胡守森 黃治物，2 吳皓，2 梅玲，2 陳建勇，2

1 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院耳科學(xué)研究所聽覺科學(xué)實驗室（上海200092）；2 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院耳鼻咽喉－頭頸外科

水楊酸鹽是一種在臨床上廣泛應(yīng)用的解熱鎮(zhèn)痛抗炎類藥物，長期使用會導(dǎo)致可逆性聽力下降和耳鳴。動物實驗中常利用水楊酸鹽的耳毒性以及噪聲暴露來進行耳鳴動物造模。動物行為學(xué)實驗已經(jīng)證實注射水楊酸鹽后，動物可以產(chǎn)生耳鳴，在前期研究中給動物注射水楊酸鹽后發(fā)現(xiàn)，急性注射可以使豚鼠的耳蝸神經(jīng)活動平均功率譜（average spectrum of electrophysiological cochleoneural activity，ASECA）1kHz譜峰值和畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射（DPOAE）幅值下降，而慢性注射則使兩者的幅值上升［1，2］。研究發(fā)現(xiàn)急性注射水楊酸鹽對耳蝸外毛細胞（OHC）外側(cè)膜上的prestin蛋白表達無影響，而長期注射水楊酸鹽后OHC膜上的prestin mRNA及蛋白表達呈可逆性上調(diào)，推測這可能是引起DPOAE幅值增加的主要原因［3］。以上研究表明，水楊酸鹽致耳鳴極可能源自于耳蝸水平的結(jié)構(gòu)功能改變向更高水平及中樞傳遞。由于聽覺中樞存在一定的可塑性，那么源于外周的耳鳴長期持續(xù)對聽覺中樞的不良刺激，聽覺中樞是否會因此產(chǎn)生結(jié)構(gòu)和功能方面的重組以及耳鳴產(chǎn)生的中樞具體機制尚不清楚。神經(jīng)元的持續(xù)反應(yīng)會導(dǎo)致某些基因表達的改變和新蛋白的合成，在噪聲暴露的耳鳴動物模型中，觀察到聽皮層神經(jīng)元的調(diào)諧頻率降低，皮層同步化增加［4］；有研究表明，早期生長反應(yīng)基因－1（early growth response gene－1，Egr－1）在細胞外刺激和胞內(nèi)基因表達改變中起重要的耦合作用，并調(diào)控下游長期反應(yīng)基因（long term response genes）的表達，在神經(jīng)元長時程可塑性中起著重要作用。Egr－1轉(zhuǎn)錄因子的激活依賴于細胞內(nèi)鈣離子濃度升高，通過胞內(nèi)信號級聯(lián)通路的放大，導(dǎo)致了一系列胞內(nèi)目標(biāo)蛋白的改變，將短時程信號改變轉(zhuǎn)變成為Egr－1轉(zhuǎn)錄因子所作用的一系列長時程轉(zhuǎn)變［5］。為此，本研究擬通過長期肌肉注射水楊酸鹽建立大鼠耳鳴動物模型，觀察建模過程中大鼠聽皮層Egr－1的表達變化，以了解Egr－1是否參與了耳鳴的產(chǎn)生以及在耳鳴持續(xù)發(fā)展的過程中是否存在中樞可塑性，探討耳鳴產(chǎn)生的中樞可塑性機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 水楊酸鹽購自美國Sigma公司，以生理鹽水溶解，其終濃度為100g／L；Trizol、PrimeScript?RT Master Mix（Perfect Real Time）試劑盒和 SYBR?Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）試劑盒均購自日本Takara公司；Egr－1單克隆抗體購自美國CST公司；山羊抗兔IgG二抗購自北京鼎國生物技術(shù)公司；ECL（enhanced chemiluminescence）化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國 Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組及處理 8周齡SPF（specific pathogen free）級健康雄性SD大鼠（上海交通大學(xué)附屬新華醫(yī)院動物實驗中心提供）84只，體重180～200g，耳廓反射陽性，無強噪聲暴露及耳毒性藥物使用史。隨機分為7組，每組12只，分別為：正常對照組（A組）；急性注射2小時組（B組，400mg／kg水楊酸鹽肌肉注射，2.5小時后斷頭）；慢性注射3天組（C組，200mg／kg水楊酸鹽肌肉注射，2次／天，間隔8小時，連續(xù)注射3天后在第4天斷頭）；慢性注射7天組（D組，200mg／kg水楊酸鹽肌肉注射，2次／天，間隔8小時，連續(xù)注射7天后在第8天斷頭）；慢性注射14天組（E組，200mg／kg水楊酸鹽肌肉注射，2次／天，間隔8小時，連續(xù)注射14天后在第15天斷頭）；停藥后恢復(fù)14天組（F組，慢性水楊酸鹽注射14天后再停止注射恢復(fù)14天斷頭）；停藥后恢復(fù)28天組（G組，慢性水楊酸鹽注射14天后再停止注射恢復(fù)28天斷頭）。各組大鼠斷頭處死后迅速取聽皮層，其中6只用于檢測Egr－1基因的變化，另外6只用于檢測Egr－1蛋白的改變。

1.2.2 SYBR Green實時熒光定量PCR檢測各組大鼠聽皮層Egr－1mRNA的表達 所有引物根據(jù)Genbank的登錄號，查找mRNA序列，由日本TaKaRa公司設(shè)計，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列如下：GAPDH，GAPDH－F：GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG GAPDH－R：ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA Egr－1，Egr－1－F：GAACAACCCTACGAGCACCTG Egr－1－R：GCCACAAAGTGTTGCCACTG各組大鼠取聽皮層后，立即放入液氮中，隨后轉(zhuǎn)入－80℃冰箱保存。樣本收集完后用Trizol法分別抽提總RNA。紫外分光光度計檢測其在260nm、280nm的吸光度值，計算 OD 260／OD280的比值鑒定RNA的純度。

采用TaKaRa公司的PrimeScript?RT Master Mix（Perfect Real Time）試劑盒進行cDNA的合成，按照說明書配制反應(yīng)液，反轉(zhuǎn)錄程序：37℃15 min；85℃5sec。將cDNA溶液置于－20℃保存?zhèn)溆?。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物40倍稀釋，real－time PCR反應(yīng)程序按照TaKaRa公司的SYBR?Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）試劑盒說明書進行設(shè)置：Stage 1：預(yù)變性95℃30秒，1Cycle；Stage 2：PCR擴增反應(yīng)95℃5秒，60℃34秒 ，40Cycles；Stage 3：95℃15秒，65℃60秒 ，95℃15秒，1Cycle。

1.2.3 Western blot分析Egr－1蛋白的表達 大鼠聽皮層超聲粉碎（3秒2次，間隔2秒）后直接加入PMSF和蛋白裂解液。加入700μl組織裂解液，離心并取上清液。各組取總蛋白80μg，經(jīng)10%SDS－PAGE凝膠電泳分離，后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，然后用封閉液封閉1小時，加入一抗4℃過夜。第二天，復(fù)溫半小時后用TBST洗3次，加入二抗孵育1.5小時，TBST洗三次，最后在暗室內(nèi)加入ECL化學(xué)發(fā)光底物曝光。選用β－Actin作為內(nèi)參照，并用圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 11.5軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，組間均數(shù)差異性比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其中實時熒光定量PCR數(shù)據(jù)收集主要由The Applied Biosystems 7500Real Time PCR System自帶軟件完成。各組基因表達變化采用比較閾值法即2－ΔΔCt法計算。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠聽皮層中Egr－1mRNA的表達各組大鼠聽皮層中Egr－1mRNA表達水平隨著水楊酸鹽注射次數(shù)的增加呈逐漸下降趨勢，慢性注射3、7、14天組（C、D、E組）與正常對照組、急性注射2小時組、停藥后恢復(fù)14天組、停藥后恢復(fù)28天組（A、B、F、G組）相比，Egr－1mRNA 表達水平均明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；正常對照組、急性注射2小時組、停藥后恢復(fù)14天組、停藥后恢復(fù)28天組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表1，圖1）。

表1 各組大鼠聽皮層Egr－1mRNA表達水平的比較（±s）

表1 各組大鼠聽皮層Egr－1mRNA表達水平的比較（±s）

注：Ct表示循環(huán)數(shù)；ΔCt＝Egr－1Ct的平均值－GAPDH Ct的平均值；ΔΔCt＝ 各組的ΔCt－正常對照組的ΔCt；＊與正常對照組比較，P＜0.05

組 別 Egr－1Ct GAPDH Ct ΔCt ΔΔCt 2－ΔΔCt正常對照組 26.53±0.15 25.44±0.61 1.10±0.53 0.00±0.53 1.85±0.33.05±0.34急性注射2小時組 27.11±0.15 25.52±0.42 1.60±0.53 0.50±0.53 0.74±0.24慢性注射3天組 26.61±0.98 24.70±1.43 1.91±0.55 0.81±0.55 0.61±0.25＊慢性注射7天組 26.47±0.70 24.61±0.83 1.85±0.41 0.76±0.41 0.61±0.22＊慢性注射14天組 28.35±0.82 26.07±0.44 2.28±0.77 1.19±0.77 0.49±0.23＊停藥后恢復(fù)14天組 26.81±0.61 25.18±0.59 1.63±0.78 0.54±0.78 0.78±0.46停藥后恢復(fù)28天組 26.94±0.65 25.51±1.07 1.42±0.53 0.33±0.53 0

圖1 實時熒光定量PCR檢驗各組中Egr－1mRNA表達的變化

2.2 各組大鼠聽皮層Egr－1蛋白的表達 Western blot印跡結(jié)果顯示，各組大鼠聽皮層均有Egr－1蛋白表達，慢性注射3天組、慢性注射7天組、慢性注射14天組（C、D、E組）Egr－1蛋白表達降低（P＜0.05），其余各組蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖2、3）。

3 討論

圖2 Western－blot檢測各組中Egr－1蛋白表達的變化

圖3 各組大鼠聽皮層Egr－1蛋白與β－Actin的光密度比值

耳蝸外毛細胞（OHC）是水楊酸鹽耳毒性作用的靶細胞，外毛細胞的電能動性在聽覺靈敏性和特異性方面起著至關(guān)重要的作用。研究觀察了反應(yīng)OHC電能動性的DPOAE幅值和表達在OHC側(cè)膜上的驅(qū)動蛋白prestin的表達量，證實了水楊酸鹽所致耳鳴極可能源自于耳蝸水平［1～3］。然而耳鳴的產(chǎn)生并不僅僅只是停留在耳蝸水平，而是涉及到聽覺通路的更高層面，尤其是耳鳴是否存在中樞化現(xiàn)象，耳鳴的中樞機制是否涉及到中樞化問題，以及是否會誘發(fā)多種神經(jīng)遞質(zhì)和即刻早期基因的改變［6］，目前尚無確切的實驗依據(jù)。

Egr－1在神經(jīng)元活動中維持著可塑性的改變。Egr－1是一種可被不同形式神經(jīng)活性迅速誘導(dǎo)的即刻早期基因，它介導(dǎo)了細胞的增殖與分化，參與細胞的凋亡過程和組織的損傷修復(fù)，尤其在維持神經(jīng)元可塑性改變方面也發(fā)揮著重要的作用［1］。已有研究證實突觸可塑性常表現(xiàn)為長時程增強（longterm potentiation，LTP），而Egr－1的表達能作為引發(fā)LTP的分子標(biāo)識（LTP常常伴隨著Egr－1表達的升高）［8］，用于反應(yīng)LTP后的神經(jīng)元出現(xiàn)結(jié)構(gòu)重組的情況，并且在大腦皮質(zhì)結(jié)構(gòu)的刺激依賴性生長中起著重要的作用［7］。Nunes等［9］的研究觀察到小鼠暴露在豐富行為學(xué)習(xí)環(huán)境中一個月，伴隨著LTP的增強，扣帶回皮質(zhì)前端的Egr－1表達升高；給成年大鼠做運動訓(xùn)練，大鼠脊髓神經(jīng)元中Egr－1的表達也升高。有研究發(fā)現(xiàn)，在海馬和杏仁體中Egr－1在長時程增強和學(xué)習(xí)過程中表達上調(diào)［10］，而在Egr－1敲除小鼠中觀察到晚時相聲音恐懼記憶受損，但短時的痕跡和場景記憶卻不受影響，表明在晚時相聽覺恐懼記憶中Egr－1極可能發(fā)揮關(guān)鍵性作用［10］。這些都說明Egr－1與神經(jīng)可塑性，特別是表現(xiàn)為長時程增強的突觸可塑性機制密切相關(guān)［11］。

Yu等［12］對豚鼠進行連續(xù)2周的水楊酸鹽注射后，發(fā)現(xiàn)動物的DPOAE幅值逐漸上升，prestin表達上調(diào)，且耳蝸中的Egr－1表達水平較對照組上升了4.71倍；免疫熒光顯示Egr－1表達在耳蝸外毛細胞核，表明Egr－1可能參與了prestin表達的上調(diào)。Ko等［10］發(fā)現(xiàn)用低強度的短陣脈沖刺激（theta burst stimulation，TBS）正常小鼠聽皮層后可引發(fā)持續(xù)40分鐘的突觸反應(yīng)的長時程增強，而在Egr－1基因敲除小鼠，用低強度的短陣脈沖刺激聽覺皮層所引起的LTP被明顯減弱或完全阻斷。這些結(jié)果有力的證明了Egr－1有利于聽皮層區(qū)域的LTP和聽皮層的可塑性形成，進一步表明Egr－1與聽覺中樞神經(jīng)元可塑性有著密切聯(lián)系。

從本研究結(jié)果看，急性注射水楊酸鹽大鼠聽皮層的Egr－1表達略有下降，但與正常對照組相比無明顯差異，而慢性注射水楊酸鹽后大鼠聽皮層Egr－1表達下降，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與在耳蝸外毛細胞外側(cè)膜上的prestin蛋白在急性和慢性注射水楊酸鹽時表達上升的結(jié)果（不同時相的變化規(guī)律）［9］相比較，相關(guān)性極好。大鼠的LTP按其時程分為3種：LTP1持續(xù)大概2個小時，LTP2持續(xù)大概4天，LTP3持續(xù)大概23天。第一種叫E－LTP，后兩種統(tǒng)稱L－LTP；研究表明Egr－1在L－LTP的穩(wěn)定中發(fā)揮著重要的作用［9］，且L－LTP（而非E－LTP）要求有基因轉(zhuǎn)錄和蛋白合成，因此，本研究中慢性注射水楊酸鹽后大鼠聽皮層Egr－1的表達下降，推測其導(dǎo)致了聽皮層突觸反應(yīng)長時程增強，表明聽皮層發(fā)生了神經(jīng)可塑性的改變。

長期注射水楊酸鹽后，DPOAE幅值增加，OHC膜上的prestin蛋白表達上調(diào)，造成了耳蝸外毛細胞電能動性的增強，引起ASECA的1kHz譜峰值升高，說明耳蝸神經(jīng)活動增強［1～3］，進一步上傳使聽皮層活動性升高，感知為耳鳴。這種長期活動過度的刺激，導(dǎo)致機體為了維持自身穩(wěn)態(tài)平衡使神經(jīng)元活動恢復(fù)到正常范圍，啟動了一系列補償措施，其中之一就是Egr－1的表達下降；而Egr－1表達降低將不利于LTP，使神經(jīng)元產(chǎn)生適應(yīng)不良的可塑性。

水楊酸鹽的耳毒性作用具有劑量依賴性，即用藥劑量越大、用藥時間越長，其所導(dǎo)致的耳蝸損傷越大，這與本研究觀察到的Egr－1在慢性注射水楊酸鹽3天、7天和14天組的耳鳴大鼠聽皮層表達呈下降趨勢相一致，也與早期研究中慢性注射水楊酸鹽后，豚鼠的DPOAE和ASECA逐漸升高在時相上極其相似［1，2］。水楊酸鹽對耳蝸的損傷也具有可逆性，停止注射水楊酸鹽后DPOAE、ASECA幅值和prestin蛋白表達可以恢復(fù)正常［3］。本研究結(jié)果顯示停藥后恢復(fù)14天組、停藥后恢復(fù)28天組大鼠聽皮層Egr－1的表達與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明聽皮層中Egr－1的表達改變是可逆性的（恢復(fù)正常）。此外，Egr－1也能通過輔助抑制因子（NGFI－A binding 2，NAB2）產(chǎn)生自身表達的負反饋調(diào)節(jié)來維持表達的平衡從而使表達恢復(fù)正常。

總之，水楊酸鹽所致耳鳴不僅僅發(fā)生在耳蝸水平，更涉及到高級聽覺中樞。長期注射水楊酸鹽后，大鼠聽皮層Egr－1表達的改變證實了Egr－1參與了聽皮層可塑性變化。然而聽覺系統(tǒng)的可塑性涉及到聽覺通路的多個層面，除聽皮層外，Egr－1在耳蝸核、下丘的表達如何還有待進一步的研究。

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