李琴，鄧秀霞，王留留，趙秀梅，李琦

（河南省鄭州市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢驗測試中心，河南 鄭州 450006）

豆粕中大豆總異黃酮的提取工藝優(yōu)化

李琴，鄧秀霞，王留留，趙秀梅，李琦

（河南省鄭州市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢驗測試中心，河南 鄭州 450006）

主要研究豆粕中大豆總異黃酮的醇提工藝,并用HPLC法測定大豆總異黃酮含量。以大豆總異黃酮為提取目的,并通過對各單因素的考察和正交試驗對工藝進行優(yōu)化。結(jié)果表明,大豆異黃酮醇提工藝的最佳條件為:乙醇濃度70%，料液比1∶15（mg/mL），提取溫度80 ℃，提取4 h,分2次提取,第1次提取時間為3 h，第2次提取1 h，總提取量是16.11 mg/g。

大豆異黃酮；豆粕；提取工藝；優(yōu)化；HPLC

大豆異黃酮（soybean is of lavones，SIF）是多酚類混合物，屬于黃酮類化合物中的異黃酮成分，分為游離型的苷元（Aglycon）和結(jié)合型的糖苷（Glycosides）兩類，苷元占總異黃酮含量的2%～3%，糖苷占總量的97%～98%[1-2]。

隨著分析技術(shù)的發(fā)展，研究證明，大豆異黃酮經(jīng)過動物體代謝后，主要以染料木素、黃豆苷元、大豆黃素以及它們的葡萄糖結(jié)合物的形式存在的染料木苷、黃豆苷、大豆黃苷。因此大豆異黃酮的生物活性主要體現(xiàn)在這6種單體成分上。大部分大豆異黃酮類化合物是以糖苷的形式存在的[3]。

研究表明，大豆異黃酮具有預(yù)防癌癥、心血管疾病、骨質(zhì)疏松癥和降低婦女更年期綜合癥等生理功能[4-7]。在國外以大豆異黃酮為主要成分的保健食品已成為新型的暢銷產(chǎn)品，但在國內(nèi)，雖然大豆資源很豐富但只有很少幾家生產(chǎn)該產(chǎn)品，仍處于開發(fā)利用的研究階段，因此該產(chǎn)品具有廣闊的開發(fā)前景和新的應(yīng)用價值。通過對豆粕中這幾種有效成分提取集中研究，減少分離過程的損失，從而充分利用資源。

1 材料與方法

1.1 主要原料及試劑

豆粕：鄭州博凱生物有限公司提供；99.5%乙醇：宏大化工有限公司；色譜甲醇：天津四友精細化學(xué)品有限公司；大豆異黃酮對照品：華北制藥有限公司；其它為分析純。

1.2 主要儀器

HH－3恒溫水浴鍋：上海醫(yī)療器械廠；D－971攪拌器：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；LD4－2離心機：北京醫(yī)用離心機廠；FL2200高效液相色譜儀：福立分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

豆粕（經(jīng)粉碎，過40目篩）10g→石油醚（30℃～60℃）索氏抽提脫脂→干燥→乙醇回流提取→等電點沉淀冷凍除蛋白質(zhì)→粗提液減蒸→水解→萃取精制→HPLC檢測

1.3.2 大豆總異黃酮的提取

準確稱取豆粕10 g，加石油醚索氏回流提取脂肪后，干燥，加入不同體積的不同提取溶媒在不同的溫度下提取數(shù)次，合并濾液，冷凍等電點除蛋白，離心，取上清液過濾進行HPLC分析測定。

1.3.3 單因素試驗

以乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時間，分別取出少量浸提液，采用HPLC法在254 nm處進行大豆總異黃酮含量的測定考察對大豆異黃酮提取量的影響。

1.3.4 正交試驗

由于在工藝優(yōu)化過程中各因素的影響是相互聯(lián)系的，因此為了全面考察影響因素，設(shè)計了一個四因素四水平的正交試驗，考察乙醇濃度、物料比、溫度、提取時間對大豆異黃酮提取量的綜合影響，從中選擇最佳的工藝條件。

2 結(jié)果和討論

2.1 大豆總異黃酮的測定

2.1.1 色譜條件

選用色譜柱C18（4.6 mm×150 mm×5 μL)；柱溫：室溫；梯度洗脫（見表1），流速為1 mL/min，柱溫室溫，進樣量為2 μL，檢測波長254 nm。進樣考察色譜圖，以保留時間定性、峰面積定量、外標法計算。

表 1 HPLC梯度洗脫順序表Table 1 HPLC gradient elution

2.1.2 大豆總異黃酮標準曲線的建立

精確稱取對照品10 mg，用色譜甲醇定容至10 mL，經(jīng)過0.22μm型（聚丙烯）WHATMAN一次性針頭過濾器過濾。分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8 mL定容至10 mL配成不同濃度的標樣溶液,經(jīng)HPLC測定不同濃度對應(yīng)的峰面積。以濃度對相應(yīng)的峰面積線性回歸可得對照品的標準曲線。用Excel軟件處理得回歸方程為y=2624.7x+11.08。大豆總異黃酮峰面積與其相應(yīng)濃度分別呈良好的線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r＝0.9998。

2.1.3 樣品的HPLC方法的測定

精確稱取樣品10 mg，用色譜甲醇定容至10 mL，經(jīng)過0.22μm型（聚丙烯）WHATMAN一次性針頭過濾器過濾，按照2.1.1的色譜條件進行HPLC測定分析，結(jié)果如圖2所示，與圖1相比較可以看出，豆粕提取物中異黃酮的保留時間和標準混合液中的大豆異黃酮保留時間一致。

2.1.4 精密度實驗

準確吸取1.0 mg/mL大豆異黃酮對照品溶液進樣（5 μL）重復(fù)試驗5次，以總異黃酮的峰面積計算RSD，結(jié)果見表2。通過對標準對照品的5次平行測定，變異系數(shù)為1.21%，可見此方法的精密度良好。

2.1.5 回收率實驗

取樣品，分別加入一定量對照品混合溶液，重復(fù)進樣6次，液相色譜法測定，計算樣品的加樣回收率和相對標準偏差，結(jié)果見表3。

表 2 精密度實驗Table 2 Precission test

表 3 回收率實驗Table 3 Recovery test

通過對同一樣品的6次平行測定，回收率在98.5%到101.3%之間，變異系數(shù)為1.11%。

2.2 提取條件單因素的考察

2.2.1 不同的乙醇濃度對大豆異黃酮提取量的影響

為了得到最佳的大豆異黃酮提取量，對提取溶劑乙醇進行不同濃度的優(yōu)化試驗，選取乙醇水溶液濃度分別是：60%、65%、70%、75%、80%、95%進行大豆異黃酮的提取量試驗，結(jié)果如圖3所示。

70%的乙醇水溶液對大豆異黃酮的提取量較其它濃度的要多，且70%的乙醇使大豆蛋白質(zhì)和多糖變性，從而減少了大豆蛋白質(zhì)及多糖對大豆異黃酮提取的干擾，簡化了后續(xù)的處理工作，更適于工業(yè)化生產(chǎn)。

2.2.2 料液比對大豆異黃酮提取量的影響

豆粕與乙醇溶劑的比例不同，提取得到的大豆異黃酮總量也有很大的差異，為了使豆粕中大豆異黃酮能夠充分提取，進行了料液比的條件優(yōu)化試驗，見圖4。

從圖4中可以看出，隨著料液比的增加，大豆異黃酮的提取量也隨著增加，但到達一定的程度后，呈下降趨勢，因此選擇料液比為1∶15時，大豆異黃酮提取量最大，提取效果最好。

2.2.3 提取溫度對大豆異黃酮提取量的影響

提取溫度不同，大豆異黃酮的提取量也將隨之發(fā)生變化，為了得到最佳的大豆異黃酮提取量，對提取溫度進行了優(yōu)化試驗，結(jié)果如圖5所示。

從圖5中可以看出，當提取溫度80℃，大豆總黃酮的提取效果較好，這是因為溫度較低時，大豆總黃酮溶出較少，而溫度過高，可能大豆異黃酮分解而使含量降低。

2.2.4 提取時間對大豆異黃酮提取量的影響

提取時間對大豆異黃酮的提取量也有很大的影響，時間太短，不能充分提取，提取量自然降低，提取時間太長，不但大豆異黃酮的提取量沒有明顯的增加，反而增加了能耗和物耗，因此，對提取時間進行了優(yōu)化試驗，結(jié)果如圖6所示。

由圖6可以看出，隨著提取時間的增加，更多的大豆異黃酮從豆粉中轉(zhuǎn)移到提取溶媒中，當提取時間為4 h時，大豆異黃酮的提取量明顯高于其他的提取時間，從而完成了大豆異黃酮從固相到液相的傳質(zhì)過程。

2.3 正交試驗

以乙醇濃度、提取溫度、提取時間、料液比四因素三水平正交試驗結(jié)果，見表4。

表 4 正交試驗因素水平表Table 4 Factor of the orthogonal test

從表4中極差R的數(shù)值可知，影響大豆異黃酮提取的各種因素其影響的強弱為：料液比>提取溫度>乙醇的濃度>提取時間，即在各影響因素中，料液比對浸提率的影響較大。同時由正交試驗確定出最佳提取條件，即采用70%乙醇、料液比1∶15（mg/mL），在80℃溫度下回流攪拌浸提4 h，大豆異黃酮提取量達到最大值16.11 mg/g。

3 結(jié)論

1）以混合大豆異黃酮作為對照品測定豆粕中大豆總異黃酮的含量，線形良好，測量準確，同時又簡化了分離過程中的有效成分的損失，更利于工業(yè)化的生產(chǎn)。

2）通過各因素的考察，確定豆粕中總大豆異黃酮的提取工藝優(yōu)化條件，即經(jīng)過脫脂后的豆粕在乙醇濃度為70%，料液比1∶15，提取溫度80 ℃，提取4 h，分2次提取，第1次提取時間為3 h，第2次提取1 h時，提取效果最佳。但影響因素最大的是料液比、提取溫度和乙醇的濃度。

[1]王兆梅,李琳.大豆異黃酮結(jié)構(gòu)及其活性分析[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2001,14(3):70-73

[2]Mcleod G S,Sheperd M J.Determination of the ionization constants of isoflavones by capillary electrophoresis[J].Phyto Anal,2000,11(5):322-326

[3]G Wang,S Kuan,O J Francis,et al.A simplified HPLC method for the determination of phytoestrogens in soybean and its processed products[J].Journal of Food Sci,1990,38(7):185-190

[4]蔡秋聲.大豆異黃酮生理功能及其開發(fā)利用[J].糧食與油脂,1999,(2):31-35

[5]P D Delmas.Clinical use of biochemical markers of bone remodeling in osteoporosis[J].Bone,1992,13(4):17

[6]劉志勝,李里特,辰幾應(yīng)三.大豆異黃酮及其生理功能研究進展[J].食品工業(yè)科技,2000,21(1):78-80

[7]江英，鄧輝.大豆異黃酮提取條件的研究[J].食品研究與開發(fā),2004,25(3):67-68

Study on the Optimum Extraction of Soybean Isoflavones from Soybean Residue

LI Qin，DENG Xiu－xia，WANG Liu－liu，ZHAO Xiu－mei，LI Qi
（Inspection and Testing Centers，Zhengzhou City of Quality and Technical Supervision，Zhengzhou 450006，He'nan，China）

In order to obtain soybean isoflavones，the optimum extraction of soybean isoflavones from soybean residue was mainly studied.The best conditions were found by single factor test and orthogonal experiments.They included 70%ethanol of the extraction solvent，the soybean－to－solvent ratio of 1∶15（mg/mL），80 ℃ of the operation temperature，4 h（3 h＋1 h）of the extraction time，total extrated quality was 16.11 mg/g.

soybean is of lavones；soybean residue；optimum extraction；optimum；HPLC

李琴（1981—），女（漢），工程師，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)。

2011-04-19