朱會霞，孫金旭，張冰喆，李志濤，周成銘，陳堯，林高強

（1.衡水學院生命科學系，河北 衡水 053000；2.河北省產品質量監(jiān)督檢驗院，河北 石家莊 050091）

大孔樹脂純化山茱萸黃酮工藝研究

朱會霞1，孫金旭1，張冰喆2，李志濤1，周成銘1，陳堯1，林高強1

（1.衡水學院生命科學系，河北 衡水 053000；2.河北省產品質量監(jiān)督檢驗院，河北 石家莊 050091）

采用大孔樹脂對山茱萸黃酮進行分離純化，確定其分離純化條件，樹脂的篩選實驗結果和靜態(tài)吸附動態(tài)學研究表明，所選的4種大孔樹脂，AB-8樹脂屬于快速吸附樹脂，吸附率和解吸率都很高，是理想用于山茱萸黃酮分離純化的樹脂，AB-8樹脂動態(tài)吸附、解吸實驗表明，當上樣流速2.0mL/min，上樣濃度為1.0mg/mL，上樣量70mL，用1.5 mL/min的60%的乙醇做解吸劑進行解吸時，山茱萸黃酮純度可達到67.38%，具有一定的應用價值。

山茱萸；黃酮；純化；AB-8

山茱萸俗稱山萸、藥棗、肉棗等，富含山茱萸多糖、黃酮、熊果酸、沒食子酸、蘋果酸、酒石酸及維生素等活性成分，是一種名貴的藥用植物[1]，許多藥理研究證明，它具有補腎益精、澀精固脫、抗菌利尿、降糖降壓的功效[2]。隨著現(xiàn)代醫(yī)藥科技的飛速發(fā)展，延緩衰老、健康長壽已為廣大人民群眾日益期盼，名貴中藥材山茱萸因含有豐富的營養(yǎng)和珍貴的保健成分以及微量元素日益成為科學研究熱點。

大孔吸附樹脂是一類有機高聚物吸附劑。它具有比表面積較大、交換速度較快、機械強度高、對被提取物污染小、熱穩(wěn)定好等特點[3]。與其它分離技術相比，它具有提高有效成分的相對含量、產品不吸潮、生產周期短、樹脂再生方便、可重復使用等優(yōu)點，因而近幾年在天然產物的分離純化中被廣泛應用，尤其適用于黃酮類化學物的分離純化[4-5]。本實驗采用大孔樹脂對山茱萸總黃酮進行分離純化，確定其分離純化條件，為工業(yè)化生產提供實驗參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山茱萸：購自河北省衡水市中醫(yī)藥店；試劑：均為分析純；樹脂：AB-8，NAK-9，D101，D4020天津市南大和成樹脂廠；蘆丁對照品：國家標準物質網；層析柱26 mm×146 mm；722型光柵分光光度計：上海精密科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 供試液的制備

山茱萸→粉碎、過篩→乙醇提取→抽濾→減壓蒸發(fā)成膏狀→加水溶解→乙酸乙酯萃取→分液→旋蒸→乙醇溶解→備用

1.2.2 檢測方法標準曲線的回歸方程

準確稱取蘆丁對照品0.1 g定容至100 mL，吸取蘆丁對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，各加30%乙醇至6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min；加10%硝酸鋁溶液l mL搖勻，放置6 min；加氫氧化鈉試液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min。用空白溶劑同法作空白，分光光度法在526 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線?；貧w方程為A=4.9256C-0.0042，R2=0.9997。

1.2.3 樹脂的預處理

用2倍體積的95%乙醇浸泡樹脂24 h溶脹，然后用95%乙醇洗至洗出液加適量水無白色渾濁，再用去離子水洗盡醇，轉入酸堿處理，用體積分數(shù)5%HCl溶液浸泡24 h，然后用去離子水洗至pH為中性，接著用體積分數(shù)5%的NaOH溶液浸泡24 h，最后用去離子水洗至pH為中性，浸泡于去離子水中備用。

1.2.4 樹脂的選擇

根據吸附率、解吸率的測定，同時考察樹脂的靜態(tài)吸附動力學特性，從4種樹脂中選出較理想的樹脂。

1.2.4.1 吸附率、吸附量和解吸率的測定

稱取已處理好的4種濕樹脂各1 g，加入濃度為1.4 mg/mL的山茱萸黃酮上柱液50 mL，在搖床上以100 r/min的頻率振搖24 h后，測定吸附液中黃酮的濃度，計算吸附率和吸附量。

式中：C0為吸附前樣液中黃酮的濃度，（mg/mL）；C1為吸附后上清液中黃酮的濃度，（mg/mL）。

式中：V為溶液體積，mL；W為樹脂質量，g。去除吸附液后，將樹脂加入70%的乙醇溶液100 mL，搖床上以100 r/min的頻率振搖24 h后，測定解吸液中黃酮的濃度，計算樹脂解吸率。

式中：C0為吸附前樣液中黃酮的濃度，（mg/mL）；C1為吸附后上清液中黃酮的濃度，（mg/mL）；C2為解吸液中黃酮的濃度，（mg/mL）。

1.2.4.2 靜態(tài)吸附動力學特性實驗[6]

取大孔吸附樹脂1.0 g（用濾紙吸干）裝入三角瓶，精密加入山茱萸黃酮提取液50 mL。搖床轉速100 r/min，振蕩10 h，每小時取1 mL，測定黃酮含量，繪靜態(tài)吸附動力學曲線。

1.2.5 動態(tài)吸附工藝參數(shù)的確定

1.2.5.1 吸附流速的確定

將樹脂以徑高比1∶6裝柱，在上柱液濃度和上柱量一致的情況下，改變吸附流速（1.0、2.0、3.0 mL/min）進行動態(tài)吸附，每流出10 mL流出液收集并測定有效成分濃度。以流出液體積為橫坐標，流出液黃酮濃度為縱坐標，繪制曲線。流出液黃酮濃度占進口黃酮濃度的百分比為泄漏率，當泄漏率為10%即為泄漏點，此時為吸附終點。根據泄漏點的定義在泄漏率曲線中找出合適的吸附速率。

1.2.5.2 上柱液濃度的確定

將樹脂以徑高比1∶6裝柱，取100 mL不同濃度上柱液，分別在最佳流速下通過樹脂柱，進行動態(tài)吸附，計算吸附率和總吸附量。根據吸附率及總吸附量的變化，綜合分析，確定最佳的上柱液濃度。

式中：C0為吸附前樣液中黃酮的濃度，（mg/mL）；C1為吸附后上清液中黃酮的濃度，（mg/mL）；V為溶液體積，mL。

1.2.5.3 上柱量的確定

取不同體積的上柱液，通過樹脂柱進行動態(tài)吸附。每處理1 BV的流出液進行收集并測定黃酮的濃度。以流出液體積為橫坐標，流出液濃度為縱坐標作圖。根據泄漏點出現(xiàn)快慢來確定上柱量。

1.2.5.4 解吸劑濃度的確定

取適宜濃度、適宜量的上柱液，在適宜的吸附流速下動態(tài)吸附后，用不同濃度的乙醇作為解吸劑在相同解吸流速下進行解吸，每10 mL解吸液收集測定黃酮濃度，并計算解吸率。

式中：V1為解吸液濃組分體積，mL；C1為解吸液濃度，（mg/mL）；V0為上柱液體積，mL；C0為上柱液濃度，（mg/mL）。

1.2.5.5 解吸流速的確定

取適宜的上柱液，在適宜的吸附流速下動態(tài)吸附后，用不同濃度的乙醇作為解吸劑在不同解吸流速下進行解吸，并計算解吸率。

1.2.6 山茱萸黃酮純度測定[7]

取山茱萸黃酮提取液，測其吸光度值，帶入回歸方程計算相應的黃酮濃度，再乘以提取液體積得產品中總黃酮質量，記為A，然后將該提取液在電恒溫干燥箱中干燥，得到產品干燥后的質量，記為B，按下式計算黃酮純度：

2 結果與討論

2.1 樹脂的選擇

2.1.1 幾種樹脂吸附率、解吸率的測定

稱取已處理好的4種濕樹脂各1 g，加入濃度為1.4 mg/mL的黃酮上柱液50 mL，在搖床上以100 r/min的頻率振搖24 h后，測定吸附液中黃酮的濃度，計算吸附率和解吸率，結果如圖1、2、3所示。

由圖1、2可知，所選的幾種吸附樹脂對山茱萸黃酮的吸附及解吸率不同，吸附率實驗中，AB-8樹脂的吸附率達到79%，優(yōu)于其他3種樹脂，解吸率實驗中，AB-8樹脂的解吸率高于其他3種樹脂，達到88%，說明AB-8樹脂對山茱萸黃酮有較好的吸附和解吸性，AB-8樹脂屬于弱極性大孔吸附樹脂，此樹脂的吸附率較大，說明粗提液中的黃酮主要是弱極性成分。

2.1.2 AB-8樹脂吸附山茱萸黃酮靜態(tài)吸附動力學特性

取已處理好的AB-8樹脂1.0 g（用濾紙吸干）裝入三角瓶，精密加入山茱萸黃酮提取液50 mL。搖床轉速100 r/min，振蕩10 h，每小時取1 mL，測定黃酮含量，繪靜態(tài)吸附動力學曲線，結果如圖4所示。

由圖4可知，AB-8樹脂對山茱萸黃酮的靜態(tài)吸附，在0～5 h，吸附量呈對數(shù)增長趨勢，5 h后，吸附量變化不大，說明AB-8樹脂對山茱萸的靜態(tài)吸附較快，5 h時基本達到飽和。

2.2 AB-8樹脂動態(tài)吸附工藝參數(shù)的確定

2.2.1 吸附流速的確定

AB-8樹脂以徑高比1∶6裝柱，上柱黃酮濃度為1.4 mg/mL，上柱量為100 mL，改變吸附流速（1.0、2.0、3.0 mL/min）進行動態(tài)吸附，每流出10 mL流出液收集并測定有效成分濃度。以流出液體積為橫坐標，流出液黃酮濃度為縱坐標，繪制曲線，結果如圖5所示。

由圖5可知，流速為1.0、2.0、3.0 mL/min時，泄漏點分別在90、70、50 mL時出現(xiàn)。吸附流速增大時泄漏率呈增大趨勢，流速小時，黃酮與固定相之間作用的時間較長，吸附作用的幾率較大，吸附效果好，但流速過慢，周期長，效率低。綜合考慮，選擇2mL/min為適宜吸附流速。

2.2.2 上柱液濃度的確定

將AB-8樹脂以徑高比1∶6裝柱，取100 mL濃度分別為0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mg/mL的上柱液，分別在3.0 mL/min流速下通過AB-8樹脂柱，進行動態(tài)吸附，計算吸附率和總吸附量結果如圖6所示。

由圖6可知，相同上柱量，不同濃度的山茱萸黃酮提取液，AB-8樹脂的吸附率隨山茱萸黃酮提取液濃度的增加而降低，而吸附量隨黃酮提取液濃度的增加而增加。上柱液濃度越大，總吸附量增大同時樹脂就越容易飽和，從而降低了吸附率。實際中，既要考慮吸附量又要考慮吸附率，綜合考慮，選擇山茱萸提取液上柱液濃度1.0 mg/mL。

2.2.3 上柱量對AB-8樹脂吸附山茱萸黃酮的影響

取一定體積上柱液，通過AB-8樹脂柱進行動態(tài)吸附。上柱濃度1.0 mg/mL流速2.0 mL/min，每處理10 mL的流出液進行收集并測定黃酮的濃度。以流出液體積為橫坐標，流出液濃度為縱坐標作圖，結果如圖7所示。

當流出液中黃酮濃度達到上柱液濃度的10%時，稱為漏點，由圖7可知，隨流出體積的增加，流出液中黃酮的濃度呈增加的趨勢，當上柱量為70 mL時，流出液中黃酮濃度達到0.1 mg/mL，為漏點，研究中發(fā)現(xiàn)，如果上柱量過大，即一次處理的料液量過多，就會導致解吸峰變寬，解吸物的純度也會隨之降低，并且也會給樹脂的再生造成一定的困難。所以上樣體積控制在70 mL為宜。

2.2.4 流動相解吸劑濃度的確定

取適宜濃度、適宜量的上柱液，在適宜的吸附流速下動態(tài)吸附后，用10、20、30、40、50、60、70、80、90、100%（體積分數(shù)）乙醇解吸劑在相同解吸流速下進行解吸，每10 mL解吸液收集測定黃酮濃度，并計算解吸率，結果如圖8所示。

由圖8可知，隨乙醇濃度的增加，山茱萸黃酮的解吸率逐漸升高，當乙醇濃度為60%時，解吸率達到最大為78%，之后隨乙醇濃度的提高，山茱萸黃酮解吸率有所下降，所以60%（體積分數(shù)）為山茱萸黃酮適宜流動相濃度。

2.2.5 乙醇流速對山茱萸黃酮解吸率的影響

取適宜的上柱液，在適宜的吸附流速下動態(tài)吸附后，用60%（體積分數(shù)）濃度的乙醇作為解吸劑在0.5、1.0、1.5、2.0 mL/min下進行解吸，并計算解吸率，結果如圖9所示。

解吸是一個解吸劑與樹脂競爭作用的過程，解吸過慢，生產周期也會延長；而解吸過快，解吸劑在還沒有來得及將被吸附在樹脂顆粒上的物質帶走，就已經離開了樹脂顆粒。因此，解吸速度過慢或者過快都不利于解吸。圖9結果表明，60%乙醇以1.5 mL/min的流速進行解吸時，解吸率較高。

2.3 山茱萸黃酮純度檢測

按純度檢測方法，經計算，原山茱萸提取液中黃酮純度為8.66%，經AB-8樹脂純化后黃酮純度為67.38%，是原純度的7.78倍，說明大孔樹脂技術可以用于山茱萸黃酮的分離純化工藝中。

3 結論

在所選的4中樹脂中，AB-8樹脂屬于快速吸附樹脂，吸附率和解吸率都較高，用于山茱萸黃酮的純化較理想，分離純化山茱萸黃酮的最佳條件為：上樣流速2.0 mL/min，上樣濃度為1.0 mg/mL，上樣量70 mL，用1.5 mL/min的60%的乙醇做為解吸劑進行解吸，純度測定結果表明，經AB-8樹脂純化后，山茱萸黃酮的純度為67.38%，具有一定的應用價值。

[1]向繼明,丁楠,姜立春,等.山茱萸總黃酮提取工藝的研究[J].農產品加工,2007,11(3):75-77

[2]孫金旭,朱會霞,王敏,等.山茱萸保健啤酒的研制[J].釀酒科技,2007,11(4):56-59

[3]于智峰,王敏.大孔吸附樹脂在黃酮類化合物分離中的應用[J].中藥材,2006,29(12):1380-1382

[4]何偉,李偉.大孔樹脂在中藥成分分離中的應用[J].南京中醫(yī)藥大學學報,2005,21(2):134-136

[5]李伯庭,王湘,李小進.大孔吸附樹脂在天然產物分離中的應用[J].中草藥,1999,21(8):42-44

[6]楊芙蓮，夏銀，任蓓蕾.大孔樹脂對甜蕎麥殼類黃酮的純化研究[J].食品科技,2009,34(1):135-139

[7]周桃英,羅登宏,李國慶,等.AB-8大孔樹脂純化荷葉總黃酮的工藝研究[J].中國食品添加劑,2009,9(6):114-119

The Study on the Purification of Cornus Flavonoids Using Macroporous Resin

ZHU Hui－xia1，SUN Jin－xu1，ZHANG Bing－zhe2，LI Zhi-tao1，ZHOU Cheng－ming1，CHEN Yao1，LIN Gao－qiang1
（1.Department of Biology，Hengshui College，Hengshui 053000，Hebei，China；2.Hebei Province Institution of Supervision and Inspection Product Quality，Shijiazhuang 050091，Hebei，China）

Using macroporous resin dogwood flavonoids were isolated and purified to determine their separation and purification conditions.Experimental results and the selection of resin adsorption dynamics studies showed that in the selected 4 macroporous resin，AB－8 resin were rapidly adsorbed resin.The adsorption rate and desorption rate were high.They were ideal for the separation and purification of the resin dogwood flavonoids.AB－8 resin dynamic adsorption，desorption experiments showed that when the sample flow rate 2.0 mL/min，the sample concentration was 1.0 mg/mL，the sample volume 70 mL，with 60%ethanol 1.5 mL/min do desorption agents，the dogwood flavonoids up to 67.38 percent purity，had a certain value.

macrocarpium officinale；flavone；purification；AB－8

河北省科學與發(fā)展指導性課題，課題編號（07215655）；衡水學院立項課題

朱會霞（1977—），女（漢），講師，博士研究生，研究方向：微生物、發(fā)酵工程、食品等方面。

2011-04-17