陳嘉馨 陸家政 黎惠貞 吳榮華 杜一凡 麥燕瑜 臧林泉

器官和細(xì)胞功能是在無數(shù)信號分子，包括脂質(zhì)、肽、有機(jī)和無機(jī)分子、代謝中間物等作用下實(shí)現(xiàn)的，氣體信號分子作為其中的成員對器官和細(xì)胞功能的維持起重要作用。一氧化氮(nitric oxide，NO)既是一種信號分子，又是一種細(xì)胞毒性分子，調(diào)節(jié)體內(nèi)一系列生理病理過程，包括血管舒張、抑制血小板在內(nèi)皮細(xì)胞表面粘附與血小板凝集、神經(jīng)傳遞、宿主防御和細(xì)胞毒作用等，并在一定條件下參與組織炎癥及損傷，參與多種疾病的病理生理過程[1]。研究發(fā)現(xiàn)，在哮喘患者氣道上皮細(xì)胞中NO的表達(dá)增加，其作為一種效應(yīng)分子，能參與炎癥與組織損傷修復(fù)，過量的NO能擴(kuò)張血管，促進(jìn)炎癥細(xì)胞滲出及炎癥介質(zhì)釋放，被認(rèn)為是哮喘炎癥反應(yīng)的前介質(zhì)，NO在哮喘的發(fā)病機(jī)制中起著非常重要的作用[2]。本實(shí)驗(yàn)觀察不同時(shí)期哮喘患者和健康人之間血漿NO水平的差異及其相關(guān)性，從新的角度探討哮喘的病因及防治。

1 資料與方法

1.1 一般資料 70例哮喘患者，診斷標(biāo)準(zhǔn)、急性發(fā)作期分級及緩解期的判斷符合2006年哮喘全球倡議(global initiative for asthma，GNA)標(biāo)準(zhǔn)[3]：氣道可逆試驗(yàn)陽性系指吸入支氣管擴(kuò)張劑第1秒用力呼氣容積(force expiration volume in one second，F(xiàn)EV1.0)增加15%以上且其絕對值增加200 ml以上；緩解期系指經(jīng)過治療，患者癥狀、體征消失，肺功能恢復(fù)到急性發(fā)作前水平。其中哮喘急性發(fā)作期40例，男性21例，女性19例，平均年齡(43.1±5.1)歲；臨床緩解期30例，男性14例，女性16例，平均年齡(40.5±6.3)歲；健康對照組15例，男性8例，女性7例，平均年齡(30.5±4.6)歲，無呼吸道癥狀及心肺等疾患。性別情況各組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，年齡情況各組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。所有研究對象均為非吸煙者，均獲知情同意并簽署知情同意書。NO測定試劑盒(Bioting-Tech公司)，亞乙烯二胺(sigma 公司)，其余試劑為國產(chǎn)，分析純。

1.2 方法

1.2.1 肺功能測定 所有對象入選時(shí)采用肺活量計(jì)法測定第1秒用力呼氣容積占預(yù)計(jì)值百分比(FEV1.0%百分比)、FEV1.0/FVC及呼氣峰流速(peak expiratory flow，PEF)。

1.2.2 血漿一氧化氮水平測定 血漿NO含量的間接測定，硝酸還原酶測定法。因NO化學(xué)性質(zhì)活潑，半衰期極短，迅速與分子氧反應(yīng)生成NO2-和NO3-，故以血漿NO2-和NO3-之和檢測NO的相對含量，應(yīng)用Bioting-Tech公司提供的NO測定試劑盒，采用硝酸還原酶特異性地將NO3-還原為NO2-，NO2-與顯色劑亞乙烯二胺作用，生成粉紅色偶氮化合物，通過比色測出NO2-/NO3-含量[4]。

1.2.3 誘導(dǎo)痰細(xì)胞計(jì)數(shù)分類 參照文獻(xiàn)[5]報(bào)道的方法進(jìn)行：受試者測試肺功能FEV1.0>FEV1.0pre的60%，可以進(jìn)行痰液誘導(dǎo)，試驗(yàn)前受試者漱口后，吸入沙丁胺醇(萬托林)400 μg，15 min后開始超聲霧化吸入4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的高滲鹽水40 ml，20～40 min后收集痰液，加入等量0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))二硫蘇糖醇(DTT)溶液，振蕩至痰液完全均勻化開，取50 μl痰液注入細(xì)胞池作細(xì)胞計(jì)數(shù)，其余痰液在常溫下3500 r/min離心10 min，取上清液分裝，-80 ℃保存待測。離心沉渣涂片行瑞氏-吉姆薩染色作細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以()表示，兩組之間比較采用t檢驗(yàn)，多組之間比較采用單因素方差分析(F檢驗(yàn))，采用Pearson相關(guān)分析計(jì)算相關(guān)系數(shù)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 正常對照組FEV1.0%預(yù)計(jì)值為(89.7±6.5)，F(xiàn)EV1.0/FVC 值為 (81.7±8.5)，PEF%預(yù)計(jì)值 (95.7±13.5)；哮喘緩解期組FEV1.0%預(yù)計(jì)值為(67.7±5.5)，F(xiàn)EV1.0/FVC值為(65.7±3.5)，PEF%預(yù)計(jì)值(69.8±19.5)；輕度急性發(fā)作期組FEV1.0%預(yù)計(jì)值為 (58.7±7.2)，F(xiàn)EV1.0/FVC 值為 (59.6±7.5)，PEF%預(yù)計(jì)值(57.6±18.5)；中度急性發(fā)作期組FEV1.0%預(yù)計(jì) 值 為 (50.7±4.9)，F(xiàn)EV1.0/FVC 值 為 (52.8±5.3)，PEF%預(yù)計(jì)值(49.8±20.5)；重度急性發(fā)作期組FEV1.0%預(yù)計(jì)值為 (40.7±4.8)，F(xiàn)EV1.0/FVC 值 為 (48.8±7.8)，PEF% 預(yù) 計(jì) 值(40.3±21.6)。各組的FEV1.0%預(yù)計(jì)值、FEV1.0/FVC值及PEF%預(yù)計(jì)值比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為23.132、25.012、21.025，P<0.01)。

2.2 血漿NO比較 健康對照組的血漿NO水平為(43.28±4.06)μmol/L，哮喘臨床緩解組為(56.30±3.07)μmol/L，急性發(fā)作期輕度組為(65.57±2.38)μmol/L，中度組為(71.73±6.08)μmol/L，重度組為(87.36±7.15)μmol/L，各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F=23.5，P<0.101)。

2.3 誘導(dǎo)痰細(xì)胞計(jì)數(shù)分類 誘導(dǎo)痰細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比、巨噬細(xì)胞百分比及嗜酸性粒細(xì)胞百分比在各組之間的比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為8.753、21.856、32.526、19.827，P<0.01)，誘導(dǎo)痰淋巴細(xì)胞百分比在各組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.461，P>0.05)。見表1。

表1 各組誘導(dǎo)痰細(xì)胞總數(shù)及分類計(jì)數(shù)()

表1 各組誘導(dǎo)痰細(xì)胞總數(shù)及分類計(jì)數(shù)()

*與正常對照組相比，P<0.01；#與哮喘緩解期相比，P<0.01

正常對照組(n=15) 3.9±1.7 22.0±1.6 63.2±2.1 0.12±0.12 11.2±1.4哮喘緩解期(n=30) 6.8±2.9* 28.8±5.7*45.5±6.3* 8.9±3.6*13.3±5.3輕度急性發(fā)作期組(n=10)13.5±6.7*#37.8±2.8*#37.8±6.3*#10.3±2.7*13.8±2.9中度急性發(fā)作期組(n=12)16.9±3.6*#42.6±2.3*#30.6±5.7*#11.6±4.1*#12.9±8.6重度急性發(fā)作期組(n=18)20.7±4.1*#46.2±7.4*#25.7±5.7*#13.6±5.4*#13.1±3.7 F值 8.753 21.856 32.526 19.827 0.461 P值 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 >0.05

2.4 相關(guān)性分析 研究對象所處的狀態(tài)(健康、哮喘緩解期及哮喘發(fā)作期)與血漿一氧化氮水平明顯相關(guān)(r=0.786，P<0.01)。急性發(fā)作期患者血漿一氧化氮水平與FEV1.0%預(yù)計(jì)值呈負(fù)相關(guān)(r=-0.872，P<0.01)，與誘導(dǎo)痰細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比及誘導(dǎo)痰嗜酸細(xì)胞百分比呈正相關(guān)(r分別為0.857、0.816和0.825，P<0.01)，與誘導(dǎo)痰巨噬細(xì)胞百分比呈負(fù)相關(guān) (r=-0.820，P<0.01)。

3 討論

支氣管哮喘(簡稱哮喘)的發(fā)作是由于炎性細(xì)胞及某些結(jié)構(gòu)性細(xì)胞釋放的多種細(xì)胞因子和趨化因子組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，主要包括氣道炎癥、免疫與變態(tài)反應(yīng)、氣道神經(jīng)調(diào)節(jié)以及遺傳機(jī)制等，在內(nèi)外因素的作用下，發(fā)生調(diào)控異常，導(dǎo)致炎癥-上皮細(xì)胞-氣道重塑-炎癥加重的惡性循環(huán)，牽涉多種炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子。目前，合適的哮喘標(biāo)志物及氣道炎癥介質(zhì)的測定成為哮喘氣道炎癥研究新的熱點(diǎn)課題。

本研究表明，支氣管哮喘組的血漿一氧化氮水平顯著高于正常對照組，其中急性發(fā)作期組顯著高于緩解期組，急性發(fā)作期組中輕度、中度、重度三者之間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。線性相關(guān)性分析顯示，一氧化氮水平與支氣管哮喘發(fā)作有相關(guān)性。與羅春玲[6]報(bào)道的一致。Ward等[7]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NO供體可明顯抑制乙酰膽堿、組胺、白三烯D4所致的氣道收縮，NOS抑制劑L-NAME可以減弱由于干冷空氣、運(yùn)動所引起的氣道收縮，但不影響乙酰膽堿釋放，提示NO有對抗乙酰膽堿收縮氣道平滑肌的作用，cNOS來源的NO可以松弛氣道平滑肌，對氣道平滑肌調(diào)節(jié)發(fā)揮作用；但哮喘發(fā)作時(shí)，cNOS來源的NO生成減少，氣道非腎上腺素能非膽堿能神經(jīng)功能發(fā)揮不足，而iNOS活性大大增強(qiáng)導(dǎo)致局部NO大量產(chǎn)生，當(dāng)體內(nèi)持續(xù)大量合成NO，在發(fā)揮免疫效應(yīng)的同時(shí)也造成局部組織損傷。NO造成氣道損傷的機(jī)理為，直接損傷氣道組織細(xì)胞的DNA、線粒體及含鐵酶類的活性，在氣道內(nèi)的特殊化學(xué)環(huán)境中和O2-形成過氧化亞硝酸(ONOO-)，與其他氮氧化物相互轉(zhuǎn)變，形成NO2等高毒性物質(zhì)。血漿中大量的NO更多表現(xiàn)為細(xì)胞毒性作用，致毛細(xì)血管后微靜脈滲出增多，加重肺通氣/血流比例失調(diào)及加重支氣管痙攣。

哮喘時(shí)，嗜酸性粒細(xì)胞會顯著的升高已被公認(rèn)，并與哮喘嚴(yán)重程度成正相關(guān)；它主要通過釋放胞質(zhì)中的主要堿基蛋白(MBP)、嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白(ECP)、嗜酸性粒細(xì)胞衍生性神經(jīng)毒素(EDN)等毒性顆粒蛋白損傷靶器官，這些顆粒蛋白是造成哮喘特征性表現(xiàn)的主要原因之一[8]。哮喘氣道炎癥時(shí)，嗜酸性粒細(xì)胞釋放NO的同時(shí)又促進(jìn)嗜酸細(xì)胞的趨化，并抑制其凋亡，提示NO在哮喘嗜酸性粒細(xì)胞炎癥中起著放大作用[9]。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，在重度哮喘患者的氣道組織、支氣管肺泡灌洗液和痰液中中性粒細(xì)胞增多，它主要是其激活后釋放IL-8、氧自由基(O2-)、胰肽酶等介質(zhì)，對肺組織造成損傷，從而在哮喘的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用[10]。NO主要存在中心粒細(xì)胞的胞漿中，當(dāng)中心粒細(xì)胞被激活時(shí)，分泌到細(xì)胞外并隨病情的嚴(yán)重程度而增加[11]，它主要引起肺基底膜的降解、黏液腺過度增生、黏液過度分泌、上皮細(xì)胞損傷等，在哮喘患者大量的黏液栓形成中起著重要作用。另外，NO還能刺激IL-8的產(chǎn)生，促進(jìn)中心粒細(xì)胞的聚集，加重氣道炎癥。

本研究結(jié)果表明，隨著哮喘的嚴(yán)重程度，誘導(dǎo)痰細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞百分比、嗜酸性粒細(xì)胞百分比升高，血漿一氧化氮水平明顯升高，提示NO可能通過上述途徑參與哮喘的慢性氣道炎癥過程，但仍需對此進(jìn)行深入研究。

本研究作為支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制的探究，尚有較多的局限性，認(rèn)為一氧化氮的表達(dá)增高是導(dǎo)致哮喘炎癥改變的形成和進(jìn)展的重要原因之一，將為下一步研究如何增加cNOS的活性和/或選擇性iNOS抑制劑的作用提供依據(jù)，可能為哮喘的治療提供一個(gè)新的突破點(diǎn)。

[1]Ricciardolo F L.Multiple roles of nitric oxide in the airways[J].Thorax，2003，58(2):175-182.

[2]Sapienza M A，Kharitonow S A，Horvath I，et al.Effect of Inhaled L-arginine on Exhaled Nitric Oxide in Normal and Asthmatic Subjects[J].Thorax，1998，53(3):172-175.

[3]中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會哮喘學(xué)組.支氣管哮喘防治指南[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，2008，31(3):177-189.

[4]張清友，杜軍保，石琳，等.內(nèi)源性一氧化氮與硫化氫在大鼠低氧性肺動脈高壓中的相互作用[J].北京大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2004，36(1):53-56.

[5]Gibson P G，Wlodarczyk J W，Hensley M J，et al.Epidemiological association of airway inflammation with asthma symptoms and airway hyper responsiveness in childhood[J].Am J Rasp Crypt Care Med，1998，158(1):36-41.

[6]羅春玲，鄒晨容.哮喘患者血漿一氧化氮變化的臨床意義[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2010，7(29):35-36.

[7]Philip E.ATS Workshop proceedings: exhaled nitric oxide and nitric oride oxidative metabolism in exhaled breath condensate[J].Proc Am Thorac Soc，2006，173(7):131-145.

[8]Park Y J，Oh E J，Park J W，et al.Plasma eosinophil cationic protein，interleukin-5，and ECP/Eo count ratio in patient with various eosinophilic diseases[J].Ann Clin Lab Sci，2006，36(3):262-266.

[9]Lex C，F(xiàn)erreira F，Zacharasiewicz A，et al.Airway eosinophilia in children with severe asthma: predictive values of noninvasive test[J].Am J Respir Crit Care Med，2006，175(12):1286-1290.

[10]林劍.中心粒細(xì)胞在支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制中的作用[J].國外醫(yī)學(xué)兒科學(xué)分冊，2001，28(1):22-24.

[11]Ramesh G，Jindal S K，Ganguly N K，et al.Increased nitric oxide production by neutrophils in bronchial asthma[J].Eur Respir J，2001，17(5):868-871.