王方園 吳瑋 王鴻南 韓浩倫 劉剛 李保衛(wèi)屈昌北 孟令照 薄少軍 丁瑞英 孫建芝

1 解放軍第306醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（北京 100101）；2 中國(guó)航天員科研訓(xùn)練中心

風(fēng)洞是研究氣體流動(dòng)及其與模型的相互作用，以了解實(shí)際飛行器或其他物體的空氣動(dòng)力學(xué)特性的一種空氣動(dòng)力實(shí)驗(yàn)方法，目前廣泛應(yīng)用于我國(guó)航天事業(yè)的研究中。風(fēng)洞試驗(yàn)過(guò)程中存在各種有害因素，如噪聲、密閉環(huán)境、有害氣體等，其中噪聲是最常見(jiàn)的危害因素之一。風(fēng)洞噪聲的特點(diǎn)是既有高頻噪聲又有低頻噪聲，既有脈沖噪聲又有持續(xù)噪聲，其作業(yè)場(chǎng)所的噪聲強(qiáng)度在一定試驗(yàn)條件下均可超過(guò)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)允許的水平。目前關(guān)于噪聲性聾的研究已取得一定的進(jìn)展，但尚沒(méi)有進(jìn)一步關(guān)于風(fēng)洞噪聲危害的研究。為此，本研究對(duì)模擬風(fēng)洞噪聲環(huán)境下豚鼠聽(tīng)功能及其內(nèi)耳毛細(xì)胞、螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中凋亡標(biāo)志物Caspase－3表達(dá)的變化進(jìn)行了觀察，以了解模擬風(fēng)洞噪聲對(duì)豚鼠聽(tīng)功能及內(nèi)耳細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康白色紅目豚鼠30只（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），雌雄不限，體重300～350g，耳廓反應(yīng)靈敏，鼓膜標(biāo)志清晰，無(wú)強(qiáng)噪聲暴露及耳毒性藥物使用史。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為2組：對(duì)照組6只（12耳）常規(guī)飼養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)組24只（48耳），因在ABR閾值測(cè)試麻醉過(guò)程中意外死亡6只，故余下18只（36耳）分為實(shí)驗(yàn)組一、實(shí)驗(yàn)組二、實(shí)驗(yàn)組三，每組6只（12耳），分別于噪聲暴露3天（Explore 3，E3）、7天（Explore 7，E7）及噪聲暴露后7天（Recovery 7，R7）處死取材。

1.2 噪聲暴露方法 實(shí)驗(yàn)組18只豚鼠分別放置于方形網(wǎng)狀不銹鋼籠內(nèi)，緊密排列在中國(guó)航天員訓(xùn)練中心聲學(xué)實(shí)驗(yàn)室隔聲室中，給予模擬風(fēng)洞噪聲。模擬噪聲系統(tǒng)由數(shù)字音頻信號(hào)處理器產(chǎn)生模擬風(fēng)洞噪聲信號(hào)，經(jīng)功率放大器傳到揚(yáng)聲器，揚(yáng)聲器放置于豚鼠籠周圍。噪聲強(qiáng)度用BK2250手持式分析儀測(cè)量，為98.0±2dB（A），測(cè)試聲場(chǎng)豚鼠籠四角及中心各點(diǎn)聲強(qiáng)未見(jiàn)明顯差異，每日豚鼠處于模擬噪聲環(huán)境中8小時(shí)，每小時(shí)持續(xù)暴露30分鐘，間斷30分鐘。實(shí)驗(yàn)組一6只（12耳）動(dòng)物連續(xù)噪聲暴露3天；實(shí)驗(yàn)組二6只（12耳）動(dòng)物連續(xù)噪聲暴露7天；實(shí)驗(yàn)組三6只（12耳）動(dòng)物連續(xù)噪聲暴露7天，暴露后常規(guī)飼養(yǎng)環(huán)境下恢復(fù)7天。

1.3 聽(tīng)性腦干反應(yīng)（ABR）檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)前所有動(dòng)物進(jìn)行聽(tīng)性腦干反應(yīng)（ABR）測(cè)試，再分別于噪聲暴露1天（E1）、3天（E3）對(duì)實(shí)驗(yàn)組18只（36耳）豚鼠進(jìn)行聽(tīng)性腦干反應(yīng)測(cè)試，噪聲暴露3天檢測(cè)結(jié)束后即刻處死實(shí)驗(yàn)組一6只動(dòng)物，取12只聽(tīng)泡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。于噪聲暴露7天（E7）對(duì)實(shí)驗(yàn)組二、實(shí)驗(yàn)組三各6只動(dòng)物（共24耳）進(jìn)行聽(tīng)性腦干反應(yīng)檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)束后即刻處死實(shí)驗(yàn)組二6只動(dòng)物，取12只聽(tīng)泡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。于噪聲暴露后3天（R3）、7天（R7）對(duì)實(shí)驗(yàn)組三6只動(dòng)物（12耳）進(jìn)行聽(tīng)性腦干反應(yīng)檢測(cè)，暴露后7天（R7）檢測(cè)結(jié)束后即刻處死實(shí)驗(yàn)組三6只動(dòng)物，取12只聽(tīng)泡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。ABR檢測(cè)時(shí)，所有豚鼠以1.5% 戊巴比妥鈉（40mg／kg）腹腔注射麻醉后應(yīng)用聽(tīng)性腦干反應(yīng)儀（MEDSEN丹麥）在聲電屏蔽的測(cè)聽(tīng)室內(nèi)完成檢測(cè)，記錄電極置于外耳道口后上緣皮下，參考電極置于顱頂，接地電極置于鼻尖，刺激強(qiáng)度0～97dB nHL，步距5dB，交替極性濾波短聲，刺激速率21.1次／秒，疊加次數(shù)1 024次，濾波帶寬100～3 000Hz，以剛好能引出可重復(fù)波Ⅲ的最小刺激強(qiáng)度為反應(yīng)閾。

1.4 細(xì)胞凋亡標(biāo)志物Caspase－3免疫組織化學(xué)染色觀察

對(duì)照組在噪聲暴露前、實(shí)驗(yàn)組豚鼠分別于噪聲暴露3天（E3）、7天（E7）及暴露后7天（R7）時(shí)經(jīng)1.5%戊巴比妥鈉（40mg／kg）腹腔麻醉，迅速打開(kāi)胸腔，經(jīng)左心室主動(dòng)脈插管，快速注入300ml生理鹽水沖洗后，4℃4%多聚甲醛500ml灌注固定，斷頭取出雙側(cè)顳骨，以4%多聚甲醛作耳蝸內(nèi)灌流固定24h。EDTA脫鈣1周，30%蔗糖脫水2天，OCT包埋30分鐘，沿蝸軸水平冰凍連續(xù)切片，片厚8μm。采用Caspase－3抗體（Sigma美國(guó)），參照免疫組織化學(xué)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，Caspase－3的表達(dá)情況由2名以上病理醫(yī)師根據(jù)Caspace－3顯色的深淺雙盲判別。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)ABR反應(yīng)閾比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 各組豚鼠ABR反應(yīng)閾（表1） 實(shí)驗(yàn)前對(duì)照組（21.98±5.98dB SPL）和實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物（22.50±5.98dB SPL）ABR反應(yīng)閾無(wú)明顯差異。實(shí)驗(yàn)組模擬風(fēng)洞噪聲暴露后各時(shí)間點(diǎn)ABR反應(yīng)閾：噪聲暴露1、3、7天的ABR反應(yīng)閾較噪聲暴露前明顯增高（P＜0.01），且暴露時(shí)間越長(zhǎng)增高越明顯。噪聲暴露后3天，ABR反應(yīng)閾較噪聲暴露7天有降低（P＜0.05），表明豚鼠聽(tīng)功能有一定恢復(fù)，噪聲暴露后7天ABR閾值與實(shí)驗(yàn)前及暴露后3天相比差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說(shuō)明豚鼠噪聲暴露后7天聽(tīng)功能較噪聲暴露后3天進(jìn)一步恢復(fù)，但與噪聲暴露前相比，聽(tīng)功能未能完全恢復(fù)。

表1 各組豚鼠各時(shí)間點(diǎn)ABR閾值（dB SPL，±s）

表1 各組豚鼠各時(shí)間點(diǎn)ABR閾值（dB SPL，±s）

注：＊與實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)前比較，P＜0.01；△與噪聲暴露7天比較，P＜0.05；＃與噪聲暴露后3天比較，P＜0.01

組別 動(dòng)物耳數(shù)（耳） ABR 閾值對(duì)照組12 21.98±5.98實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)前 36 22.50±5.98噪聲暴露1天 36 35.73±8.11＊噪聲暴露3天 36 43.91±6.32＊噪聲暴露7天 24 53.18±6.28＊噪聲暴露后3天 24 46.40±11.59△噪聲暴露后7天 12 35.38±11.63＃

2.2 Caspase－3免疫組化染色結(jié)果（圖1） 實(shí)驗(yàn)組豚鼠內(nèi)耳螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及毛細(xì)胞的凋亡標(biāo)志物Caspase－3表達(dá)較對(duì)照組明顯增高，且于噪聲暴露7天最高，暴露后7天豚鼠內(nèi)耳Caspase－3的表達(dá)較前明顯減少。

圖1 實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間點(diǎn)及對(duì)照組內(nèi)耳Corti器和螺旋神經(jīng)節(jié)Caspase－3免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（×80）

3 討論

研究［1］表明噪聲最主要的危害是損害人類的聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)，可造成永久性聽(tīng)力損失，風(fēng)洞噪聲作為一種特殊的噪聲類型，亦可能對(duì)其內(nèi)作業(yè)人員的聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)造成嚴(yán)重影響。本試驗(yàn)?zāi)M某風(fēng)洞試驗(yàn)室作業(yè)人員聽(tīng)力損傷最嚴(yán)重作業(yè)點(diǎn)的噪聲強(qiáng)度、性質(zhì)及持續(xù)時(shí)間、累計(jì)劑量等，觀察此噪聲對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物聽(tīng)功能的影響，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組豚鼠模擬風(fēng)洞噪聲暴露1、3、7天的ABR反應(yīng)閾較噪聲暴露前均明顯增高，并呈現(xiàn)隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)反應(yīng)閾逐漸增高的趨勢(shì)。噪聲暴露后3、7天豚鼠ABR反應(yīng)閾逐漸下降，但噪聲暴露后7天其反應(yīng)閾與噪聲暴露前相比仍有10 dB的升高，說(shuō)明模擬風(fēng)洞噪聲損傷急性期可產(chǎn)生暫時(shí)性閾移，這部分聽(tīng)力損失可在噪聲暴露停止后逐步恢復(fù)，而隨著噪聲暴露量逐漸累積，可在暫時(shí)性閾移的基礎(chǔ)上產(chǎn)生永久性閾移，后者則很難恢復(fù)。

噪聲性聽(tīng)力損失與內(nèi)耳毛細(xì)胞及螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡有密切關(guān)系。研究表明［2～4］，Caspase－3可能與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，其可通過(guò)細(xì)胞外途徑（或稱細(xì)胞表面死亡受體途徑）和細(xì)胞內(nèi)途徑（或稱線粒體引發(fā)途徑）導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞外途徑中，死亡信號(hào)的傳導(dǎo)依賴于死亡配體與受體的結(jié)合，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物，隨后Caspase－8被激活，它通過(guò)裂解促凋亡蛋白Bid（proapoptosis protein Bid）使線粒體釋放細(xì)胞色素C，或直接作用于Caspase－3及其他下游的Caspase。在細(xì)胞內(nèi)途徑中，細(xì)胞內(nèi)的死亡信號(hào)，如DNA損傷、毒素和ATP耗竭等均可誘發(fā)線粒體釋放細(xì)胞色素C。細(xì)胞色素C、凋亡蛋白酶活化因子（apoptotic protease activating factor 1，Apaf－1）、dATP和Caspase－9酶原結(jié)合形成調(diào)亡復(fù)合體，Caspase－9被釋放并激活，接著下游的Caspase－3、7等被激活降解底物使細(xì)胞凋亡［5～7］。本研究采用免疫組織化學(xué)染色方法觀察模擬風(fēng)洞噪聲暴露對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物內(nèi)耳Caspase－3表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，噪聲暴露過(guò)程中，豚鼠內(nèi)耳螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及毛細(xì)胞Caspase－3的表達(dá)明顯增高，且于噪聲暴露7天最高，噪聲暴露停止后豚鼠內(nèi)耳Caspase－3的表達(dá)逐漸降低，說(shuō)明模擬風(fēng)洞噪聲環(huán)境可導(dǎo)致內(nèi)耳毛細(xì)胞及螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡。在模擬風(fēng)洞噪聲急性損傷中，其凋亡程度與噪聲暴露的累積量相關(guān)，噪聲暴露后，細(xì)胞凋亡減少但短期內(nèi)并不能完全恢復(fù)正常。

目前，關(guān)于噪聲性聽(tīng)力損傷的研究一直是大家關(guān)注和研究的重點(diǎn)之一，近兩年，關(guān)于風(fēng)洞噪聲環(huán)境的危害也有了一定進(jìn)展。本研究發(fā)現(xiàn)，模擬風(fēng)洞噪聲環(huán)境對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物聽(tīng)功能可造成損傷，但其損傷的具體進(jìn)程和機(jī)制如何，以及此類噪聲環(huán)境的安全噪聲暴露量，仍需要在以后的實(shí)驗(yàn)中繼續(xù)探索。

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