朱作華，蔡俠，嚴(yán)理，胡鎮(zhèn)修，李智敏，彭源德

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，長(zhǎng)沙410205)

生物乙醇是最有希望取代化石燃料用于交通運(yùn)輸?shù)娜剂?，利用豐富而廉價(jià)的木質(zhì)纖維素資源代替糧食生產(chǎn)燃料乙醇已經(jīng)受到了越來越多的關(guān)注。酶水解條件溫和、無污染、副產(chǎn)物少，是最有前景的纖維素降解方式，但由于木質(zhì)纖維素本身的理化特性及結(jié)構(gòu)組成的復(fù)雜性，酶有效降解纖維素前必須經(jīng)過預(yù)處理過程［1］。目前，比較有效的預(yù)處理方法包括利用酸、堿或者水作為催化劑在較高的溫度或壓力下進(jìn)行處理［2－4］。酸預(yù)處理能夠溶解掉半纖維素，但易產(chǎn)生副產(chǎn)物;堿預(yù)處理或許可以更有效的去除掉木質(zhì)素，但半纖維素可能變?yōu)殡y溶的聚合物;生物法也可以取得良好的預(yù)處理效果，但處理時(shí)間較長(zhǎng)［5－7］。顯然，選擇什么樣的預(yù)處理過程，需要考慮原料的種類(木本、草本植物或者農(nóng)業(yè)殘?jiān)?、組分等，也要考慮五碳糖利用等問題，靈活的預(yù)處理技術(shù)能使原料得到更充分利用［8］。

蘆葦(Phragmites australis)是多年生草本植物，主要生長(zhǎng)在溫帶和熱帶的濕地，具有重要的生態(tài)功能［9］。蘆葦分布廣泛、適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)快、產(chǎn)量高，不需要施肥，全世界種植面積約有1000萬公頃，我國現(xiàn)有14個(gè)蘆葦主產(chǎn)區(qū)，宜葦面積130萬公頃以上［10，11］。目前，蘆葦在農(nóng)村主要用于牲畜的草料和草墊等，工業(yè)上主要用作造紙?jiān)?。蘆葦?shù)漠a(chǎn)量和質(zhì)量主要取決于當(dāng)?shù)氐纳L(zhǎng)條件，每公頃干莖產(chǎn)量15－35噸，莖桿纖維素含量40%以上，半纖維素含量30%左右，用于燃料乙醇生產(chǎn)前景十分可觀，是一種很有潛力的可再生能源植物［9，10］。

目前，對(duì)蘆葦加工方面的研究主要針對(duì)蘆葦制漿［11，12］，作為能源植物只有少數(shù)進(jìn)行濕式氧化預(yù)處理研究［9］。本研究對(duì)蘆葦進(jìn)行稀硫酸、氫氧化鈉等預(yù)處理技術(shù)研究，對(duì)預(yù)處理及酶糖化效果進(jìn)行了比較分析，以期獲得適合蘆葦高效糖化的預(yù)處理方法。

1 材料與方法

1.1 材料

蘆葦取自益陽市沅江洞庭湖區(qū)，經(jīng)自然風(fēng)干后剪碎。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蘆葦化學(xué)組分分析

蘆葦?shù)幕瘜W(xué)組分直接影響蘆葦預(yù)處理效果及酶解糖得率，試驗(yàn)采用常規(guī)理化分析方法對(duì)蘆葦主要成分進(jìn)行分析。

1.2.2 稀硫酸預(yù)處理

1.2.2.1 稀硫酸濃度對(duì)蘆葦酶糖化的影響

稱取10g蘆葦原料，放入300ml三角瓶中，分別加入一定量0.0%(對(duì)照，不經(jīng)預(yù)處理直接酶解)、0.5%、1.0%、2.0%、4.0%、6.0%(v/v)的 H2SO4溶液，120℃反應(yīng) 60min，調(diào) pH 值 5.0，并用蒸餾水調(diào)成浴比1:15，然后進(jìn)行酶解處理。

1.2.2.2 稀硫酸預(yù)處理正交試驗(yàn)

在稀硫酸濃度試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化影響稀硫酸預(yù)處理效果的主要工藝，進(jìn)行三因素三水平9組試驗(yàn)，三因素為稀硫酸濃度(A)、反應(yīng)時(shí)間(B)、反應(yīng)溫度(C)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)表如表1

表1 稀硫酸正交試驗(yàn)因素及水平Tab.1 Factors and levels of the H2SO4orthogonal tests

1.2.3 氫氧化鈉預(yù)處理

1.2.3.1 氫氧化鈉濃度對(duì)蘆葦酶糖化的影響

稱取10g蘆葦原料，放入300ml三角瓶中，加入濃度分別為0.0%(對(duì)照)、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%(w/v)的 NaOH 溶液，120℃反應(yīng)60min，pH 值為5.0，并用蒸餾水調(diào)成浴比1:15，然后進(jìn)行酶解。

1.2.3.2 氫氧化鈉預(yù)處理正交試驗(yàn)

在氫氧化鈉濃度試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化影響氫氧化鈉預(yù)處理效果的主要工藝，進(jìn)行三因素三水平9組試驗(yàn)，三因素為氫氧化鈉濃度(A)、反應(yīng)時(shí)間(B)、反應(yīng)溫度(C)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)表如表2。

表2 NaOH正交試驗(yàn)因素及水平Tab.2 Factors and levels of the NaOH orthogonal tests

1.2.4 幾種預(yù)處理方法的比較

選擇優(yōu)化后的幾組預(yù)處理?xiàng)l件，進(jìn)行比較分析，預(yù)處理方式如表3。

表3 不同方法預(yù)處理實(shí)驗(yàn)條件Tab.3 Factors and levels of different pretreatments

1.2.5 酶解

加入10%纖維素酶和5%木聚糖酶，于恒溫?fù)u床中45℃，180rpm酶解糖化24h，糖液用于分析。

1.3 分析方法

1.3.1 糖化液分析

預(yù)處理及酶水解所得的糖化液，還原糖含量用DNS法測(cè)定［13］。

1.3.2 計(jì)算

預(yù)處理糖化率(%)=預(yù)處理液還原糖總量(g)/原料重量(g)×100%

酶解糖化率(%)=酶解液還原糖總量(g)/原料重量(g)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆葦化學(xué)組分分析

由表4可以看出，蘆葦中纖維素和半纖維素含量占75.96%，纖維素和半纖維素在一定條件下能降解為可發(fā)酵糖，是一種優(yōu)良的乙醇生產(chǎn)原料。由于蘆葦?shù)陌肜w維素含量達(dá)35.36%，因此作為乙醇生產(chǎn)原料，五碳糖的利用也很有必要。

表4 蘆葦組分分析Tab.4 Component analysis of reed

2.2 稀硫酸預(yù)處理

2.2.1 稀硫酸濃度對(duì)蘆葦預(yù)處理及酶糖化的影響

圖1 硫酸濃度對(duì)蘆葦糖化的影響Fig.1 The effect of sulfuric acid concentration on reed saccharifaction

由圖1可以看出，添加硫酸進(jìn)行預(yù)處理后，蘆葦?shù)念A(yù)處理糖化率與酶糖化率均得到了大幅度的提高。硫酸濃度為0.5% －2.0%(v/v)之間時(shí)，預(yù)處理液和酶糖化液還原糖濃度隨著硫酸濃度的增加呈增加的趨勢(shì);酸濃度為2.0－4.0%(v/v)時(shí)，預(yù)處理液還原糖濃度略有增加，但酶糖化液還原糖濃度反而降低;當(dāng)酸濃度為4.0% －6.0%(v/v)時(shí)，預(yù)處理液和酶糖化液還原糖濃度均降低;原因可能為，稀硫酸對(duì)半纖維素有良好的水解作用，對(duì)纖維素也有一定的降解作用，但當(dāng)稀硫酸超過一定濃度后，會(huì)造成部分單糖的變性，產(chǎn)生某些抑制酶糖化的物質(zhì)［1，14］，因此，預(yù)處理硫酸濃度以0.5% －2.0%(v/v)范圍較為合適。

2.2.2 稀硫酸預(yù)處理蘆葦正交優(yōu)化試驗(yàn)

表5 稀硫酸預(yù)處理正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Tab.5 Design and results of orthogonal tests in dilute H2SO4solutions

表5極差分析結(jié)果顯示，3個(gè)因素對(duì)蘆葦預(yù)處理及酶解糖化率的影響程度依次為C＞A＞B，說明反應(yīng)溫度是最重要的影響因素。方差分析顯示，在α=0.1水平上，反應(yīng)溫度對(duì)蘆葦預(yù)處理及酶解糖化率有顯著影響，反應(yīng)時(shí)間與硫酸濃度影響不顯著。根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果以及考慮酸對(duì)容器的腐蝕性、降低化學(xué)試劑的用量，減少抑制物的產(chǎn)生，優(yōu)化的稀硫酸預(yù)處理組合為A2B2C3，即硫酸濃度 1.0%(v/v)，反應(yīng)溫度 120℃，反應(yīng)時(shí)間 1.0h。

2.3 氫氧化鈉預(yù)處理

2.3.1 NaOH濃度對(duì)蘆葦預(yù)處理及酶解糖化的影響

由圖2可以看出，NaOH預(yù)處理液中還原糖含量很低，還原糖濃度均在1mg/ml以下，預(yù)處理后的蘆葦加酶降解，酶解液還原糖濃度及酶解糖化率有大幅度的提高。NaOH濃度在0.5% －1.5%(w/v)時(shí)，隨著NaOH濃度的增加，酶解還原糖濃度及糖化率呈增加的趨勢(shì)，NaOH濃度為1.5%(w/v)時(shí)達(dá)到最大，隨后開始略有降低，因此，NaOH濃度以1% －2%(w/v)較為合適。

圖2 氫氧化鈉濃度對(duì)蘆葦糖化的影響Fig.2 The effect of sodium hydroxide concentration on reed saccharifaction

2.3.2 NaOH預(yù)處理蘆葦正交試驗(yàn)

表6極差分析結(jié)果顯示，與硫酸預(yù)處理相比，3個(gè)因素對(duì)蘆葦酶解糖化率的影響程度依次為C＞A＞B，反應(yīng)溫度是最重要的影響因素。優(yōu)化的組合為A2B2C3，即NaOH濃度1.5%(w/v)，反應(yīng)溫度120℃，反應(yīng)時(shí)間1.0h。

表6 NaOH預(yù)處理正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Tab.6 Design and results of orthogonal tests in NaOH solutions

2.6 幾種預(yù)處理方法的比較分析

由圖3可以看出，與對(duì)照相比，3種預(yù)處理方式均能在一定程度上提高蘆葦預(yù)處理糖化率及酶解糖化率，從酶解糖化率來看，NaOH法＞稀H2SO4法＞熱水法＞對(duì)照，NaOH預(yù)處理后酶解糖濃度增幅最大，增加了近10倍，說明經(jīng)氫氧化鈉預(yù)處理后的蘆葦更容易被酶降解，原因可能為NaOH預(yù)處理能較好的破壞木質(zhì)素內(nèi)部結(jié)構(gòu)，從而使得纖維絲從木質(zhì)素的包裹中釋放出來［15，16］，有利于酶解作用，也表明與稀H2SO4法相比，蘆葦預(yù)處理更適宜的方法為NaOH法。

圖3 不同預(yù)處理方法的比較分析Fig.3 Comparison among different pretreatments

3 小結(jié)

本研究采用的3種預(yù)處理方法均能在一定程度上提高蘆葦?shù)目山到庑?，其中稀硫酸預(yù)處理工藝為1%H2SO4(v/v)、120℃、處理1h;NaOH 法預(yù)處理工藝為1.5%NaOH(w/v)、120℃、處理1h。

從預(yù)處理糖化率來看，稀硫酸預(yù)處理效果較好;而從酶解糖化效果來看，NaOH法效果更好，酶解糖化率NaOH法＞稀H2SO4法＞熱水法＞對(duì)照，經(jīng)NaOH預(yù)處理后，酶解酶解還原糖濃度大幅增加，蘆葦酶降解糖化率可達(dá)65.2%，這也表明NaOH法預(yù)處理后的蘆葦，更有利于酶的降解。

總體來說，蘆葦預(yù)處理，NaOH法是一種較好的方式，是否有更有效的預(yù)處理方法如汽爆預(yù)處理等還有待進(jìn)一步研究，預(yù)處理及酶解糖化液的糖組分也還有待進(jìn)一步分析。

［1］Rosgaard L，Pedersen S，Meyer AS.Comparison of different pretreatment strategies for enzymatic hydrolysis of wheat and barley straw［J］.Appl Biochem Biotechnol，2007，143(3):284 －296.

［2］Saha BC，Cotta MA.Comparison of pretreatment strategies for enzymatic saccharification and fermentation of barley straw to ethanol［J］，New biotechnology，2010，27(1):10 －16.

［3］Chen M，Zhao J，Xia LM.Comparison of four different chemical pretreatments of corn stover for enhancing enzymatic digestibility［J］.Biomass and Bioenergy，2009，33(10):1381 －1385.

［4］Cara C，Ruiz E，Ballesteros I et al.Enhanced enzymatic hydrolysis of olive tree wood by steam explosion and alkaline peroxide delignification［J］.Process Biochemistry，2006，41(2):423 －429.

［5］彭源德，鄭 科，楊喜愛，等.苧麻纖維質(zhì)酶降解生產(chǎn)生物燃料乙醇的工藝［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2007，23(4):6－10.

［6］Taniguchi M，Suzuki H，Watanabe D.et a1.Evaluation of pretreatment with Pleurotus ostreatus for Enzymatic Hydrolysis of Rice Straw［J］Journal of Bioscience and Bioengineering，2005，100(6):637 －643.

［7］Itoh H，Whda M，Honda Y et a1.Bioorganosolve pretreatments for simultaneous saccharification and fermentation of beech wood by ethanolysis and white rot fungi［J］.Journal of Biotechnology，2003，103(3):273 －280.

［8］Yat SC，Berger A，Shonnard DR.Kinetic characterization for dilute sulfuric acid hydrolysis of timber varieties and switchgrass［J］.Bioresource Technology，2008，99(9):3855 －3863.

［9］Szijártó N，Kádár Z，Varga E，et al.Pretreatment of Reed by Wet Oxidation and Subsequent Utilization of the Pretreated Fibers for Ethanol Production［J］.Appl Biochem Biotechnol，2009，155(1－3):386－396.

［10］閆明，潘根興，李戀卿，等.中國蘆葦濕地生態(tài)系統(tǒng)固碳潛力探討［J］.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26(18):320－323.

［11］王振慶，王麗娜，吳大千，等.中國蘆葦研究現(xiàn)狀與趨勢(shì)［J］.山東林業(yè)科技，2006，167(6):85－88.

［12］平清偉，黃寶峰，楊立業(yè)，等.蘆葦乙醇法制漿木素脫除規(guī)律研究［J］.中國造紙學(xué)報(bào)，2009，24(4):19－21.

［13］Miller G.L.Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar［J］，Anal.Chem.，1959，31:426 –428.

［14］Cara C，Ruiz E，Oliva JM et al.Conversion of olive tree biomass into fermentable sugars by dilute acid pretreatment and enzymatic saccharification［J］.Bioresource Technology，2008，99(6):1869–1876.

［15］秦偉軍，陳葉福，趙換英，等.玉米芯堿液預(yù)處理?xiàng)l件優(yōu)化［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2010，26(4):248－253.

［16］Wang Z，Keshwani DR，Redding AP，et al.Sodium hydroxide pretreatment and enzymatic hydrolysis of coastal Bermuda grass［J］.Bioresource Technology，2010，101(10):3583 －3585.