在對細菌進行光動力作用前需要將其置于光敏劑中避光孵育，這段時間可以使光敏劑停留在菌體內(nèi)并聚集，提高光動力作用的殺菌效果［5］。國外從90年代起已開展了基于MB的光滅活血漿中病毒的研究工作，但在微生物方面的應用才剛剛起步［6－7］。MB－APDT 對革蘭氏陽性菌有很強的殺傷作用，而其在革蘭氏陰性菌中的研究卻鮮有報道。革蘭氏陰性菌由于具有復雜的細胞壁結構，屏蔽了細胞膜與單重態(tài)氧的有效結合，降低了光動力療法的殺傷作用，使得其比陽性菌更難殺滅［8－9］。本實驗選擇腸出血性大腸桿菌O157作為實驗菌株，通過對各種殺菌條件的探索，提高MB－APDT處理對O157的滅活效果，尋求該技術對革蘭氏陰性菌的最佳作用條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

腸出血性大腸桿菌(EHEC)O157菌株 由廣州市疾病預防控制中心饋贈;細菌計數(shù)培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基 均購自青島海博生物技術有限公司;亞甲基藍(10g/L) 購自上海紅綠光敏劑研究所有限公司。

U21901雙光束紫外可見光分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;75W溴鎢燈(光功密度200mW/cm2) 北京卓立漢光儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細菌接種及培養(yǎng) 將活化的大腸桿菌的菌懸液以1∶100的比例接種于100mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃下振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，離心收集菌體(4000r/min，10min)，棄去上清液，使菌體重新懸浮于0.1mol/mL的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，并使其OD600=0.5(相當于107CFU/mL左右)。

1.2.2 單因素影響實驗 以O157菌落數(shù)為指標，分別以MB濃度、光照時間、孵育時間為因素，進行單因素實驗。

1.2.2.1 光敏劑濃度實驗［10］用PBS稀釋MB，加入菌液，配制 MB 終濃度分別為 0、1、5、10、25、50、75mg/L的菌懸液，備用。

將不同濃度 MB的菌懸液于37℃避光孵育10min后進行光照，即在96孔細胞培養(yǎng)板任取一孔，加入200μL菌懸液，37℃避光孵育10min，放在距離溴鎢燈光源20cm處光照10min。同時設置不加光敏劑、不孵育且不光照的空白對照組。

1.2.2.2 光照時間實驗 將MB濃度為10mg/L的菌懸液于37℃避光孵育10min后進行不同時長的光照，放在距離溴鎢燈光源20cm處光照0、5、10、20、30、45、60min。同時設置不加光敏劑、不孵育且不光照的空白對照組。

1.2.2.3 孵育時間實驗 將MB濃度為10mg/L的菌懸液于 37℃ 分別避光孵育 0、1、5、10、15、20、30min后進行光照。同時設置不加光敏劑、不孵育且不光照的空白對照組。

1.2.3 響應曲面法實驗設計 根據(jù)Box－Behnken的中心組合實驗設計原則，選擇3因素3水平的響應面分析方法，以MB濃度、光照時間、孵育時間為主要考察因素，各因素水平及編碼如表1所示。

1.2.4 細菌平板菌落計數(shù) 將1.2.2處理所得的菌懸液均以1∶10梯度稀釋后，每個梯度各取100μL于細菌平板菌落計數(shù)培養(yǎng)基平皿中，37℃生化培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)24h后進行平板菌落計數(shù)。為了使圖表更清晰，菌落計數(shù)的結果以對數(shù)logCFU(mL)表示，并繪制相應的折線圖。實驗重復3次，取平均值。

表1 響應面實驗因素水平表Table 1 The design of response surface methodology

1.2.5 統(tǒng)計分析 用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，結果以平均值±標準差表示，顯著性差異用t檢驗，p＜0.05為顯著差異。

2 結果與分析

2.1 MB－APDT對腸出血性大腸桿菌O157殺傷作用的單因素實驗

2.1.1 MB濃度對腸出血性大腸桿菌O157菌落數(shù)的影響 不同濃度MB下腸出血性大腸桿菌O157的菌落數(shù)見圖1。當MB濃度為1mg/L和5mg/L時，MB－APDT雖對細菌有一定的殺傷作用，但是殺傷效果不理想。MB濃度為10mg/L以上，O157的菌落數(shù)減少了3個對數(shù)以上，即能使99.9%以上的O157失活?？梢姡庹諚l件下，在MB的一定濃度范圍內(nèi)，O157的菌落數(shù)隨著MB濃度的增大而減少。而當MB濃度增加到一定程度，會在細菌細胞內(nèi)外形成動態(tài)平衡，阻礙MB進一步進入細菌細胞，反而降低了光動力的殺傷效果［11］。

圖1 MB濃度對腸出血性大腸桿菌O157菌落數(shù)的影響Fig.1 Effect of MB concentrations on LogCFU of EHEC O157

2.1.2 光照時間對腸出血性大腸桿菌O157菌落數(shù)的影響 不同光照時間下腸出血性大腸桿菌O157的菌落數(shù)見圖2。在其他條件相同的情況下，光照時間不同，MB－APDT的殺菌效果也不同。光照時間由5min增加至60min，菌落數(shù)呈現(xiàn)先顯著減少后略有增加的趨勢;在光照時間為30min時，O157的菌落數(shù)最少約為1.45個對數(shù)。

2.1.3 孵育時間對腸出血性大腸桿菌O157菌落數(shù)的影響 不同孵育時間下腸出血性大腸桿菌O157的菌落數(shù)見圖3。可見，隨著孵育時間的延長，開始時菌落數(shù)逐漸減少，至15min時達到最低點2個對數(shù)，再繼續(xù)延長孵育時間超過15min，菌落數(shù)開始略上升。

表3 回歸模型方差分析及顯著性檢驗Table 3 Reliability equation and significance test of the model

圖2 光照時間對腸出血性大腸桿菌O157菌落數(shù)的影響Fig.2 Effect of illumination time on LogCFU of EHEC O157

在相同的MB濃度及光照時長下，孵育時間過短，MB與細菌細胞結合不完全，未能在菌體內(nèi)集中，不利于光動力作用;但繼續(xù)延長孵育時間至15min以上時，菌落數(shù)不會繼續(xù)下降反而略有上升，這是由于MB與細菌細胞結合完全后，MB已在菌體內(nèi)達到飽和，繼續(xù)延長孵育時間反而不利于MB進入，從而降低了 MB－APDT 的殺傷效果［12］。

圖3 孵育時間對腸出血性大腸桿菌O157菌落數(shù)的影響Fig.3 Effect of incubation time on the LogCFU of EHEC O157

2.2 響應面分析MB－APDT優(yōu)化實驗

2.2.1 模型方程的建立與顯著性檢驗 按照Box－Behnken實驗設計的統(tǒng)計學要求，根據(jù)實驗因素和水平的要求，設計17次實驗，實驗結果如表2所示。

表2 響應面實驗設計與結果Table 2 The experiment design and result of Box－Behnken response surface

應用Design Expert 7.0軟件，對表2中的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，可得O157菌落數(shù)(Y)與MB濃度(A)、光照時間(B)、孵育時間(C)之間的多項二次回歸方程為:Y=1.34－0.056A－(1.000E－002)B－0.081C－0.065AB+0.028AC－0.025BC+0.071A2+0.13B2+0.061C2。

該模型的方差分析和顯著性檢驗見表3。該模型p=0.0155＜0.05，表明二次多元回歸模型回歸效果顯著，不同處理間的差異顯著，失擬項p=0.0349＜0.05顯著;該模型的決定系數(shù)為0.9833，表明98.33%的實驗數(shù)據(jù)的可變性可用此模型解釋，僅有總變異的1.67%不能用此模型來解釋;回歸模型的擬合度好，預測值與實驗值高度相關。

二次多項式的回歸方程系數(shù)的顯著性檢驗表明，因素A和因素B對響應值的線性效應顯著，因素C對響應值的線性效應極顯著;因素AB對響應值的交互影響顯著，AC和BC對響應值的交互影響不顯著;說明3個因素均不同程度的對響應值產(chǎn)生了極顯著或顯著的影響。

2.2.2 O157菌落數(shù)響應曲面分析 三因素交互作用的響應面曲面圖見圖4～圖6。由此可分析評價任何兩因素對0157菌落數(shù)的交互影響，以確定最佳的因素水平范圍。

圖4 MB濃度與光照時間交互作用影響Fig.4 Effect of MB concentration and illumination time on the CFU of EHEC O157

圖5 MB濃度與孵育時間交互作用影響Fig.5 Effect of MB concentration and incubation time on the CFU of EHEC O157

圖6 MB濃度與孵育時間交互作用影響Fig.6 Effect of MB concentration and incubation time on the CFU of EHEC O157

由圖4知，MB濃度和光照時間相互作用對0157菌落數(shù)有顯著影響。當光照時長小于27.5min，隨著MB濃度的增加，O157菌落數(shù)呈現(xiàn)先下降后略微上升的趨勢;當光照時間較長，隨著MB濃度的增加O157菌落數(shù)會呈現(xiàn)下降的趨勢。在MB濃度不變的條件下，隨著光照時間的延長，0157菌落數(shù)呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。

圖5顯示，MB濃度和孵育時間對O157菌落數(shù)無顯著影響。MB濃度不變時，隨著孵育時間的延長，O157菌落數(shù)呈現(xiàn)下降的趨勢，且當孵育時間較長時，O157菌落數(shù)隨MB濃度變化不大;孵育時間不變時，隨著MB濃度的增加，O157菌落數(shù)也呈現(xiàn)下降的趨勢。

由圖6知，光照時間和孵育時間對O157菌落數(shù)的影響不顯著。孵育時間不變時，隨著光照時間的延長，O157菌落數(shù)呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢;在光照時間不變的條件下，對著孵育時間的延長，O157菌落數(shù)呈現(xiàn)下降的趨勢。

由Design Expert 7.0軟件得到的優(yōu)化條件的處理，確定最佳的反應條件為:MB濃度24.08mg/L、光照時間27.66min，孵育時間19.00min，預測值為1.00。在相應的條件下，實驗測得值為1.03，與理論預測值的相對誤差為3%，與預測值接近，達到了優(yōu)化條件的目的。

3 結論

MB濃度，光照時間及孵育時間在光動力滅菌技術中對O157菌落數(shù)都有顯著影響。應用APDT殺滅腸出血性大腸桿菌O157的最佳反應條件參數(shù)為:MB濃度 24.08mg/L、光照時間 27.66min，孵育時間19.00min，O157菌落數(shù)理論值為1.00，實驗值為1.03。

本課題組前期的研究工作已經(jīng)證實光動力殺菌技術對曲霉孢子［13］、革蘭氏陰性菌金黃色葡萄球菌［14］及單核細胞增多性李斯特菌［15］具有良好的滅菌效果，本實驗進一步優(yōu)化了應用MB－APDT殺滅革蘭氏陰性菌腸出血性大腸桿菌O157的反應條件。根據(jù)以往的相關滅菌技術，能使細菌菌落總數(shù)減少2～3個數(shù)量級以上的滅菌技術，即可以進行適當?shù)母纳坪髴糜谑称饭I(yè)的微生物控制中［16］。因此，光動力殺菌技術也有可能被開發(fā)成一種非常有效的殺滅革蘭氏陰性菌的技術應用于食品安全領域。

［1］嚴亞賢，華國修.大腸桿菌O157∶H7的毒力因子的研究進展［J］.畜牧與獸醫(yī)，2003，35(4):37－40.

［2］Feng P.Escherichia coli serotype O157∶H7:novel vehicles of infection and emergence of phenotypic variants［J］.Emerging Infectious Diseases，1995，1(2):47－52.

［3］Maisch T.Anti－microbial photodynamic therapy:Useful in the future［J］.Laser in Medical Science，2007，22(2):83－91.

［4］Minnock A，Vernon D，Schofiels J.Mechanism of uptake of a cationic water－soluble pyridinium zinc phthalocyanine across the outer membrane of Escherichia coli［J］.Agents Chemother，2000，44(4):522－527.

［5］Lacey A，Phillips D.The photosensitization of Escherichia coli using disulphonated aluminium phthalocyanines［J］.Journal of Photochemistry and Photobiology，2001，142(3):145－150.

［6］Orth K，Russ D，Beck G.Methylene blue in photodynamic therapy:From basic mechanisms to clinical applications［J］.Photodiagnosisand Photodynamic Therapy，2005，2(3):175－191.

［7］SahuK，BansalH，MukherjeeC，etal.Atomicforce microscopicstudy on morphologicalalterations induced by photodynamic action of Toluidine Blue O in Staphylococcus aureus and Escherichia coli［J］.Photochem Photobiol B，2009，96(1):9－16.

［8］Wilson M.Bactericidal effect of laser light and its potential use in the treatment of plaquerelated diseases［J］.International Dent Journal，1994，44:181－189.

［9］Minnock A，Vernon D，Schofiels J，et al.Use of a cationic water－soluble zinc phthalocyanine to photoinactivate both Gramnegative and Gram－positive bacteria［J］.Journal of Photochemistry and Photobiology，1996，32(3):159－164.

［10］周德慶.微生物學實驗教程［M］.北京:高等教育出版社，2006:109－113.

［11］Miroslava S，Petra O，Daniela H，et al.Photodynamic inactivation of Escherichia coli by methylene blue incorporated in ZSM－5 zeolite channels under red LED light［J］.Acta Chimica Slovaca，2010，3(1):41－50.

［12］Menezes S，Capella M A，et al.Photodynamic action of methylene blue:repair and mutation in Escherichia coli［J］.Journal of Photochemistry and Photobiology B－Biology，1990，5:505－517.

［13］李穎，唐書澤，任雅清，等.光敏化作用對曲霉孢子失活的影響［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34(8):22－24.

［14］任雅清，唐書澤，吳希陽，等.光動力對金黃色葡萄球菌的殺傷作用及其AFM觀察［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34(8):56－59.

［15］林少玲，唐書澤，唐姝姝，等.血啉甲醚對單增李斯特菌的光動力滅活作用及機理［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2011，37(3):83－87.

［16］Yoshimura M，Namura S，Akamatsu H，et al.Antimicrobial effects of phototherapy and photochemotherapy in vivo and in vitro［J］.British Dermatology，1996，135:528－532.