何本超 徐碧生 李健勇 顏風(fēng)波 鄭志剛 蔣玉歡 鮑柏林 鄢烈雄

1 湖北省天門(mén)市第一人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（天門(mén) 431700）

2006年第二次全國(guó)殘疾人抽樣調(diào)查顯示，我國(guó)現(xiàn)有聽(tīng)力障礙者2 780萬(wàn)人，占全國(guó)8 296萬(wàn)殘疾人的33.5%，居各類(lèi)殘疾之首［1］。在我國(guó)，每年新增聽(tīng)力及言語(yǔ)障礙者近8萬(wàn)人，新增聾兒近3萬(wàn)人，其中50%是由遺傳缺陷引起的，可見(jiàn)，遺傳因素是導(dǎo)致耳聾的重要因素［2］。減少耳聾的發(fā)生重在早期預(yù)防與干預(yù)，而明確其遺傳學(xué)病因是關(guān)鍵。在不同地區(qū)和不同人群中耳聾基因的突變頻率、突變方式和熱點(diǎn)突變有很大的差異，為了解天門(mén)市特殊教育學(xué)校耳聾人群的常見(jiàn)分子遺傳病因?qū)W特點(diǎn)，2012年3月對(duì)天門(mén)市特殊教育學(xué)校52名聾啞學(xué)生進(jìn)行GJB2、GJB3、SLC26A4、線粒體 DNA12SrRNA 4個(gè)基因的9個(gè)熱點(diǎn)突變進(jìn)行檢測(cè)，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 研究對(duì)象為湖北省天門(mén)市特殊教育學(xué)校的52名聾啞學(xué)生，原籍均為天門(mén)市，均為漢族。其中，男28例，女24例，男女比例為1.17：1；年齡5～16歲，平均11.08±3.08歲。

1.2 研究方法

1.2.1 病史資料采集及體檢 病史資料采集得到研究對(duì)象及其家長(zhǎng)的同意并簽署知情同意書(shū)。調(diào)查內(nèi)容包括：①一般情況：登記時(shí)間、接診醫(yī)生、姓名、性別、年齡、民族、籍貫、出生年月、居住地址、聯(lián)系電話(huà)、父母親及其聽(tīng)力情況。②耳聾的發(fā)病時(shí)間、發(fā)病原因、耳聾以前是否會(huì)說(shuō)話(huà)、耳聾病情進(jìn)展及伴隨癥狀。③母親妊娠期情況：傳染病史、耳毒性藥物應(yīng)用史、生產(chǎn)情況；④個(gè)人史：聾前患病史、全身系統(tǒng)疾病、頭部外傷史、環(huán)境噪聲史、家庭史和耳毒性藥物應(yīng)用史。對(duì)所有研究對(duì)象進(jìn)行耳部、視力及視野、虹膜、鞏膜、甲狀腺、毛發(fā)及其他體檢；進(jìn)行純音測(cè)聽(tīng)、聲導(dǎo)抗、ABR、40HzAERP、DPOAE、ECochG、ASSR等聽(tīng)力檢測(cè)。

1.2.2 DNA提取 取受試者外周血3～5ml保存在4℃條件下，避免震蕩，1天內(nèi)送到湖北省人民醫(yī)院，應(yīng)用耳聾基因芯片（北京博奧生物有限公司）進(jìn)行 GJB2（35delG、176del16、235delC 及 299delAT）、GJB3（538C＞T）、SLC26A4（2168A＞G、IVS7－2A＞G）以及線粒體DNA12SrRNA（1494C＞T、1555A＞G）常見(jiàn)致聾基因突變熱點(diǎn)篩查 ，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。每份標(biāo)本提取兩份DNA，分別儲(chǔ)存，除工作液外均保存在－80℃深低溫冰箱。

1.2.3 PCR反應(yīng) 將針對(duì)9個(gè)突變位點(diǎn)的9組引物分成A和B兩個(gè)反應(yīng)體系分別進(jìn)行多重PCR，在每個(gè)20μl反應(yīng)體系中加入待測(cè)全血基因組DNA（濃度100～200ng／μl）3μl、擴(kuò)增引物混合物12.5μl、擴(kuò)增試劑混合物4.5μl。PCR反應(yīng)程序：37℃10min，95℃15min，96℃1min預(yù)變性，94℃30 s、55℃30s、72℃45s共32個(gè)循環(huán)，70℃45s、60℃10min。在擴(kuò)增過(guò)程中，設(shè)置參數(shù)使溫度以0.4℃／s的速度從94℃降溫至55℃，以0.2℃／s的速度從55℃升溫至70℃。

1.2.4 雜交 PCR產(chǎn)物加熱至95℃變性10min后混合物中冰浴3min。從同一個(gè)樣品模板的兩個(gè)不同擴(kuò)增體系管（A、B）中各取2.5μl PCR產(chǎn)物加到10μl雜交緩沖液管中。將14μl雜交混合液加到芯片的微陣列區(qū)域，加雜交盒上蓋，封閉雜交盒后放入50℃雜交儀中1h。

1.2.5 顳骨CT檢查 對(duì)檢測(cè)出的SLC26A4基因突變攜帶者進(jìn)行16排螺旋CT顳骨掃描。正常者前庭導(dǎo)水管外口與總腳或峽部中點(diǎn)直徑平均1.9 mm，最小1.6mm，最大2.3mm；根據(jù)1978年Valvassor提出的診斷標(biāo)準(zhǔn)，前庭導(dǎo)水管外口與總腳或峽部中點(diǎn)直徑＞1.5mm為擴(kuò)大。

2 結(jié)果

2.1 52名聾啞學(xué)生均為非綜合征型聾，按照WHO（1997年）的聽(tīng)力損失程度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，均為重度和極重度感音神經(jīng)性聾。

2.2 52例耳聾者中，共發(fā)現(xiàn)攜帶與遺傳性聾相關(guān)基因突變者25例（48.08%，25／52），其中SLC26A4基因突變攜帶者9例（17.30%，9／52）、GJB2基因突變攜帶者12例（23.08%，12／52）、mtDNAl2SrRNA線粒體基因突變攜帶者4例（7.69%，4／52），未發(fā)現(xiàn)GJB3基因突變攜帶者（表1）；其中2例GJB2 35 delG合并IVS7－2A＞G基因的雜合突變，2例SLC26A4 2168A＞G合并IVS7－2A＞G基因的雜合突變。GJB2和SLC26A4基因突變攜帶者占基因突變總例數(shù)的84.0%（21／25）。對(duì)9例SLC26A4基因突變攜帶者行顳部CT掃描，9例均顯示前庭水管擴(kuò)大（17.31%，9／52），這9例耳聾基因芯片檢測(cè)結(jié)果分別是IVS7－2A＞G純合突變1例，IVS7—2A＞G雜合突變6例，SLC26A4 35delG合并IVS7－2A＞G基因的雜合突變2例。

3 討論

遺傳性聾的遺傳背景復(fù)雜，臨床表現(xiàn)多變，目前尚無(wú)有效藥物治療，大部分患者只能依靠配戴助聽(tīng)器或植入人工耳蝸等輔助手段進(jìn)行康復(fù)治療，因此，對(duì)此類(lèi)疾病的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，對(duì)于患者早日融入有聲社會(huì)具有重要意義。

表1 52例受檢者4種耳聾相關(guān)基因的突變檢測(cè)結(jié)果（例）

國(guó)人中最常見(jiàn)的GJB2、SLC26A4和線粒體DNA 12SrRNA3種耳聾相關(guān)基因均有突變熱點(diǎn)。GJB2基因定位于人染色體13q11－12，全長(zhǎng)4 804 bp，mRNA長(zhǎng)2 3ll bp，編碼區(qū)678bp，含2個(gè)外顯子，編碼B－2型縫隙連接蛋白（Cx26）是鉀離子循環(huán)通路的一部分，對(duì)于耳蝸正常滲透壓及聽(tīng)敏度的維持起著極其重要作用。GJB2基因的編碼區(qū)發(fā)生突變可以產(chǎn)生無(wú)功能的縫隙連接蛋白，降低縫隙連接的通透性，影響通道的正常開(kāi)閉，使鉀離子回流入內(nèi)淋巴液的循環(huán)障礙，導(dǎo)致Corti器的鉀中毒，從而導(dǎo)致感音神經(jīng)性聾（seosorineural hearing loss，SNHL）［3］。目前已報(bào)道的GJB2基因突變類(lèi)型有150多種，突變方式包括移碼突變、錯(cuò)義突變、無(wú)義突變及剪接位點(diǎn)突變等，其中多數(shù)患者表現(xiàn)為常染色體隱性遺傳，大部分表現(xiàn)為先天性聾或語(yǔ)前聾。本研究對(duì)象中GJB2基因突變攜帶者12例（23.08%，12／52），與解放軍總醫(yī)院全國(guó)聾病分子流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果（21.05%）［4］一致。

SLC26A4（solute cartier family 26，member 4 protein）即PDS基因，定位于7q31，全長(zhǎng)為57 175 bp，編碼區(qū)為2 34 3bp，由21個(gè)外顯子組成，其中20外顯子編碼氯－碘離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Pendrin，780個(gè)氨基酸，主要表達(dá)于甲狀腺、內(nèi)耳、腎臟。解放軍總醫(yī)院報(bào)告SLC26A4基因突變率21%［5］；席宏等［6］報(bào)告61例非綜合征性聾患者SLC26A4基因突變率為16%。本組研究對(duì)象中SLC26A4基因突變率17.30%（9／52），與上述報(bào)道相近。分析其原因可能為：不同年齡段SLC26A4基因突變檢出率是不同的，有文獻(xiàn)報(bào)告［7］，在發(fā)病和就診年齡為0～10歲的耳聾群體中，SLC26A4基因突變的檢出率均為最高（分別為34.32%和34.52%），而在較大年齡段，SLC26A4基因突變的檢出率要低一些。本組研究對(duì)象平均年齡11.08歲，且因樣本量有限，結(jié)果有一定的局限性。文獻(xiàn)報(bào)道大前庭水管綜合征（1arge vestibular aqueduct syndrome，LVAS）的發(fā)病與SLC26A4基因突變具有直接的因果關(guān)系，從文中結(jié)果可見(jiàn)，9例SLC26A4基因突變病例的顳骨CT掃描均顯示前庭水管擴(kuò)大，可見(jiàn)，對(duì)LVAS病例進(jìn)行SLC26A4基因檢測(cè)，有利于從分子水平明確病因，早期診斷，早期治療。

目前大量研究已證實(shí)mtDNA突變與氨基糖苷類(lèi)藥物導(dǎo)致的耳聾密切相關(guān)，部分患者對(duì)氨基糖苷類(lèi)藥物有易感性，微量的藥物就可以造成聽(tīng)力損失。一部分12SrRNA基因A1555G突變患者即使不接觸氨基苷類(lèi)藥物，同樣會(huì)發(fā)生感音神經(jīng)性聾［9］。本組患者中與藥物性聾相關(guān)的線粒體12SrRNA基因突變攜帶者4例（7.68%，4／52），其中2例母親妊娠期注射過(guò)丁胺卡那霉素，另2例用藥史不詳；4例中線粒體DNA 12SrRNA基因A1555G點(diǎn)突變率3.85%，高于文獻(xiàn)報(bào)道的3.43%［10］。

既往有研究報(bào)告GJB3基因突變攜帶率0.56%（1／177）［8］，本組研究對(duì)象中未發(fā)現(xiàn) GJB3基因突變者，其原因可能與樣本量偏少有關(guān)，并不能確認(rèn)天門(mén)市耳聾人群中沒(méi)有該基因突變者存在。因此，有待于擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。

從本研究結(jié)果看，SLC26A4基因突變患者多數(shù)有殘余聽(tīng)力，對(duì)這類(lèi)患者應(yīng)囑避免各種外傷、感冒或耳毒性藥物的使用，避免加重耳聾的誘因及注意預(yù)防甲狀腺腫的發(fā)生［11］，植入人工耳蝸效果良好；GJB2基因突變者，應(yīng)告之在婚前需行耳聾基因檢測(cè)，避免雙方為同型遺傳性聾者婚配，預(yù)防聾兒出生；與藥物性聾相關(guān)的rtDNA12SrRNA線粒體基因突變攜帶者，應(yīng)告知禁用耳毒性藥物，尤其是其母系成員更應(yīng)禁用耳毒性藥物，避免或減少親代及子代發(fā)生遺傳性聾，對(duì)于已由耳毒性藥物導(dǎo)致的聽(tīng)力損失患者，植入人工耳蝸有效。

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