王方園 吳瑋 王鴻南 韓浩倫 劉剛 李保衛(wèi)屈昌北 孟令照 薄少軍 丁瑞英 孫建芝

1 解放軍第306醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（北京 100101）；2 中國航天員科研訓練中心

風洞是研究氣體流動及其與模型的相互作用，以了解實際飛行器或其他物體的空氣動力學特性的一種空氣動力實驗方法，目前廣泛應用于我國航天事業(yè)的研究中。風洞試驗過程中存在各種有害因素，如噪聲、密閉環(huán)境、有害氣體等，其中噪聲是最常見的危害因素之一。風洞噪聲的特點是既有高頻噪聲又有低頻噪聲，既有脈沖噪聲又有持續(xù)噪聲，其作業(yè)場所的噪聲強度在一定試驗條件下均可超過國家標準允許的水平。目前關于噪聲性聾的研究已取得一定的進展，但尚沒有進一步關于風洞噪聲危害的研究。為此，本研究對模擬風洞噪聲環(huán)境下豚鼠聽功能及其內(nèi)耳毛細胞、螺旋神經(jīng)節(jié)細胞中凋亡標志物Caspase－3表達的變化進行了觀察，以了解模擬風洞噪聲對豚鼠聽功能及內(nèi)耳細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康白色紅目豚鼠30只（軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供），雌雄不限，體重300～350g，耳廓反應靈敏，鼓膜標志清晰，無強噪聲暴露及耳毒性藥物使用史。實驗動物隨機分為2組：對照組6只（12耳）常規(guī)飼養(yǎng)；實驗組24只（48耳），因在ABR閾值測試麻醉過程中意外死亡6只，故余下18只（36耳）分為實驗組一、實驗組二、實驗組三，每組6只（12耳），分別于噪聲暴露3天（Explore 3，E3）、7天（Explore 7，E7）及噪聲暴露后7天（Recovery 7，R7）處死取材。

1.2 噪聲暴露方法 實驗組18只豚鼠分別放置于方形網(wǎng)狀不銹鋼籠內(nèi)，緊密排列在中國航天員訓練中心聲學實驗室隔聲室中，給予模擬風洞噪聲。模擬噪聲系統(tǒng)由數(shù)字音頻信號處理器產(chǎn)生模擬風洞噪聲信號，經(jīng)功率放大器傳到揚聲器，揚聲器放置于豚鼠籠周圍。噪聲強度用BK2250手持式分析儀測量，為98.0±2dB（A），測試聲場豚鼠籠四角及中心各點聲強未見明顯差異，每日豚鼠處于模擬噪聲環(huán)境中8小時，每小時持續(xù)暴露30分鐘，間斷30分鐘。實驗組一6只（12耳）動物連續(xù)噪聲暴露3天；實驗組二6只（12耳）動物連續(xù)噪聲暴露7天；實驗組三6只（12耳）動物連續(xù)噪聲暴露7天，暴露后常規(guī)飼養(yǎng)環(huán)境下恢復7天。

1.3 聽性腦干反應（ABR）檢測 實驗前所有動物進行聽性腦干反應（ABR）測試，再分別于噪聲暴露1天（E1）、3天（E3）對實驗組18只（36耳）豚鼠進行聽性腦干反應測試，噪聲暴露3天檢測結束后即刻處死實驗組一6只動物，取12只聽泡進行形態(tài)學觀察。于噪聲暴露7天（E7）對實驗組二、實驗組三各6只動物（共24耳）進行聽性腦干反應檢測，檢測結束后即刻處死實驗組二6只動物，取12只聽泡進行形態(tài)學觀察。于噪聲暴露后3天（R3）、7天（R7）對實驗組三6只動物（12耳）進行聽性腦干反應檢測，暴露后7天（R7）檢測結束后即刻處死實驗組三6只動物，取12只聽泡進行形態(tài)學觀察。ABR檢測時，所有豚鼠以1.5% 戊巴比妥鈉（40mg／kg）腹腔注射麻醉后應用聽性腦干反應儀（MEDSEN丹麥）在聲電屏蔽的測聽室內(nèi)完成檢測，記錄電極置于外耳道口后上緣皮下，參考電極置于顱頂，接地電極置于鼻尖，刺激強度0～97dB nHL，步距5dB，交替極性濾波短聲，刺激速率21.1次／秒，疊加次數(shù)1 024次，濾波帶寬100～3 000Hz，以剛好能引出可重復波Ⅲ的最小刺激強度為反應閾。

1.4 細胞凋亡標志物Caspase－3免疫組織化學染色觀察

對照組在噪聲暴露前、實驗組豚鼠分別于噪聲暴露3天（E3）、7天（E7）及暴露后7天（R7）時經(jīng)1.5%戊巴比妥鈉（40mg／kg）腹腔麻醉，迅速打開胸腔，經(jīng)左心室主動脈插管，快速注入300ml生理鹽水沖洗后，4℃4%多聚甲醛500ml灌注固定，斷頭取出雙側顳骨，以4%多聚甲醛作耳蝸內(nèi)灌流固定24h。EDTA脫鈣1周，30%蔗糖脫水2天，OCT包埋30分鐘，沿蝸軸水平冰凍連續(xù)切片，片厚8μm。采用Caspase－3抗體（Sigma美國），參照免疫組織化學試劑盒說明書進行免疫組織化學染色，Caspase－3的表達情況由2名以上病理醫(yī)師根據(jù)Caspace－3顯色的深淺雙盲判別。

1.5 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件處理，實驗組各時間點ABR反應閾比較采用方差分析。

2 結果

2.1 各組豚鼠ABR反應閾（表1） 實驗前對照組（21.98±5.98dB SPL）和實驗組動物（22.50±5.98dB SPL）ABR反應閾無明顯差異。實驗組模擬風洞噪聲暴露后各時間點ABR反應閾：噪聲暴露1、3、7天的ABR反應閾較噪聲暴露前明顯增高（P＜0.01），且暴露時間越長增高越明顯。噪聲暴露后3天，ABR反應閾較噪聲暴露7天有降低（P＜0.05），表明豚鼠聽功能有一定恢復，噪聲暴露后7天ABR閾值與實驗前及暴露后3天相比差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01），說明豚鼠噪聲暴露后7天聽功能較噪聲暴露后3天進一步恢復，但與噪聲暴露前相比，聽功能未能完全恢復。

表1 各組豚鼠各時間點ABR閾值（dB SPL，±s）

表1 各組豚鼠各時間點ABR閾值（dB SPL，±s）

注：＊與實驗組實驗前比較，P＜0.01；△與噪聲暴露7天比較，P＜0.05；＃與噪聲暴露后3天比較，P＜0.01

組別 動物耳數(shù)（耳） ABR 閾值對照組12 21.98±5.98實驗組實驗前 36 22.50±5.98噪聲暴露1天 36 35.73±8.11＊噪聲暴露3天 36 43.91±6.32＊噪聲暴露7天 24 53.18±6.28＊噪聲暴露后3天 24 46.40±11.59△噪聲暴露后7天 12 35.38±11.63＃

2.2 Caspase－3免疫組化染色結果（圖1） 實驗組豚鼠內(nèi)耳螺旋神經(jīng)節(jié)細胞及毛細胞的凋亡標志物Caspase－3表達較對照組明顯增高，且于噪聲暴露7天最高，暴露后7天豚鼠內(nèi)耳Caspase－3的表達較前明顯減少。

圖1 實驗組不同時間點及對照組內(nèi)耳Corti器和螺旋神經(jīng)節(jié)Caspase－3免疫組織化學染色結果（×80）

3 討論

研究［1］表明噪聲最主要的危害是損害人類的聽覺系統(tǒng)，可造成永久性聽力損失，風洞噪聲作為一種特殊的噪聲類型，亦可能對其內(nèi)作業(yè)人員的聽覺系統(tǒng)造成嚴重影響。本試驗模擬某風洞試驗室作業(yè)人員聽力損傷最嚴重作業(yè)點的噪聲強度、性質(zhì)及持續(xù)時間、累計劑量等，觀察此噪聲對實驗動物聽功能的影響，結果顯示，實驗組豚鼠模擬風洞噪聲暴露1、3、7天的ABR反應閾較噪聲暴露前均明顯增高，并呈現(xiàn)隨著暴露時間的延長反應閾逐漸增高的趨勢。噪聲暴露后3、7天豚鼠ABR反應閾逐漸下降，但噪聲暴露后7天其反應閾與噪聲暴露前相比仍有10 dB的升高，說明模擬風洞噪聲損傷急性期可產(chǎn)生暫時性閾移，這部分聽力損失可在噪聲暴露停止后逐步恢復，而隨著噪聲暴露量逐漸累積，可在暫時性閾移的基礎上產(chǎn)生永久性閾移，后者則很難恢復。

噪聲性聽力損失與內(nèi)耳毛細胞及螺旋神經(jīng)節(jié)細胞的凋亡有密切關系。研究表明［2～4］，Caspase－3可能與細胞凋亡密切相關，其可通過細胞外途徑（或稱細胞表面死亡受體途徑）和細胞內(nèi)途徑（或稱線粒體引發(fā)途徑）導致細胞凋亡。在細胞外途徑中，死亡信號的傳導依賴于死亡配體與受體的結合，形成死亡誘導信號復合物，隨后Caspase－8被激活，它通過裂解促凋亡蛋白Bid（proapoptosis protein Bid）使線粒體釋放細胞色素C，或直接作用于Caspase－3及其他下游的Caspase。在細胞內(nèi)途徑中，細胞內(nèi)的死亡信號，如DNA損傷、毒素和ATP耗竭等均可誘發(fā)線粒體釋放細胞色素C。細胞色素C、凋亡蛋白酶活化因子（apoptotic protease activating factor 1，Apaf－1）、dATP和Caspase－9酶原結合形成調(diào)亡復合體，Caspase－9被釋放并激活，接著下游的Caspase－3、7等被激活降解底物使細胞凋亡［5～7］。本研究采用免疫組織化學染色方法觀察模擬風洞噪聲暴露對實驗動物內(nèi)耳Caspase－3表達的影響，結果顯示，噪聲暴露過程中，豚鼠內(nèi)耳螺旋神經(jīng)節(jié)細胞及毛細胞Caspase－3的表達明顯增高，且于噪聲暴露7天最高，噪聲暴露停止后豚鼠內(nèi)耳Caspase－3的表達逐漸降低，說明模擬風洞噪聲環(huán)境可導致內(nèi)耳毛細胞及螺旋神經(jīng)節(jié)細胞的凋亡。在模擬風洞噪聲急性損傷中，其凋亡程度與噪聲暴露的累積量相關，噪聲暴露后，細胞凋亡減少但短期內(nèi)并不能完全恢復正常。

目前，關于噪聲性聽力損傷的研究一直是大家關注和研究的重點之一，近兩年，關于風洞噪聲環(huán)境的危害也有了一定進展。本研究發(fā)現(xiàn)，模擬風洞噪聲環(huán)境對實驗動物聽功能可造成損傷，但其損傷的具體進程和機制如何，以及此類噪聲環(huán)境的安全噪聲暴露量，仍需要在以后的實驗中繼續(xù)探索。

1 曲雁，李云，丁大連，等.噪聲性耳聾的研究進展［J］.河北醫(yī)科大學學報，2008，30：860.

2 鄔莎，王愛梅.Caspase家族與內(nèi)耳細胞凋亡［J］.國際耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2007，6：317.

3 許麗娟，龔樹生，汪吉寶，等.內(nèi)耳免疫反應中細胞凋亡及Caspase－3動態(tài)表達的研究［J］.臨床耳鼻咽喉科雜志，2005，19：890.

4 馮浩，尹時華.內(nèi)耳細胞凋亡途徑［J］.國際耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2009，6：318.

5 Poter AG，Janicke RU.Emerging roles of caspase－3in apoptosis［J］.Cell Death and Differentiation，1999，6：99.

6 Chien SY，Wu YC，Chung JG，et al.Berberine induced apoptosis via promoting the expression of Caspase－8，－9and－3，apoptosis－inducing factor and endonuclease Gin SCC－4 human tongue squamous carcinoma cancer Cells［J］.Anticancer Research，2009，29：4 063.

7 Sun X，Wu Y，Chen B，et al.Regulator of alcineurin 1（RCAN1）facilitates neuronal apoptosis through Caspase－3 activation［J］.The Journal of Biological Chemistry，2011，286：9 049.